Name: 基因组编辑细胞系细胞融合，用于细胞结构和功能的扰动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学习细胞融合技术用于研究细胞结构与功能扰动，通过荧光标记追踪细胞器来源。该方法利用荧光显微镜分析杂交细胞，揭示细胞器稳态机制，为细胞生物学研究提供重要工具。

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本工作由惠康基金会亨利·惠康研究员项目资助，资助号为 R.M.（https://wellcome.ac.uk/grant number 100090/12/Z）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中未发挥任何作用。我们感谢 Ashok Venkitaraman 和 Paul French 对本项目提供的关键性建议与指导。我们感谢剑桥医学研究所流式细胞术平台的 Chiara Cossetti 和 Gabriela Grondys-Kotarba 提供的出色支持。我们感谢 Liam Cassiday、Thomas Miller 和 Gianmarco Contino 对稿件的校对。

1. 差异荧光细胞标记
<ol>
	<li>利用 CRISPR Cas9 进行基因标记
	<ol>
		<li>使用 CRISPR Cas9 基因组编辑技术，在人源癌细胞系中将根丝蛋白（或其它目的基因）与荧光蛋白 meGFP 或 mScarlet-I 进行标记。 
		注意： 基因组编辑的详细方案在其他文献中有详细描述24,25,26。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光染料标记
	<ol>
		<li>在含 10% 胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和 100 µg/mL 青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 Cal51 人源癌细胞。 
		注意： 必须定期检测细胞是否无支原体污染，并确认细胞系的身份。避免使用长期传代的细胞（&#62;15 代）。细胞应保持健康并处于指数生长期。避免细胞密度过低或过高。</li>
		<li>接种每种细胞类型（rootletin-meGFP、rootletin-mScarlet-I 和未标记的亲本 Cal51 细胞），使每种样本在次日含有约 6 × 106 个细胞，细胞融合度为 70−90%。 
		注意： 每种细胞类型大约需要一个 T75 培养瓶或一个 10 cm 培养皿。后续实验中需要使用亲本未标记细胞作为阴性对照。本方案可制备约 20,000 个融合细胞，但可通过增加批次数量扩大实验规模以提高产量。</li>
		<li>次日，将 DMEM、胰蛋白酶和 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）置于 37 °C 水浴中预热。</li>
		<li>用 PBS 洗涤 rootletin-meGFP 和 rootletin-mScarlet-I 细胞两次，每次倾去或吸去培养基后加入 10 mL PBS。</li>
		<li>在室温（RT）下，向 Cal51 rootletin-meGFP 细胞中加入 500 nM 的紫色细胞染料（材料表），孵育 1 分钟，进行标记。</li>
		<li>在室温（RT）下，向 Cal51 rootletin-mScarlet-I 细胞中加入 200 nM 的远红细胞染料（材料表），孵育 1 分钟，进行标记。 
		注意： 荧光染色后，应尽可能将样品避光保存，以防止荧光发生光漂白。</li>
		<li>加入 10 mL DMEM 孵育 5 分钟，以终止染料标记反应。</li>
		<li>从培养箱中取出未标记的亲本 Cal51 细胞（来自步骤 1.2.2）。 
		注意： 这些细胞将在后续步骤中用作未标记的阴性对照（步骤 3.3.2）。</li>
		<li>将所有细胞用 PBS 洗涤一次，倾去生长培养基后加入 10 mL PBS。</li>
		<li>倾去 PBS，加入 1 mL 预热的 1× 胰蛋白酶，在培养条件下孵育 5 分钟。</li>
		<li>将细胞转移至 15 mL 塑料锥形管中，在 1000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>用移液器小心吸除并弃去细胞沉淀中的胰蛋白酶。</li>
		<li>用 1 mL PBS 轻柔重悬紫色和远红标记的细胞沉淀。</li>
		<li>用 1 mL DMEM 轻柔重悬亲本（非荧光）细胞沉淀，并放回培养箱中继续培养。 
		注意： 该样本不进行细胞-细胞融合，但将在后续流式细胞术中使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞间融合
<ol>
	<li>使用1 mL移液器，将每种细胞类型各0.5 mL轻柔地混合于一个15 mL离心管中，使3 × 106个紫染标记细胞与3 × 106个远红染标记细胞充分混合。</li>
	<li>将步骤2.1中剩余的未混合细胞在1,000 × g条件下离心5分钟，倾去PBS，用1 mL DMEM重悬沉淀，并放回培养箱中。 
	注意：这些剩余的单标记未混合样本将在后续步骤3中用作阴性对照和补偿对照。</li>
	<li>将步骤2.1中混合的细胞在1,000 × g条件下离心5分钟，使用1 mL移液器小心吸除PBS。</li>
	<li>在30秒内，使用1 mL移液器以逐滴方式向细胞沉淀（步骤2.3）中加入0.7 mL的50% 1450 PEG溶液。</li>
	<li>室温下静置3.5分钟。 
	注意：PEG孵育时间可根据细胞类型进行优化，但需注意延长孵育时间会增加细胞毒性。</li>
	<li>在30秒内逐滴加入10 mL无血清DMEM，随后将细胞置于培养箱中孵育10分钟。</li>
	<li>在1,000 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，用1 mL完全培养基（含FBS的DMEM）轻柔重悬细胞。 
	注意：请立即进入第3部分操作。由于PEG处理后的细胞在流式细胞术和成像过程中存在毒性，因此各步骤间应快速操作，尽可能保持细胞处于培养条件下。</li>
</ol>
3. 通过荧光激活细胞分选（FACS）富集融合细胞
<ol>
	<li>通过轻轻吹打，将每个样品分别经 70 µm 滤膜过滤至流式管中，以准备所有细胞用于流式细胞术。 
	注意：需要准备四个样品：融合细胞、单标记远红细胞、单标记紫光细胞、未标记的亲本细胞。一旦离开无菌细胞培养操作台，细胞可能被污染，因此从此时起应尽量减少样品暴露于非无菌环境的时间。细胞在完全 DMEM 培养基中进行分选。</li>
	<li>使用具备单细胞分选功能的流式细胞仪。
	<ol>
		<li>设置无菌分选条件。按照仪器制造商的建议进行仪器质控。</li>
		<li>绘制前向散射光与侧向散射光的图谱，以及双细胞团鉴别图谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立门控以识别融合细胞。
	<ol>
		<li>在 405 nm 和 635 nm 波长下激发荧光染料，检测波长分别为 450 nm 和 660 nm（即紫光和远红光波段）。绘制远红光信号对紫光信号的散点图。</li>
		<li>将未标记的亲本细胞上机检测，记录其荧光强度。 
		注意：高于此本底值的信号定义为染料染色阳性。</li>
		<li>将单标记紫光染料的细胞上机检测，确认紫光信号无泄漏至远红光通道。</li>
		<li>将单标记远红光染料的细胞上机检测，确认远红光信号无泄漏至紫光通道。 
		注意：本研究所示代表性数据中，细胞在配备 100 µm 喷嘴的分选仪上以 20 psi 压力进行分选。</li>
		<li>短暂运行融合样品，确认在第 3.3 步建立的门控下可清晰观察到融合细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分选液流对准 8 孔成像培养皿中心位置。</li>
	<li>通过 FACS 将呈紫光和远红光双阳性的融合细胞直接分选至含有 100 µL 生长培养基的 8 孔成像培养皿中。 
	注意：每 8 孔板推荐最多分选约 50,000 个细胞。分选过程中需确保细胞活性。细胞汇合度会影响细胞健康状态，因此应根据成像培养皿的规格分选适量细胞，使分选后细胞汇合度维持在 20−90% 之间。每个分选液滴约含 3 nL 包围液，需确保在分选过程中包围液不会显著稀释生长培养基。</li>
	<li>分选完成后立即放回培养箱，孵育 &#62;2 小时或过夜。 
	注意：贴壁细胞在此期间会逐渐重新贴附于盖玻片，自分选开始其形态将随时间变化，若直接送显微镜观察可能影响结果判读。</li>
</ol>
4. 细胞-细胞融合的免疫荧光染色与成像
注意：融合的细胞可根据实验需求和测量要求，进行活细胞成像，或在固定及进一步荧光染色后成像（或两者均进行）。
<ol>
	<li>活细胞成像
	<ol>
		<li>更换为不含酚红的成像培养基（材料表）并直接进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定与染色
	<ol>
		<li>在 PBS 中新鲜配制 4% 多聚甲醛（PFA）。</li>
		<li>将细胞在 100 µL 的 4% PFA 中于室温孵育 15 分钟以固定细胞。孵育 15 分钟后移除 PFA。 
		警告： PFA 吸入后有毒，因此该步骤应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。 
		注意： 固定后，如需暂停实验，可稍后重新开始。如需保存样品，应置于 4 °C 避光存放。</li>
		<li>在室温下用 200 µL PBS 洗涤细胞 3 次。</li>
		<li>在200 µL 0.1%非离子型表面活性剂中，室温下透化细胞10分钟材料表）和 0.1% 非离子型去垢剂（材料表) 用 PBS 稀释。</li>
		<li>在室温下用 200 µL 含 3% 牛血清白蛋白的 PBS 溶液封闭 30 分钟。</li>
		<li>在含有3%牛血清白蛋白、0.1%非离子型表面活性剂和0.05%非离子型去污剂的150 µL PBS中，室温孵育1小时。 
		注意： 用于获得代表性结果的一抗为荧光标记的抗GFP纳米抗体（按1:400稀释使用）和荧光标记的抗mScarlet-I纳米抗体（按1:500稀释使用）。这些抗体可增强已有荧光蛋白的信号。</li>
		<li>用300 µL PBS洗涤2次，每次5分钟，然后在200 µL PBS中孵育。 
		注意： 样本在 PBS 中成像。样本可在 4 °C 避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集
	<ol>
		<li>使用能够进行四色成像的合适荧光显微镜（例如共聚焦显微镜、宽场显微镜、结构照明显微镜）采集图像。</li>
		<li>分别使用488 nm和561 nm激光激发meGFP和mScarlet-I通道，探测器设置为检测~505−550 nm和~590−650 nm波长范围。分别使用405 nm和633 nm激光激发紫色和远红染料通道，探测器设置为检测~430−500 nm和~660−750 nm波长范围。</li>
		<li>根据实验确定激光强度，以确保不发生明显的光漂白，并保持细胞健康（若进行活细胞成像）。</li>
		<li>通过实验确定增益，以在不使像素值饱和或人为截断的情况下获得信号。</li>
		<li>采集Z轴堆栈数据，使图像具有三维特性，覆盖20−60 µm范围，步长约为500 µm。 
		注意： 代表性数据中所示图像通过共聚焦显微镜（confocal）获取图2B），Airyscan（图2C）或结构照明显微镜（图2D每个细胞若在细胞质中同时含有紫色和远红染料且两者重叠，则为真正的异核体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li>
<li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li>
<li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells%3A+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们展示了一种简便且经济高效的细胞融合方法，并通过显微镜观察融合后细胞杂合体的结构，整个流程从开始到结束约需两天。该方案的关键步骤包括通过细胞分选富集融合细胞（方案第3部分），以及通过显微镜对融合细胞进行仔细验证（方案第4部分）。这些步骤可确保高效获得真正的异核体细胞。必须严格遵守试剂浓度和孵育时间。例如，若细胞染料浓度过高或孵育时间过长，在流式细胞术或荧光显微镜检测时可能导致信号过强，使检测器饱和，或根据成像条件引发串色干扰。在缺乏流式细胞仪的情况下，其他技术也可用于富集融合细胞，包括双抗生素筛选27和微流控捕获装置28。然而，这些技术要么速度较慢，要么需要更定制化的实验设置。
与其他细胞融合方法相比，本文所述方案各有优缺点。在某些情况下，电融合或基于病毒的融合技术可在融合过程中进行显微成像8,29，因此若需直接观察融合过程本身，这些方法是良好的替代选择。然而，这些不同...

细胞结构的稳态维持对生命至关重要。细胞具有特征性的形态、细胞器数量以及内部生化组成。要理解这些基本特性如何形成，以及在疾病过程中如何发生异常，需要借助实验室工具对其进行干预。
细胞融合是指两个或多个独立细胞的合并。细胞融合可能对真核生物生命的起源至关重要1。在人体中，细胞融合相对罕见，仅发生在特定的发育阶段和组织类型中，例如受精过程、肌肉、骨骼以及胎盘的形成过程中2。本实验方案描述了在体外培养的细胞系中诱导细胞间融合的方法，其中细胞的细胞器被不同地荧光标记，以此作为研究调控细胞结构与功能机制的工具。
体外诱导的细胞间融合是单克隆抗体生产的核心技术3，而单克隆抗体是生物医学研究和疾病治疗的重要工具。细胞融合还被用于探讨多种基础细胞生物学问题，包括细胞周期的主导性4、非整倍性5，6、细胞重编程7，8、受损神经元的修复9、病毒增殖10、细胞凋亡11、肿瘤发生12、细胞骨架动态13以及膜融合过程14，15。实验室中诱导细胞融合的方法16，17，18，19通过将两个脂质双分子层物理合并为一个，从而促使脂质膜发生融合。细胞融合可通过电刺激18、基于病毒的方法17、热等离子体加热20、外源基因表达19以及化学试剂（如聚乙二醇，PEG）16，21，22来实现。
中心体是微管组织中心，可调控细胞形态、运动性、极化和分裂23。中心体根状结构是由中心体延伸出的纤维状结构，含有根蛋白根蛋白素24（由基因 CROCC 编码）。我们近期利用细胞-细胞融合技术，研究在异核体中相对于亲本细胞，中心体的位置和数量如何变化24。该方法的原理是在不同荧光标记的亲本细胞融合后，追踪异核体中根状结构的来源细胞，从而对细胞器的融合与分裂进行成像。通过基因编辑在独立的细胞系中分别构建荧光标记蛋白根蛋白素-meGFP或根蛋白素-mScarlet-I，随后通过聚乙二醇介导的细胞融合将这些细胞系融合。我们描述了使用细胞染料（材料表）通过流式细胞术鉴定融合细胞，并进一步通过荧光显微镜观察中心体的来源细胞及其形态（图1）。该方法是一种稳健且独特的手段，可用于研究包括细胞器数量在内的细胞状态重大变化如何影响细胞稳态。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8875</td><td></td></tr><tr><td>880 激光共聚焦 Airyscan 显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8孔成像培养皿</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP羊驼GFP增强纳米抗体</td><td>Chromotek</td><td>gba-488</td><td></td></tr><tr><td>BD Influx 细胞分选仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤器（70 &amp;mu;m)</td><td>生物膜</td><td>CSS010070</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace 远红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>高糖型DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium），含GlutaMAX和丙酮酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I 骆驼单域抗体</td><td>NanoTag Biotechnologies</td><td>N1302-At565</td><td></td></tr><tr><td>L15 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 独立成像培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>无酚红DMEM，高糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1× PBS）</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;最多 1 L</td></tr><tr><td>聚乙二醇 Hybri-Max 1450</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯管</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337</td><td>非离子型去垢剂</td></tr></tbody></table>

基因组编辑细胞系的细胞间融合用于干扰细胞结构与功能

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

生命在脂质膜内实现空间上的区隔，从而允许细胞和细胞器内部形成独立的分子状态。细胞融合是指两个或多个细胞合并形成单个细胞的过程。本文提供了一种不同类型细胞间融合的实验方案。通过基于流式细胞术的分选富集融合后的杂交细胞，随后利用荧光显微镜观察杂交细胞的结构与功能。通过基因组编辑产生的荧光标记蛋白可在融合细胞内进行成像，从而根据荧光发射信号识别细胞结构，并追溯其来源细胞类型。这一稳健且通用的方法可应用于不同类型的细胞或特定细胞器，有助于回答一系列基础生物学问题中关于细胞结构与功能的研究。

经适当标记的细胞在流式细胞术中可通过高于未标记对照细胞的荧光信号被检测到（图2A设定门控以分选双阳性细胞，直接富集至成像培养皿中，用于后续显微镜分析。融合细胞可被识别为具有明显双荧光阳性的细胞，约占细胞群体的约1%。
融合会通过将两个细胞合并为一个细胞，引起细胞结构的重大重排（图2B）。在显微镜下，异核体被识别为单个细胞内同时含有两种荧光染料信号的细胞（无中间质膜分隔）。此外，融合细胞中的两个细胞核可通过明场/微分干涉差或荧光成像观察到。需要注意的是，除了二倍体融合外，还可能存在三倍体或其他更高倍性的多倍体状态，因此应使用两种颜色的染料信号来确认融合细胞的身份。
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本实验方案的目的是融合两种不同的细胞类型以产生杂交细胞。通过荧光显微镜分析融合后的细胞，可追踪细胞器的来源细胞。该检测方法可用于研究细胞融合引起的扰动如何影响细胞结构与功能。

生命在脂质膜内实现空间上的区隔，从而允许细胞和细胞器内部独立形成不同的分子状态。细胞融合……

该方法通过融合两种不同的细胞类型，干扰细胞的结构与功能，从而探究细胞对细胞器数量变化的响应机制等科学问题。通过对融合细胞内荧光标记的蛋白质进行成像，可将细胞结构追溯至其来源的细胞类型，以研究细胞器稳态及其功能的调控机制。对于荧光染料标记，请培养目标人源肿瘤细胞群体，确保每种细胞培养物在次日早晨达到70%至90%汇合度时，细胞数量至少扩增至6×10⁶个。在标记当天，用 PBS 洗涤 rootletin eGFP 和 rootletin-mScarlet 细胞，每次 10 毫升，共洗涤两次。将 Violet 细胞染料用 PBS 稀释至 500 纳摩尔，Far Red 细胞染料用 PBS 稀释至 200 纳摩尔。在室温下，用稀释后的 Violet 细胞染料标记 rootletin eGFP 细胞，用稀释后的 Far Red 细胞染料标记 rootletin-mScarlet 细胞，标记时间为 1 分钟。孵育结束后，加入10毫升DMEM终止反应，持续5分钟。用10毫升新鲜PBS洗涤两份标记的细胞培养物和一份未标记的亲本细胞培养物，然后将所有培养物与1毫升预热的胰蛋白酶共同孵育。孵育结束后，将脱离的细胞悬液分别转移至15毫升锥形离心管中进行离心，随后将染料标记的细胞沉淀轻轻重悬于1毫升PBS中，未标记的细胞则重悬于1毫升DMEM中。然后将所有细胞样品放回细胞培养孵育箱。进行细胞融合实验时，在一个新的15毫升离心管中，将500微升 Violet染料标记的细胞与500微升 Far Red染料标记的细胞混合，并通过离心沉淀剩余未混合的标记细胞。将沉淀物重悬于1毫升新鲜DMEM培养基中，并将细胞重新放回孵育箱。通过离心收集混合细胞，并在30秒内逐滴向细胞沉淀中加入700微升50% 1450 PEG。室温下静置3.5分钟后，在30秒内逐滴加入10毫升无血清DMEM，将试管放入培养箱中孵育10分钟。孵育结束后，通过离心沉淀混合细胞，并将沉淀轻轻重悬于1毫升完全培养基中。为了通过流式细胞术（FACS）富集融合细胞群体，先将所有细胞轻轻通过70微米滤网过滤，分别收集到单个FACS管中，并在流式细胞仪软件中绘制前向散射光对侧向散射光以及双联体 discrimination 图。运行未标记的细胞以记录其荧光强度，并设置门控以识别融合细胞。接着，运行单阳性紫染料标记的细胞，确认紫光信号无泄漏至远红通道；再运行单阳性远红染料标记的细胞，确认远红信号未出现在紫光通道中。然后短暂运行融合样品，以确认在这些设门条件下可观察到融合细胞。设定分选参数后，将分选液流对准含有100 µL培养基的八孔成像培养皿中心，并直接将双阳性融合细胞分选至该培养皿中。所有细胞分选完成后，立即将培养皿放入细胞培养箱中孵育2至16小时。进行免疫荧光染色时，首先将细胞培养上清液替换为200微升4%多聚甲醛，在室温下孵育15分钟。固定结束后，每次用200微升PBS洗涤细胞，共洗涤三次，然后在室温下用200微升0.1%非离子型表面活性剂处理细胞10分钟以进行透化。接着，在室温下用200微升含3%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭非特异性结合位点，孵育30分钟，随后在150微升染色缓冲液中加入目标抗体进行标记。室温孵育一小时后，用 300 微升 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤五分钟。最后一次洗涤后，弃去 PBS，加入 200 微升新鲜 PBS。为获取融合细胞的图像，使用能够进行四色成像的合适荧光显微镜，并采集三维图像。经过适当标记的细胞在流式细胞术中会显示出高于未标记对照细胞的荧光信号，因而可见。可通过设门分选以富集双阳性细胞群体，并直接将其分选至成像培养皿中，用于后续显微镜分析。细胞融合通过将两个细胞混合为一个细胞，引起细胞结构的重大重排。异核体被定义为在同一细胞内含有两种荧光染料信号且无细胞质膜分隔的细胞。此外，通过明场成像可在融合细胞中观察到两个细胞核。通过融合表达meGFP和mScarlet标记蛋白的细胞，可进一步研究细胞结构与功能。融合导致异核细胞内中心体数量加倍，当中心体的中心粒周围组分 NEDD1 被荧光标记时，可观察到至少四个中心粒周围物质焦点。将根丝蛋白（rootletin）进行内源性荧光标记的细胞融合后，可在异核细胞中识别每个中心体的来源细胞。本方案演示了如何融合不同标记的细胞系，以及如何对它们的细胞器进行成像，以研究其结构与功能。与类似方法相比，该实验方案具有操作相对简便、成本相对较低的优点。该技术可用于探讨一系列科学问题，例如细胞器融合如何被调控，以及细胞如何响应亚细胞器数量的变化。

cell-cell-fusion-genome-edited-cell-lines-for-perturbation-cellular

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发育生物学

基因组编辑细胞系细胞融合，用于细胞结构和功能的扰动

本视频展示了一种基于锌指核酸酶的人类多能干细胞（hPSCs）基因组编辑技术。由于hPSCs具有分化为多种细胞类型的潜力，该技术有助于以患者特异性的方式开展体外病理学和药理学研究。...

基于锌指核酸酶的基因组编辑：利用双链同源依赖性修复机制在人类多能干细胞中修饰基因组的技术

CRISPR/Cas9 是一种强大的系统，可用于破坏基因和遗传元件。本文介绍了一种利用 CRISPR/Cas9...

利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞系中产生基因组缺失

人类多能干细胞（hPSCs）的基因组编辑可以快速高效地完成。本文展示了一种可靠的实验方案，以编辑AAVS1安全港位点以表达EGFP并引入抗生素抗性为例，对hPSCs进行基因工程改造。...

基因编辑人类多能干细胞系的建立：从靶向到分离

本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。...

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

CRISPR-Cas 是一种用于编辑动植物复杂基因组的强大技术。本文详细介绍了一种利用不同 Cas...

使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

以RNA形式递送基因组编辑器是修饰原代哺乳动物细胞和细胞系基因组的一种特别有效的方法。本方案的目标是将基因组编辑器以mRNA形式递送至原代哺乳动物细胞和细胞系中，随后通过靶向Illumina测序与分析，定量编辑结果。...

通过电穿孔递送编辑器RNA在原代哺乳动物细胞中进行基因组编辑

学习细胞融合技术用于研究细胞结构与功能扰动，通过荧光标记追踪细胞器来源。该方法利用荧光显微镜分析杂交细胞，揭示细胞器稳态机制，为细胞生物学研究提供重要工具。

基因组编辑细胞系的细胞间融合用于干扰细胞结构与功能

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