从去势抵抗性前列腺癌患者的福尔马林固定组织及血清来源外泌体中测序小非编码RNA

通过使用本方案，研究人员可以鉴定基于外显子组、细胞外囊泡以及组织的新型微细胞，用于研究晚期前列腺癌。从F-F-B组织和细胞外囊泡中分离RNA通常具有挑战性，因为大部分RNA要么已降解，要么含量极为有限。本文将详细阐述多种优化RNA输入量及cDNA文库构建的方法，以获得高度特异、高质量的游离核酸数据，用于下一代测序。下一代测序为理解肿瘤中驱动肿瘤进展的分子改变提供了最全面的平台。本方案已针对前列腺癌临床样本进行了优化，可为深入理解晚期侵袭性前列腺癌的潜在生物学机制提供新的见解。

从少量起始材料中优化cDNA文库是成功测序运行的关键步骤，因此生成高质量的cDNA文库以获得准确结果至关重要。在完成如前所述的组织显微切割后，继续分离血清来源的E-Vs。将患者血清样本在4°C条件下解冻。取110 µL解冻后的血清样本转移至离心管中，在2,000 × g条件下离心30分钟。

将上清液用于后续的E-V或外泌体分离，并弃去沉淀中的碎片。向每30 µL血清中加入外泌体分离试剂至终体积，然后在4 °C孵育30分钟。

在10,000 × g下离心10分钟。在另一个1.5毫升离心管中，小心吸取上清液（E-V supernatant），避免扰动沉淀，并于-80°C保存以备后续分析。随后，将E-V沉淀重悬于70 µL用无核酸酶水配制的PBS中。

从显微切割组织中分离总RNA，并使用商业试剂盒纯化EV后，将40纳克/微升的标准化RNA样本5微升，加入1微升3'接头，进行文库制备。将PCR仪预热至70摄氏度，将样本孵育2分钟，随后立即将样本置于冰上。

在另一个离心管中，加入 2 µL 连接缓冲液、1 µL RNase 抑制剂和 1 µL T4 RNA 连接酶 2（缺失突变体），通过反复吹打混匀。然后将 4 µL 该混合液加入含有 R-N-A 3' 接头并置于冰上的离心管中。

将PCR仪预热至28摄氏度。将试管放入PCR仪中孵育一小时。孵育结束后，保持样品在PCR仪中的同时，向试管中加入1 µL终止液。

在28摄氏度下继续孵育15分钟。随后立即取出离心管并置于冰上。在另一离心管中加入1 µL 5'接头引物。

转移至已预热至 70 摄氏度的热循环仪中，孵育 2 分钟。立即将离心管置于冰上，以防止接头序列重新退火。

向变性5'接头的离心管中加入1 µL 10 mM ATP。用移液器吹打混匀，然后向混合物中加入1 µL T4 RNA连接酶。再次用移液器吹打混匀。

取三微升该混合液转移至含有3'端接头连接的RNA的离心管中。将离心管置于预热至28摄氏度的PCR仪中，孵育一小时。随后立即转移至冰上，可继续后续样品操作，或于-80摄氏度保存以备后续使用。

进行逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）时，取六微升经接头连接的R-N-A样本，加入一微升R-N-A逆转录引物。将离心管转移至预热至70摄氏度的热循环仪中，孵育两分钟，随后将离心管置于冰上。

在另一个离心管中，加入2 µL 5X链缓冲液、5 µL 12.5 mM dNTPs、1 µL 100 mM DTT、1 µL RNA抑制剂以及1 µL逆转录酶，混匀。取5 µL该混合液加入已连接接头的RNA样本中，混匀后立即转移至预热至50°C的PCR仪中，孵育1小时。孵育1小时后，立即将已连接接头的互补DNA（cDNA）置于冰上冷却。

在另一个离心管中，加入25 µL PCR混合液、2 µL RNA PCR引物、2 µL RNA PCR引物索引（index）以及8.5 µL无RNA酶水。取37.5 µL该混合液加入到12.5 µL接头连接的cDNA中。将离心管转移至已预热至98 °C的PCR仪中。

按照制造商方案建议的程序设置热循环仪，将循环次数修改为15次。反应完成后，将样品置于4摄氏度保存。可立即进行后续操作，或于-80摄氏度保存以备后续使用。

为了纯化连接后的互补DNA，向每个互补DNA样本中加入十微升DNA上样染料。同时，向十微升高分辨率Latter和定制RNA Latter中加入上样染料。将每个样本取30微升，分别上样于6% TBE聚丙烯酰胺凝胶中相邻的两个独立泳道中进行电泳。

使用定制的RNA胶和高分辨率胶，将两种不同样品之间的中间区域上样。在1× TBE缓冲液中以145伏电压电泳约30至40分钟。注意观察上样染料的蓝色前沿迁移位置。

当电泳接近凝胶底部时停止电泳。将凝胶转移至含有5微克/毫升溴化乙锭的1×TBE缓冲液中。在凝胶成像仪中观察凝胶条带，精确地在145 bp与160 bp标记物之间以及略高于145 bp标记物的位置切下凝胶，以避免受到接头二聚体污染。

一个关键步骤是纯化已连接的cDNA，这一步需精确切胶，因为接头二聚体与目标条带的迁移位置非常接近。将凝胶片段转移至置于2 mL收集管中的DNA破碎管中。以20,000 × g离心2分钟。

加入300 µL无RNase的水，并在室温下轻轻旋转过夜。次日进行DNA沉淀时，将管中的内容物转移至5 µm滤管中。以600 ×g离心，严格离心10秒。

然后向洗脱的DNA中加入2 µL糖原、30 µL 3 M醋酸钠、1X Pellet Paint及975 µL 100%乙醇。在4°C、17,000 ×g条件下离心20分钟。弃去上清液，加入75%乙醇洗涤沉淀。

在4°C、17,000 ×g 条件下离心5分钟后，弃去上清液，将离心管置于37°C的加热块上孵育，彻底蒸发乙醇。用12 µL pH 8.5的10 mmol/L三羟甲基氯化物重悬沉淀。接下来，将纯化的互补DNA（cDNA）稀释10倍，取1 µL稀释后的cDNA上样至生物分析仪，进行文库质量检测。

确保互补DNA产物的大小在电泳图谱中对应于136至160个碱基对之间的小RNA范围。计算每个样本的总摩尔浓度。使用pH 8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐将每个样本归一化至2纳摩尔。

将每个两纳米浓度的样品取等体积混合于一个200微升的PCR管中来制备文库。按照文中所述步骤进行变性与测序。本研究中，文库在RNA提取后制备，并进行了质量检测。

连接接头后的微小RNA产物大小在每个样本中约为136至160个碱基对。高亮区域显示了为小RNA文库制备而精确切下的凝胶范围。该图展示了纯化的互补DNA文库的凝胶电泳图及电泳图谱。

微量切割的FFPE组织和血清来源的EV。小RNA测序运行的代表性指标显示了微量切割FFPE组织和血清来源EV的预期簇密度、Q值、通过过滤簇百分比，以及估计产量和错误率。两个样本的Q值均高于30，表明碱基识别准确率达到99.9%。

且错误率均低于一。文库构建的每一步都应仔细操作，每次孵育后应立即将离心管转移至冰上。该实验方案中的一个关键步骤是精确切胶，以确保获得无接头二聚体且纯净的cDNA文库。

构建cDNA文库需要针对高质量测序运行进行优化。理解本方案将帮助读者将这些细微之处外推至其他来源于有限样本（如血清和细胞外囊泡）的测序文库制备过程。该技术已帮助我们鉴定了与转移性前列腺癌患者肿瘤侵袭性及治疗耐药相关的新微小RNA。

这些技术可推广至其他疾病类型，有助于新型生物标志物的发现。由于该技术使用了骨骼肌来源的血清和组织样本等生物材料，应采取适当的防护措施。此外，溴化乙锭是一种已知的致癌物，在使用本方案时应格外小心地操作。