Name: 从卡西甲抗性前列腺癌患者的甲酸固定组织和血清衍生的外源体对小型非编码RNA进行测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 了解如何从卡西甲抗性前列腺癌患者的甲酸固定组织和血清外泌体中分离RNA并优化cDNA文库，用于下一代测序以识别新型小非编码RNA生物标志物。该方法有助于深入理解肿瘤进展的分子机制。

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本工作由美国陆军医学研究采购活动（USAMRAA）通过创意发展奖资助，项目编号为 W81XWH-18-1-303 和 W81XWH-18-2-0013，以及前列腺癌生物样本库网络（PCBN）项目编号 W81XWH-18-2-0015、W81XWH-18-2-0016、W81XWH-18-2-0017、W81XWH-18-2-0018 和 W81XWH-18-2-0019。作者实验室还获得了美国国立卫生研究院国家癌症研究所的资助（资助编号 RO1CA177984）。Rajvir Dahiya 是美国退伍军人事务部的高级研究职业科学家（项目编号 BX004473），并获得 NIH-UO1CA199694 项目（RD）资助。本文观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定代表美国国防部或美国陆军的立场。我们感谢旧金山退伍军人事务医疗中心核心设施主任 Judy Shigenaga 在使用 NextSeq 500 测序仪方面提供的帮助。

本研究遵循美国通用规则的伦理准则，并经机构人类研究委员会批准。
1. 显微解剖
注意：具有腺癌特征的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）转移性去势抵抗性前列腺癌组织（CRPC-Adeno）或具有神经内分泌分化特征的组织（CRPC-NE）来自前列腺癌生物样本库网络（Prostate Cancer Biorepository Network, PCBN）。如先前所述18，将载玻片上的10微米前列腺癌组织切片用于手工显微切割。简要总结如下：
<ol>
	<li>将切片浸入二甲苯中脱蜡（2次，每次10分钟）。然后通过将切片依次在梯度乙醇（100%、95%、90%、80%和70%）中各孵育5分钟进行水化，接着用蒸馏水洗涤，并用苏木精染色（浸泡30秒）。</li>
	<li>苏木精染色后，用水洗涤组织切片。然后将切片依次置于梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）中各5分钟进行脱水，最后放入二甲苯中5分钟。</li>
	<li>分析相应的苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色切片，以识别肿瘤区域（即腺癌或神经内分泌分化区域），并在经认证的病理医师协助下标记这些肿瘤区域及邻近的正常组织区域。以这些H&amp;#38;E切片为参考图谱，对标记的苏木精染色组织进行区域划分，以区分肿瘤与正常组织。</li>
	<li>在显微镜下使用手术刀片小心地解剖已标记的组织切片。</li>
	<li>使用带静电的凝胶上样吸头分别收集正常和癌变区域的解剖组织。带电吸头可吸引解剖后的组织，从而在解剖后实现最大程度的组织回收。一旦组织粘附到带电吸头上，将吸头剪下并放入空的2 mL收集管中。</li>
</ol>
2. 分离血清来源的细胞外囊泡
注意：采用经批准的机构审查委员会（IRB）方案，从具有腺癌特征的转移性去势抵抗性前列腺癌（CRPC-adeno）或具有神经内分泌分化特征的患者（CRPC-NE）中获取冷冻患者血清样本，样本由前列腺癌生物样本网络（PCBN）提供，并在使用前于 -80 °C 保存。血清样本来源于与显微切割组织所用患者相同的队列，以便对相应组织与血清来源的细胞外囊泡（EVs）进行比较。采用市售的血清EV分离试剂提取EVs。
<ol>
	<li>在 4 °C 下解冻冷冻的患者血清样本。</li>
	<li>取 110 μL 解冻后的血清样本，以 2,000 x g 离心 30 分钟。</li>
	<li>收集上清液用于后续的细胞外囊泡（EV）/外泌体分离，弃去沉淀中的碎片。向上清液中加入 30 μL 血清外泌体分离试剂，在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>以 10,000 x g 离心 10 分钟。小心收集不含 EV 的血清上清液，避免扰动沉淀，转移至另一支 1.5 mL 离心管中，如需后续分析，可于 -80 °C 保存。</li>
	<li>用无核酸酶水配制的磷酸盐缓冲液（PBS）将 EV 沉淀重悬于 70 μL 体积中。保留一部分样品用于粒子追踪分析系统，以评估颗粒的质量和数量。其余样品储存于 -80 °C，待进一步分析。</li>
</ol>
3. 从显微切割的前列腺组织和细胞外囊泡中分离RNA
注意：采用市售试剂盒（材料表）按照生产商说明书，稍加修改后，从显微切割组织和纯化的细胞外囊泡（EVs）中提取总RNA。以下部分简要描述这些操作步骤，并重点强调关键环节：
<ol>
	<li>从显微切割的组织中分离RNA。
	<ol>
		<li>将显微切割的FFPE组织重悬于150 μL蛋白酶K缓冲液中。涡旋混匀，并用移液器将残余组织从吸头中吹出。在11,000 x g下离心1分钟。</li>
		<li>向沉淀中加入10 μL蛋白酶K。等待2分钟，直至沉淀变为白色。上下吹打数次。</li>
		<li>在56 °C孵育16分钟，每3分钟涡旋一次。</li>
		<li>取出样品，使加热块升温至80 °C。将样品置于加热块上孵育16分钟，每3分钟涡旋一次。</li>
		<li>在冰上孵育3分钟。</li>
		<li>在20,000 x g下离心15分钟。将上清液转移至新的2 mL离心管中。</li>
		<li>加入16 μL DNase增强缓冲液，随后加入10 μL DNase I。轻轻翻转混匀，在室温（RT）孵育15分钟。</li>
		<li>加入320 μL红细胞（RBC）裂解缓冲液，翻转混匀后加入1,120 μL 100%乙醇。立即转移至4 °C保存的离心柱中。在8,000 x g下离心30秒。</li>
		<li>用洗涤缓冲液洗涤离心柱两次，在20,000 x g下离心5分钟，以彻底去除残留的洗涤缓冲液。</li>
		<li>让离心柱在空气中干燥2−3分钟，然后用19 μL无RN酶水洗脱。使用分光光度计测定纯化RNA的浓度，并将样品标准化至40 ng/μL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从血清来源的EV中分离RNA。
	<ol>
		<li>使用试剂盒分离外泌体RNA。向50 μL纯化的EV悬液中加入75 μL裂解缓冲液A和9.3 μL裂解缓冲液B。 
		注意：通过翻转混匀样品约10分钟，确保EV完全裂解。</li>
		<li>加入130 μL 100%乙醇，立即通过翻转混匀样品。转移至离心柱中，然后在3,300 x g下离心1分钟。</li>
		<li>用洗涤缓冲液洗涤离心柱两次，在1,300 x g下离心3分钟，彻底去除洗涤缓冲液。</li>
		<li>让离心柱在空气中干燥2分钟。向柱中加入18 μL洗脱缓冲液，静置2分钟。先在400 x g下离心1分钟，再在5,800 x g下离心3分钟。</li>
		<li>使用试剂盒中提供的洗脱缓冲液重复步骤3.2.4，以提高样品中RNA的得率。</li>
		<li>使用分光光度计测定样品浓度，并将其标准化至40 ng/μL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 小RNA测序文库构建
注意： 使用小RNA文库制备试剂盒（材料表）从分离的RNA样本中构建cDNA文库。在上机测序前，文库的构建、纯化及质量检测步骤对于任何测序流程都至关重要，因为这些步骤最终决定了测序结果数据的质量。因此，每一步操作都需谨慎进行。制造商的指南建议至少使用50 ng的RNA。鉴于通常从这两种样本来源获得的总RNA质量和数量较低，本方案已优化至适用于低至100 ng的RNA浓度。以下方案适用于一个文库样本。
<ol>
	<li>生成接头连接的cDNA。
	<ol>
		<li>使用5 μL经标准化处理的RNA样本（40 ng/μL）。加入1 μL 3'接头。在孵育样本前，将热循环仪预热至70 °C。孵育2分钟。立即转移至冰上，再进行下一步操作。</li>
		<li>在另一管中，混合2 μL连接缓冲液、1 μL RNase抑制剂和1 μL T4 RNA连接酶2（缺失突变体）。通过移液器反复吹打混匀，并将4 μL该混合液加入含RNA/3'接头的管中。</li>
		<li>转移至已预热至28 °C的热循环仪中，孵育1小时。</li>
		<li>在保持样本处于热模块上的同时，加入1 μL终止溶液。在28 °C下继续孵育15分钟。</li>
		<li>完成此步骤后，立即取出管子并置于冰上。</li>
		<li>在另一管中，加入1 μL 5'接头。</li>
		<li>转移至已预热至70 °C的热循环仪中，孵育2分钟。</li>
		<li>立即置于冰上，以防止接头重新退火。</li>
		<li>向变性的5'接头管中加入1 μL 10 mM ATP。通过移液吹打混匀，再加入1 μL T4 RNA连接酶。再次吹打混匀后，取3 μL该混合液加入含3'接头连接RNA的管中。转移至已预热至28 °C的热循环仪中，孵育1小时。</li>
		<li>立即转移至冰上，可继续后续操作，或于-20 °C保存以备后续使用。</li>
		<li>进行RT-PCR时，取6 μL各接头连接的RNA，加入1 μL RNA反转录引物。转移至已预热至70 °C的热循环仪中，孵育2分钟。</li>
		<li>在另一管中，混合2 μL 5x链合成缓冲液、0.5 μL 12.5 mM dNTPs、1 μL 100 mM DTT、1 μL RNase抑制剂和1 μL反转录酶。将5.5 μL该混合液加入接头连接的RNA中，转移至已预热至50 °C的热循环仪中，孵育1小时。</li>
		<li>立即将接头连接的cDNA转移至冰上。</li>
		<li>在另一管中，混合25 μL PCR混合液、2 μL RNA PCR引物、2 μL RNA PCR引物索引和8.5 μL无RNase水。将37.5 μL该混合液加入12.5 μL接头连接的cDNA中。转移至已预热至98 °C的热循环仪中。按照制造商说明书建议设置热循环程序，但将循环数调整为15，而非11。 
		注意： 所用引物的序列列于材料表中。</li>
		<li>反应完成后将样本置于4 °C保存。可立即进行后续操作，或于-80 °C保存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对接头连接的cDNA进行纯化并进行质量控制。 
	注意： 扩增后的cDNA按照制造商说明书进行凝胶纯化，但进行了若干修改以提高纯化cDNA样本的质量和得率，如下所述。
	<ol>
		<li>使用6% TBE聚丙烯酰胺凝胶纯化扩增的cDNA。将高分辨率ladder（HRL）和定制RNA ladder（CRL）用等体积的DNA上样染料稀释。</li>
		<li>向每个cDNA样本中加入10 μL DNA上样染料。将每个样本的30 μL分别上样至两个相邻泳道，CRL和HRL置于两个不同样本之间的中间区域。</li>
		<li>在1x TBE缓冲液中以145 V电泳约30−40分钟。 
		注意： 注意观察上样染料的蓝色前沿。当其接近凝胶底部时，停止电泳。</li>
		<li>将凝胶转移至含溴化乙锭（EtBr）的1x TBE缓冲液中（0.5 µg EtBr/1 mL 1x TBE）。 
		注意： EtBr为已知致癌物，从此时起至从凝胶中切胶的每一步操作均需格外谨慎。</li>
		<li>在凝胶成像仪中观察凝胶，并在145 bp与160 bp标记之间精确切胶。 
		注意： 接头二聚体的迁移位置非常接近145 bp标记。因此，切胶位置应略高于145 bp标记，以避免接头二聚体污染。</li>
		<li>将凝胶转移至置于2 mL收集管中的DNA破碎管中。在20,000 x g下离心2分钟。加入300 μL无RNase水，在室温下轻轻旋转摇床过夜。</li>
		<li>进行DNA沉淀：次日，将管中内容物转移至5 μm滤膜管中。在600 x g下离心10秒。 
		注意： 离心时间不得超过10秒，以免凝胶穿过滤膜。</li>
		<li>向洗脱的DNA中加入2 μL糖原、30 μL 3 M NaOAc、2 μL 0.1x pellet paint和975 μL 100%乙醇。在4°C下以17,000 x g离心20分钟。</li>
		<li>弃去上清液，加入75%乙醇洗涤沉淀。在4 °C下以17,000 x g离心5分钟。弃去上清液，将管子在37 °C孵育，使乙醇完全挥发。</li>
		<li>用12 μL 10 mM Tris-HCl（pH 8.5）重悬沉淀。</li>
		<li>通过将纯化的cDNA稀释10倍（1:10），取1 μL稀释后的cDNA在生物分析仪上进行文库质量检测。</li>
		<li>确保cDNA产物大小在电泳图谱中对应小RNA范围（136−160 bp）。计算每个样本的总摩尔浓度。使用Tris-HCl（pH 8.5）将各样本归一化至2 nM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>变性并测序纯化的cDNA。
	<ol>
		<li>将文库混合：取等体积的各2 nM样本，加入同一支200 μL PCR管中。向10 μL混合文库中加入10 μL新鲜配制的0.2 N NaOH。</li>
		<li>立即涡旋混匀，并在280 x g下离心1分钟。室温孵育5分钟。</li>
		<li>向20 μL变性文库中加入10 μL 200 mM Tris-HCl（pH 7）。涡旋混匀后，在280 x g下离心1分钟。</li>
		<li>向文库中加入970 μL预冷的杂交缓冲液，充分涡旋混匀。此时文库浓度为20 pM。保持在冰上，直至最终稀释。 
		注意： 最终稀释在上机测序前立即进行。</li>
		<li>将117 μL变性文库加入1,183 μL预冷的杂交缓冲液中。通过倒置混匀并瞬时离心。此时文库的最终浓度为1.8 pM。</li>
		<li>向1.3 mL最终文库中加入1.3 μL PhiX。启动测序仪运行时，按照软件界面上的提示步骤操作，检查运行参数，包括读取类型（单端测序）、读长（每次读取的循环数）、文库ID，并选择开始。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>测序运行结束后，以 fastQ 文件形式获取测序结果数据。使用适当的软件分析所得的测序数据。</li>
	<li>打开 fastQ 工具包应用程序，点击 Launch 按钮。</li>
	<li>在软件的样本列表中选择文件，并指定数据保存位置。</li>
	<li>为每个修剪后的序列添加一个字符串名称。将严谨性参数保持为 0.9。在每个测序样本的 3' 端输入待修剪的接头序列为 "TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG"。展开 Read Filtering 选项卡，选择最小读长为 "5"。勾选 Acknowledge 复选框，然后点击 Continue 按钮以开始修剪。分析结束后，修剪后的文件将保存在项目文件夹中。</li>
	<li>在软件中打开 small RNA v.1.0 应用程序，并点击 Launch 按钮。</li>
	<li>选择文件在分析后将被保存并发送至的项目。</li>
	<li>在应用程序中选择 Novel miRs and Differential miRs 功能。将组别划分为 "Control" 和 "Test" 以进行差异分析，并将修剪后的文件分别添加到对应的组中进行分析。</li>
	<li>点击 Launch 按钮以启动分析。分析完成后，下载生成的文件。</li>
</ol>

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<li>Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+in+the+clinic%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges.</a> Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种使用经过优化的试剂盒从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织和血清来源的细胞外囊泡（EVs）中分离RNA的实验方案，该方案可提高所分离RNA的得率和质量。随后，利用纯化的RNA构建了用于小RNA测序的cDNA文库。上述两个步骤对于最终测序结果的质量和测序深度至关重要24。因此，优化这些关键步骤是实现成功测序运行的前提。
从FFPE样本中分离RNA的一个重要步骤是使用蛋白酶K进行消化，以去除组织中交联的甲醛。该步骤通过将样本分别在55 °C和80 °C孵育约16−18分钟进行了优化，从而有效提高了所分离RNA的质量，表现为260/280比值的升高。在包含多个样本的测序运行中，测序读长常常存在差异。因此，在文库构建起始阶段控制RNA的投入量有助于实现文库的一致性。使用标准化的RNA有助于使不同样本之间的测序运行达到均一化。文库构建中最关键的步骤是纯化经扩增并连接接头的cDNA。必须仔细切取位于140 bp标记条带以上的凝胶部分，因为若切胶位置稍偏低，便会引入接头二聚体污染。最后，对cDNA文库进行标准化是测序流程中最重要的步骤...

前列腺癌由雄激素通过AR信号通路驱动，因此靶向AR通路是该疾病的主要治疗手段1。然而，由于靶向治疗常导致耐药性的产生，疾病会进展为晚期转移性去势抵抗性前列腺癌（CRPC）2。CRPC通常采用第二代AR治疗药物（如恩杂鲁胺和阿比特龙）进行治疗2,3，初期可改善生存率。然而，在约25−30%的经治CRPC病例中，常出现致死性变异类型，如神经内分泌前列腺癌（NEPC），其治疗选择有限，导致死亡率上升3。NEPC通过一种称为神经内分泌分化的可逆性转分化过程（NED）产生，此过程中前列腺癌细胞发生谱系转变，从腺癌表型转变为神经内分泌表型，表现为AR表达降低，同时神经内分泌谱系标志物（如烯醇化酶2（ENO2）、嗜铬粒蛋白A（CHGA）和突触素（SYP））表达升高4。鉴于这些耐药变异是由治疗干预所诱导产生的，解析导致这种致命且难治型前列腺癌形成的分子通路至关重要。
Beltran 等人最近通过一项详尽的研究解析了神经内分泌前列腺癌（NEPC）的基因组特征，该研究分析了来自患者转移组织的拷贝数变异、突变、单核苷酸多态性（SNPs）以及DNA甲基化状态5。尽管在理解这种侵袭性前列腺癌（PCa）的基因组学方面已取得显著进展，但关于表观遗传因素（包括参与CRPC-腺癌向NEPC转化过程的小非编码RNA（microRNA, miRNA））的研究仍十分有限。microRNA（miRNA）是长约22 bp的双链RNA分子，主要通过与靶标mRNA的3'-非翻译区（UTRs）进行序列特异性结合，从而在转录后水平抑制基因表达6。目前已有多个致癌性miRNA（oncomiR）和肿瘤抑制性miRNA被鉴定出来，其在调控多种癌症疾病起始和转移过程中的作用已被广泛研究6,7。这些小非编码RNA常作为控制疾病死亡率的重要靶点6,8,9。近年来的研究重点逐渐转向理解miRNA通过细胞外囊泡（EVs，如外泌体）在血液中运输所介导的旁分泌效应，从而在无核酸酶环境中将这些二级信使传递至转移部位，促进癌症转移10,11,12。EVs可将miRNA从肿瘤细胞携带至受体细胞，传递其转化效应12。因此，将EVs识别为肿瘤细胞的二级信使，可能有助于无创性地检测疾病的严重程度。
miR-1246 在侵袭性前列腺癌（PCa）的细胞外囊泡（EVs）中显著上调，并提示疾病严重程度13。这些与EV相关的miRNA不仅可作为疾病的无创生物标志物，还在促进肿瘤发生中发挥重要的功能作用。因此，了解与耐药型前列腺癌相关的miRNA谱系的意义，对于更好地识别无创生物标志物及其功能重要性至关重要。
下一代测序技术的出现为全面研究肿瘤图谱提供了最有力的平台，能够深入分析基因组水平的多种改变，如基因突变、染色体重排、染色体碎裂（chromothripsis）以及甲基化修饰，这些改变均显著影响癌症的形态与性质14,15,16。同样，该技术也是理解肿瘤细胞中广泛发生的表观基因组变化的关键工具，而这些变化常常在疾病严重程度中发挥重要作用17。为了揭示与神经内分泌前列腺癌（NEPC）发生相关的miRNA谱，本研究对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的转移性去势抵抗性前列腺癌（CRPC）组织及其相应的血清来源的细胞外囊泡（EVs）进行了小RNA测序。然而，来源于这两种样本的RNA通常（1）得率较低，且（2）质量较差，主要由于甲醛固定和EV分离过程导致的RNA降解。此外，构建cDNA文库是测序过程中的关键步骤，但操作繁琐。因此，针对此类RNA的提取及其用于小RNA测序文库构建的方法亟需优化，以获得准确且可靠的测序数据。
在不同样本中分析miRNA表达水平的方法有多种，包括RT-PCR、微阵列（microarrays）和原位杂交（ISH）。最近已发表一项利用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织提取的RNA，通过RT-PCR和ISH检测miRNA表达的实验方案18。更新的技术提供了更全面、更系统的miRNA表达谱分析平台。NanoString nCounter技术提供了一种高灵敏度的miRNA检测平台19，但其检测范围通常受限于芯片中可检测的miRNA数量（约2,000种）。在此情况下，新一代测序等更为灵敏且全面的技术可实现更深度的miRNA鉴定，并同时对不同样本进行表达谱分析20。该方法已被用于确定前列腺癌（PCa）患者尿液或血浆中的miRNA表达特征21,22,23。本文提供了一项实验方案，旨在利用新一代测序平台，结合FFPE组织和血清来源的细胞外囊泡（EV）RNA，研究与侵袭性去势抵抗性前列腺癌（CRPC）相关的miRNA表达谱。

<table><tbody><tr><td>3 M NaOAc pH 5.5</td><td>USB Corp.</td><td>75897 100 mL</td><td></td></tr><tr><td>5 &amp;micro;m 滤膜管</td><td>IST Engineering Inc.</td><td>5388-50</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE 聚丙烯酰胺凝胶</td><td>Novex</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>BaseSpace</td><td>Illumina</td><td></td><td>分析软件</td></tr><tr><td>生物分析仪</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 上样染料</td><td>Novex</td><td>LC6678</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 恒温仪 plus</td><td>Eppendorf 1.5 mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtBr</td><td>Pierce</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>外泌体 RNA 提取试剂盒</td><td>Norgen</td><td>58000</td><td></td></tr><tr><td>凝胶破碎管</td><td>IST Engineering Inc.</td><td>3388-100</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级糖原</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>苏木精 Select</td><td>Stat lab</td><td>SL401</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td>accuSpin Micro 17R</td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano Drop 1000</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA</td><td>Malvern</td><td>LM14</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500 测序仪</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 中等输出试剂盒 v2（150 个循环）</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2001</td><td></td></tr><tr><td>沉淀染色剂</td><td>Millipore</td><td>70748-3</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶 2 缺失突变体</td><td>Lucigen</td><td>LR2D11310K</td><td></td></tr><tr><td>TBE 电泳缓冲液（5×）</td><td>Novex</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>PCR 扩增仪</td><td>MJ Research</td><td>PTC100</td><td></td></tr><tr><td>总外泌体分离试剂（来自血清）</td><td>Invitrogen</td><td>4478360</td><td></td></tr><tr><td>TrueSeq 小 RNA 文库构建试剂盒-套装 A（索引 1-12）</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P- 1GAL</td><td></td></tr><tr><td>RNA 3' 引物</td><td></td><td></td><td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td></tr><tr><td>RNA 5' 引物</td><td></td><td></td><td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td></tr><tr><td>终止寡核苷酸</td><td></td><td></td><td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td></tr><tr><td>RNA RT 引物</td><td></td><td></td><td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td></tr><tr><td>RNA PCR 引物</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 个碱基]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td></tr><tr><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>接头中的 6 个碱基</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 1</td><td></td><td></td><td>CGTGAT</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 2</td><td></td><td></td><td>ACATCG</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 3</td><td></td><td></td><td>GCCTAA</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 4</td><td></td><td></td><td>TGGTCA</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 5</td><td></td><td></td><td>CACTGT</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 6</td><td></td><td></td><td>ATTGGC</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 7</td><td></td><td></td><td>GATCTG</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 8</td><td></td><td></td><td>TCAAGT</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 9</td><td></td><td></td><td>CTGATC</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 10</td><td></td><td></td><td>AAGCTA</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 11</td><td></td><td></td><td>GTAGCC</td></tr><tr><td>RNA PCR 索引引物 12</td><td></td><td></td><td>TACAAG</td></tr></tbody></table>

从去势抵抗性前列腺癌患者的福尔马林固定组织及血清来源外泌体中测序小非编码rna

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

通过剥夺雄激素来抑制雄激素受体（AR）信号通路是前列腺癌一线治疗的目标，该疗法最初可导致肿瘤消退。然而，在相当一部分病例中，疾病会进展为晚期去势抵抗性前列腺癌（CRPC），后者治疗选择有限且常具有侵袭性。在此侵袭性疾病阶段，通常可观察到远处转移。CRPC采用第二代AR通路抑制剂治疗，虽可初期改善生存，但随后会出现治疗耐药。神经内分泌型前列腺癌（NEPC）是一种罕见的前列腺癌（PCa）亚型，常因治疗耐药后发生称为神经内分泌分化（NED）的转分化过程而产生，此时PCa细胞发生谱系转变，由腺癌转为表达增强的神经内分泌（NE）谱系标志物。除驱动NEPC进展和转分化的基因组改变外，表观遗传因素和微环境信号也被认为在促进疾病进展中发挥关键作用。本文提供了一项详细方案，用于鉴定与晚期PCa相关的表观遗传驱动因子（即小非编码RNA）。该方案利用来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）转移组织及其相应血清来源的细胞外囊泡（EVs）中纯化的microRNA，描述了如何制备适用于测序的、具有适当质量控制的microRNA文库。由于RNA大多已降解或含量极低，从FFPE样本和EVs中分离RNA通常具有挑战性。本方案将详细阐述多种优化RNA起始量和cDNA文库的方法，以在测序后获得尽可能多的特异性读段和高质量数据。

在RNA提取后并进行质量检测，制备文库。从显微切割组织和血清来源的细胞外囊泡（EVs）提取的RNA制备的扩增cDNA文库的凝胶纯化结果如图1和图2所示。每个样本中接头连接的miRNA产物大小约为136−160 bp。图1A-B中标注了为小RNA文库制备需精确切取的凝胶区域。图2A-B展示了显微切割组织和血清来源EVs的凝胶电泳图及电泳图谱。补充图1展示了电泳仪的代表性结果以及摩尔浓度的计算方法。
在上机测序前获取文库数据指标的步骤已完成。图3展示了小RNA测序运行的代表性指标，包括预期的簇密度、质控分数、通过滤筛的簇百分比，以及预估产量和错误率。...

晚期前列腺癌患者常出现治疗耐药，部分病例中癌症会进展为一种称为神经内分泌型前列腺癌的致死性亚型。研究介导这一转变过程的小分子非编码RNA相关的分子改变，有助于更精确地进行疾病分型，并识别导致神经内分泌型前列腺癌发生的因果机制。

从去势抵抗性前列腺癌患者的福尔马林固定组织及血清来源外泌体中测序小非编码RNA

通过剥夺雄激素来抑制雄激素受体（AR）信号通路是前列腺癌初始治疗的首要目标，该疗法最初可产生……

通过使用本方案，研究人员可以鉴定基于外显子组、细胞外囊泡以及组织的新型微细胞，用于研究晚期前列腺癌。从F-F-B组织和细胞外囊泡中分离RNA通常具有挑战性，因为大部分RNA要么已降解，要么含量极为有限。本文将详细阐述多种优化RNA输入量及cDNA文库构建的方法，以获得高度特异、高质量的游离核酸数据，用于下一代测序。下一代测序为理解肿瘤中驱动肿瘤进展的分子改变提供了最全面的平台。本方案已针对前列腺癌临床样本进行了优化，可为深入理解晚期侵袭性前列腺癌的潜在生物学机制提供新的见解。从少量起始材料中优化cDNA文库是成功测序运行的关键步骤，因此生成高质量的cDNA文库以获得准确结果至关重要。在完成如前所述的组织显微切割后，继续分离血清来源的E-Vs。将患者血清样本在4°C条件下解冻。取110 µL解冻后的血清样本转移至离心管中，在2,000 × g条件下离心30分钟。将上清液用于后续的E-V或外泌体分离，并弃去沉淀中的碎片。向每30 µL血清中加入外泌体分离试剂至终体积，然后在4 °C孵育30分钟。在10,000 × g下离心10分钟。在另一个1.5毫升离心管中，小心吸取上清液（E-V supernatant），避免扰动沉淀，并于-80°C保存以备后续分析。随后，将E-V沉淀重悬于70 µL用无核酸酶水配制的PBS中。从显微切割组织中分离总RNA，并使用商业试剂盒纯化EV后，将40纳克/微升的标准化RNA样本5微升，加入1微升3'接头，进行文库制备。将PCR仪预热至70摄氏度，将样本孵育2分钟，随后立即将样本置于冰上。在另一个离心管中，加入 2 µL 连接缓冲液、1 µL RNase 抑制剂和 1 µL T4 RNA 连接酶 2（缺失突变体），通过反复吹打混匀。然后将 4 µL 该混合液加入含有 R-N-A 3' 接头并置于冰上的离心管中。将PCR仪预热至28摄氏度。将试管放入PCR仪中孵育一小时。孵育结束后，保持样品在PCR仪中的同时，向试管中加入1 µL终止液。在28摄氏度下继续孵育15分钟。随后立即取出离心管并置于冰上。在另一离心管中加入1 µL 5'接头引物。转移至已预热至 70 摄氏度的热循环仪中，孵育 2 分钟。立即将离心管置于冰上，以防止接头序列重新退火。向变性5'接头的离心管中加入1 µL 10 mM ATP。用移液器吹打混匀，然后向混合物中加入1 µL T4 RNA连接酶。再次用移液器吹打混匀。取三微升该混合液转移至含有3'端接头连接的RNA的离心管中。将离心管置于预热至28摄氏度的PCR仪中，孵育一小时。随后立即转移至冰上，可继续后续样品操作，或于-80摄氏度保存以备后续使用。进行逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）时，取六微升经接头连接的R-N-A样本，加入一微升R-N-A逆转录引物。将离心管转移至预热至70摄氏度的热循环仪中，孵育两分钟，随后将离心管置于冰上。在另一个离心管中，加入2 µL 5X链缓冲液、5 µL 12.5 mM dNTPs、1 µL 100 mM DTT、1 µL RNA抑制剂以及1 µL逆转录酶，混匀。取5 µL该混合液加入已连接接头的RNA样本中，混匀后立即转移至预热至50°C的PCR仪中，孵育1小时。孵育1小时后，立即将已连接接头的互补DNA（cDNA）置于冰上冷却。在另一个离心管中，加入25 µL PCR混合液、2 µL RNA PCR引物、2 µL RNA PCR引物索引（index）以及8.5 µL无RNA酶水。取37.5 µL该混合液加入到12.5 µL接头连接的cDNA中。将离心管转移至已预热至98 °C的PCR仪中。按照制造商方案建议的程序设置热循环仪，将循环次数修改为15次。反应完成后，将样品置于4摄氏度保存。可立即进行后续操作，或于-80摄氏度保存以备后续使用。为了纯化连接后的互补DNA，向每个互补DNA样本中加入十微升DNA上样染料。同时，向十微升高分辨率Latter和定制RNA Latter中加入上样染料。将每个样本取30微升，分别上样于6% TBE聚丙烯酰胺凝胶中相邻的两个独立泳道中进行电泳。使用定制的RNA胶和高分辨率胶，将两种不同样品之间的中间区域上样。在1× TBE缓冲液中以145伏电压电泳约30至40分钟。注意观察上样染料的蓝色前沿迁移位置。当电泳接近凝胶底部时停止电泳。将凝胶转移至含有5微克/毫升溴化乙锭的1×TBE缓冲液中。在凝胶成像仪中观察凝胶条带，精确地在145 bp与160 bp标记物之间以及略高于145 bp标记物的位置切下凝胶，以避免受到接头二聚体污染。一个关键步骤是纯化已连接的cDNA，这一步需精确切胶，因为接头二聚体与目标条带的迁移位置非常接近。将凝胶片段转移至置于2 mL收集管中的DNA破碎管中。以20,000 × g离心2分钟。 加入300 µL无RNase的水，并在室温下轻轻旋转过夜。次日进行DNA沉淀时，将管中的内容物转移至5 µm滤管中。以600 ×g离心，严格离心10秒。然后向洗脱的DNA中加入2 µL糖原、30 µL 3 M醋酸钠、1X Pellet Paint及975 µL 100%乙醇。在4°C、17,000 ×g条件下离心20分钟。弃去上清液，加入75%乙醇洗涤沉淀。在4°C、17,000 ×g 条件下离心5分钟后，弃去上清液，将离心管置于37°C的加热块上孵育，彻底蒸发乙醇。用12 µL pH 8.5的10 mmol/L三羟甲基氯化物重悬沉淀。接下来，将纯化的互补DNA（cDNA）稀释10倍，取1 µL稀释后的cDNA上样至生物分析仪，进行文库质量检测。确保互补DNA产物的大小在电泳图谱中对应于136至160个碱基对之间的小RNA范围。计算每个样本的总摩尔浓度。使用pH 8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐将每个样本归一化至2纳摩尔。将每个两纳米浓度的样品取等体积混合于一个200微升的PCR管中来制备文库。按照文中所述步骤进行变性与测序。本研究中，文库在RNA提取后制备，并进行了质量检测。连接接头后的微小RNA产物大小在每个样本中约为136至160个碱基对。高亮区域显示了为小RNA文库制备而精确切下的凝胶范围。该图展示了纯化的互补DNA文库的凝胶电泳图及电泳图谱。微量切割的FFPE组织和血清来源的EV。小RNA测序运行的代表性指标显示了微量切割FFPE组织和血清来源EV的预期簇密度、Q值、通过过滤簇百分比，以及估计产量和错误率。两个样本的Q值均高于30，表明碱基识别准确率达到99.9%。且错误率均低于一。文库构建的每一步都应仔细操作，每次孵育后应立即将离心管转移至冰上。该实验方案中的一个关键步骤是精确切胶，以确保获得无接头二聚体且纯净的cDNA文库。构建cDNA文库需要针对高质量测序运行进行优化。理解本方案将帮助读者将这些细微之处外推至其他来源于有限样本（如血清和细胞外囊泡）的测序文库制备过程。该技术已帮助我们鉴定了与转移性前列腺癌患者肿瘤侵袭性及治疗耐药相关的新微小RNA。这些技术可推广至其他疾病类型，有助于新型生物标志物的发现。由于该技术使用了骨骼肌来源的血清和组织样本等生物材料，应采取适当的防护措施。此外，溴化乙锭是一种已知的致癌物，在使用本方案时应格外小心地操作。

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癌症研究

从卡西甲抗性前列腺癌患者的甲酸固定组织和血清衍生的外源体对小型非编码RNA进行测序

定量实时聚合酶链式反应（qPCR）是一种快速且灵敏的方法，用于检测肿瘤样本中多种微小RNA（miRNA）分子的表达水平。利用该方法，可从同一cDNA模板扩增、定量并分析数百种不同miRNA分子的表达。...

通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测前列腺肿瘤中的微小RNA

人类内源性逆转录病毒（HERV）占据了人类基因组的8%，虽然其编码能力极为有限，但却含有约十万个长末端重复序列（LTRs）。为此，研究人员设计了一种定制的Affymetrix微阵列，用于鉴定单个HERV位点的表达情况，并以前列腺癌组织作为概念验证，为未来的临床研究奠定基础。...

基于微阵列的单个内源性逆转录病毒位点表达鉴定：在前列腺癌生物标志物发现中的应用

本方案描述了一种从人血清中提取小RNA的方法。我们已采用该方法从癌症患者血清中分离microRNA，用于DNA芯片和单重定量PCR分析。本方案使用苯酚和硫氰酸胍试剂，并进行了改良，以获得高质量的RNA。...

人血清中分离小非编码RNA

本文介绍一种简化的微小RNA（miRNA）表达分析方案，适用于存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌（PCa）临床组织样本，采用定量实时聚合酶链式反应（RT-PCR）进行检测。 原位...

前列腺癌临床组织中的miRNA表达分析

本实验方案的目的是利用激光捕获显微切割技术，从异质性前列腺组织中有效分离出特定细胞类型的纯群体，用于后续的RNA分析。...

激光捕获显微切割人前列腺上皮组织用于RNA分析

本方案描述了利用商业化的外泌体分离试剂盒，结合蛋白酶K和RNase处理，从非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中释放的外泌体进行miRNA谱分析的可行性，以避免游离miRNA的污染，并评估其在NSCLC中的生物标志物特征。...

非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中外泌体miRNA的qPCR分析：一种可行的液体活检工具

这种改进的提取方案可从组织病理学组织块中更精确靶向的目标区域提高RNA和DNA的得率。...

用于RNA和DNA提取的福尔马林固定石蜡包埋组织芯的制备

本文描述了采用实时PCR方法对血清或血浆DNA进行拷贝数变异分析的过程。该方法适用于预测去势抵抗性前列腺癌患者的药物耐药性，但也可为其他疾病提供有价值的信息。...

使用实时 PCR 检测血清和血浆中的拷贝数

福尔马林固定石蜡包埋的标本是人类疾病分子生物标志物的重要来源。本文介绍一种基于实验室的cDNA文库构建方案，该方案最初针对新鲜冷冻RNA设计，并已优化用于分析储存时间长达35年的组织中存档的微小RNA（microRNA）。...

回顾性 microRNA 测序：使用福尔马林固定石蜡包埋 RNA 标本的互补 DNA 文库制备方案

本方案展示了如何从细胞培养基中纯化细胞外microRNA，用于小RNA文库构建及下一代测序。文中描述了多种质量控制检查点，帮助读者了解在处理低丰度样本（如exRNA）时的预期结果。...

分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小RNA

本方法介绍了如何提高从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中获得的测序数据的质量和数量。我们描述了更准确评估FFPE-RNA样本质量的方法、测序文库的制备步骤，以及对FFPE-RNA样本数据进行分析的流程。...

降解FFPE-RNA样本测序及分析的优化

了解如何从卡西甲抗性前列腺癌患者的甲酸固定组织和血清外泌体中分离RNA并优化cDNA文库，用于下一代测序以识别新型小非编码RNA生物标志物。该方法有助于深入理解肿瘤进展的分子机制。

从去势抵抗性前列腺癌患者的福尔马林固定组织及血清来源外泌体中测序小非编码RNA

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