Name: 从产后小鼠小脑中纯化Promin-1+干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 了解从产后小鼠小脑中纯化Prominin-1阳性干细胞的经济高效方法。该技术通过磁珠分选获得高纯度神经干细胞，可分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，为研究小脑发育及相关疾病提供重要工具。

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感谢 Opal 实验室成员提出的建议。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 1RO1 NS062051 和 1RO1NS08251（Opal P）

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》（2011年版）的规定，并经西北大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准（方案编号IS00011368）。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>制备组织解离液：使用含酚红的无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），并加入木瓜蛋白酶（100 U/mL）、半胱氨酸（0.2 mg/mL）和DNase（250 U/mL）。</li>
	<li>配制DNase溶液：将&#160;100 mg冻干粉末型DNase I（一瓶）溶于50 mL H2O中，充分混匀后过滤母液。分装成每份10 mL的储存液，再将其中一份储存管进一步分装为每份0.5 mL的单次使用 aliquot。将这些单次使用分装物储存于-80 °C。</li>
	<li>通过配制磁性分离柱缓冲液X来准备磁性分离试剂：含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA的溶液。</li>
	<li>配制神经球培养基：使用含青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基，并添加2% B27、20 ng/mL人重组表皮生长因子（EGF）和20 ng/mL人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。</li>
	<li>配制分化培养基：使用Neurobasal培养基，并添加10 ng/mL分化因子血小板源性生长因子（PDGF-AA）或10 ng/mL白血病抑制因子（LIF），以及2% B27。</li>
	<li>使用超低吸附性的12孔（3.5 cm2）和6孔（9.6 cm2）培养板。</li>
</ol>
2. 小脑的解剖
<ol>
	<li>使用异氟烷麻醉小鼠幼崽（P3-P7），并用手术剪断头。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒分离的幼崽头部。</li>
	<li>将每个头部转移至一个无菌的10 cm空培养皿中。用显微解剖剪分离皮肤，然后沿中线矢状方向剪开颅骨以去除颅骨。</li>
	<li>使用#7镊子从脑干尾侧开始剥离颅骨。用刮勺小心抬起大脑，保持小脑完整，将脑组织转移至含有15 mL冰冻Hanks平衡盐溶液（HBSS）的新鲜无菌10.0 cm培养皿中。</li>
	<li>将盛有脑组织的培养皿置于解剖显微镜下。使用精细的#5镊子去除小脑上的脑膜和大血管，并用刮勺将小脑与脑干分离。</li>
	<li>将小脑转移至含有5.0 mL冰冻HBSS溶液的15 mL离心管中。用5.0 mL HBSS洗涤小脑，倾倒弃液，重复洗涤3次。 
	注意：每个小脑应单独置于一支离心管中以进行后续处理。</li>
</ol>
3. 细胞悬液制备
<ol>
	<li>最后一次漂洗后，加入5 mL已预热至37 °C的基于木瓜蛋白酶的组织解离溶液（基于先前研究13,18）。将组织置于37 °C水浴中孵育15分钟。每3分钟用手或振荡混合器将管子上下颠倒3–5次，缓慢混匀内容物。</li>
	<li>准备一支大直径（普通玻璃移液管）和一支小直径巴斯德移液管（通过在本生灯上加热进行火焰抛光），操作如先前所述19。</li>
	<li>用5 mL HBSS溶液洗涤组织3次，倾倒时避免手工操作导致组织丢失。</li>
	<li>去除最后一次HBSS洗涤液，向组织中加入5 mL含有250 μL DNase溶液的DPBS溶液。使用大直径巴斯德移液管吹打10–15次以解离组织。此步骤应轻柔操作，避免产生气泡。</li>
	<li>随后将悬液在37 °C水浴中继续孵育10分钟，通过反复倒置和直立试管进行混匀。</li>
	<li>使用小直径巴斯德移液管进一步吹打组织悬液10次。若仍有较大组织块残留，可用移液管尖端轻轻将组织块压向管底，并持续吹打直至细胞形成细小的悬浮液。</li>
	<li>将组织在37 °C继续孵育10分钟，并重复之前的混匀步骤。</li>
</ol>
4. 干细胞免疫标记
<ol>
	<li>将离心管置于冰上，并在后续步骤中使用预冷的冰上溶液。将解离的细胞通过40 μm细胞筛过滤至50 mL离心管中。在滤器上加入10.0 mL HBSS溶液，以确保细胞在该额外溶液中通过滤网。</li>
	<li>将过滤后的细胞转移至一个新的15 mL离心管中，以300 x g离心细胞悬液 g 4 °C 下离心 10 分钟。吸出并彻底弃去上清液&#160;使用真空抽吸器小心操作。</li>
	<li>将沉淀重悬于160 μL磁珠分选缓冲液中。在进行磁性标记前，为获得单细胞悬液，需将细胞通过30 μm尼龙滤网以去除细胞团块，否则可能堵塞分选柱。</li>
	<li>向每个15 mL离心管中加入40 μL抗prominin-1磁珠，混匀后于冰箱中孵育15 min，使抗体与表达prominin-1的细胞结合。</li>
	<li>用 1.0–2.0 mL 柱缓冲液 X 洗涤细胞，然后在 300 × g 条件下离心 x g 10 分钟。完全吸除上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于1.0 mL柱缓冲液中&#160;缓冲液 X 
	注意： 如果在用1.0 mL柱缓冲液X重悬沉淀后观察到少量团块，则&#160;应使用巴斯德移液管的尖端小心移除，&#160;否则&#160;这些团块可能在细胞分选过程中阻塞磁性柱。</li>
</ol>
5. 磁珠柱制备、细胞分选与铺板
注意：不同基因型条件（疾病组 vs. 对照组）的磁分离必须同时进行，因为任何延迟都可能影响神经球的形态。
<ol>
	<li>将磁性柱置于磁力架上，使其暴露于磁场中，以准备磁性柱。加入500 μL缓冲液X冲洗柱子一次，冲洗液滴入离心管后弃去。 
	注意：每次实验均需新鲜配制磁性柱缓冲液X；若未新鲜配制，则干细胞得率将降低。</li>
	<li>将标记的细胞悬液加至柱上。收集流穿液，其中含有未标记的细胞，主要为小脑神经元/胶质细胞混合细胞，收集至新的15 mL离心管中（图1A）。</li>
	<li>用500 μL缓冲液X洗涤柱子3次（每次洗涤约需2–4分钟）。 
	注意：富含小脑颗粒神经元的小脑神经元/胶质细胞混合培养物可作为此纯化步骤的有用副产物。</li>
	<li>将柱子从磁场中移开，并放入1.5 mL离心管中。向柱内加入1.0 mL培养基（神经球培养基），推动柱塞，将与prominin-1磁珠结合的细胞冲洗至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>为提高prominin-1标记细胞的纯度，可将洗脱的细胞按照步骤5.1–5.4再通过第二个柱子进行纯化。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。通常每只小脑可获得约107个细胞。将细胞接种至超低吸附培养板中（6孔或12孔板，根据下游实验所需的密度选择）。</li>
</ol>
6. 神经球的传代与分化
<ol>
	<li>将 prominin-1 标记的干细胞以每孔 5,000 个细胞的密度接种于超低吸附 12 孔板中，加入神经球培养基培养。</li>
	<li>7–10 天后，细胞分裂形成呈球形、悬浮生长的神经球（原代神经球）。 
	注意： 在此实验中，生成用于后续实验的次级神经球，其数量可进一步扩增。由于初级神经球群体可能含有不具备干细胞特性的污染细胞，且这些细胞可与神经球聚集成团，因此不用于本实验。</li>
	<li>传代时，使用1.0 mL移液器吸头将原代神经球连同培养基转移至15 mL无菌离心管中。在300 x g条件下离心，使神经球沉淀。 g 5 分钟后弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于5 mL含有木瓜蛋白酶或0.05%胰蛋白酶溶液的组织解离液中，37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>将细胞悬液在300 x g 5分钟。将细胞重悬于5 mL神经球培养基中，使用塑料巴斯德吸管通过机械法缓慢解离细胞&#160;上下吹打10次。</li>
	<li>将细胞再次接种于神经球培养基中，具体方法如前所述。培养7–10天后，培养板中应富集次级神经球。 
	注意： 这些培养物可高效传代多达8次，之后神经球体积 tends to 变小，提示增殖能力下降。</li>
	<li>在血细胞计数板上计数细胞，并将适量细胞接种至多聚-D-赖氨酸包被的培养板（6孔或12孔）中，用于后续实验。</li>
	<li>为了诱导干细胞分化，通过离心收集第二至第八代的神经球，具体步骤如前所述，但在沉淀中加入分化培养基。 
	注意：&#160;之后&#160;体外培养7天后，干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，这一结果通过神经元标志物β-III微管蛋白、星形胶质细胞标志物GFAP和少突胶质细胞标志物O4的染色得以证实。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

表达Prominin-1的小脑干细胞在出生后生命最初3周内定位于预期的白质区域。它们的增殖受到浦肯野细胞支持的音猬因子（sonic hedgehog）信号通路的严格调控17。这些干细胞/前体细胞可分化为出生较晚的GABA能中间神经元，即篮状细胞和星形细胞。这些中间神经元位于分子层，在此通过GABA能抑制性突触作用于浦肯野细胞，从而塑造浦肯野细胞的拓扑结构和功能13,17,23。除了生成中间神经元外，这群干细胞还产生所有出生后来源的小脑星形胶质细胞17,24。
本方案描述了一种从出生后小鼠小脑中纯化 prominin-1/CD133 干细胞的简便且经济的方法。干细胞必须在超低吸附培养板中进行培养。若在普通培养板中培养这些干细胞，可能导致...

小脑长期以来被认为是协调自主运动的主要神经回路1。它接收来自神经轴广泛区域的输入，包括来自外周的本体感觉信息，从而精细调节运动输出&#160;并协调动作。最近的研究还发现，小脑可能通过类似的信息处理网络参与认知和情绪的调节2,3,4。
成年小脑由外层的小脑皮质和内层的白质组成。在这些结构中散布着深部小脑核团。与神经系统其他部分相似，小脑的发育由多能前体细胞（干细胞）的增殖所驱动，这些细胞经过迁移和分化，最终形成这一高度有序的结构。在早期发育阶段（E10.5–E13.5），围绕正在形成的第四脑室的室管膜干细胞微环境产生GABA能神经元（即浦肯野细胞、卢加罗细胞、高尔基细胞）以及伯格曼胶质细胞5,6,7,8。
在发育后期（出生后第一周），菱形唇中出现第二个干细胞微环境，产生表达MATH1和Nestin的前体细胞，这些前体细胞可分化为兴奋性颗粒神经元9,10,11,12。最近，已发现第三个干细胞微环境13。这些细胞表达prominin-1（也称为CD133），这是一种跨膜糖蛋白，可界定肠道和造血系统中部分干细胞亚群14,15,16。体内命运图谱研究表明，在出生后前三周，这些干细胞可生成分子层关键的中间神经元（即篮状细胞和星状细胞）以及星形胶质细胞。过去，由于先前的方法依赖于prominin-1染色，并需要昂贵且耗时的技术（如荧光激活细胞分选[FACS]），在体外研究这些细胞一直较为困难12,13,17。本方案描述了一种基于免疫磁珠的方法，用于分离这些干细胞，随后可方便地进行培养和诱导分化。

<table><tbody><tr><td>0.05%胰蛋白酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td>0.05%</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>2 mM EDTA溶液</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>抗Prominin-1磁珠</td><td>Miltenyi Biote</td><td>130-092-333</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Column MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附培养板</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D4513-1VL</td><td>250 U/ml</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040141</td><td></td></tr><tr><td>Hank's平衡盐溶液-HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>人重组碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Promega</td><td>G507A</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>人重组表皮生长因子</td><td>Promega</td><td>G502A</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Lieca TCS SP5共聚焦显微镜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗Prominin-1抗体</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-1331</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Abcam</td><td>ab27952</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>O4</td><td>Millopore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>血小板源性生长因子</td><td>Sigma</td><td>H8291</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>兔抗微管蛋白β-III</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>1:500</td></tr><tr><td>兔抗GFAP抗体</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:500</td></tr><tr><td>分离柱-MS柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>无菌细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>40 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

从小鼠出生后小脑中分离prominin-1+干细胞

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

大多数小脑神经元起源于两个胚胎期干细胞微环境：一个为菱形唇微环境，产生所有小脑兴奋性谷氨酸能神经元；另一个为室管膜区微环境，产生抑制性GABA能浦肯野细胞，以及构成小脑深部核团的神经元和伯格曼胶质细胞。最近，已发现第三种干细胞微环境，它作为室管膜区微环境的次级生发区而形成。该微环境中的细胞以细胞表面标志物prominin-1为特征，定位于出生后小脑发育中的白质区域。该微环境产生晚期出生的分子层GABA能中间神经元，以及出生后生成的小脑星形胶质细胞。除了在发育过程中的作用外，该微环境在神经退行性疾病和肿瘤发生中的作用也日益受到转化医学领域的关注。由于缺乏高效的分离纯化技术，这些细胞的生物学特性一直难以解析。本文展示了高效分离、培养和诱导这些出生后小脑干细胞分化的实验方法。

富含生长因子（EGF 和 bFGF）的神经球培养基中，Prominin-1 阳性的出生后小脑干细胞形成了神经球。这些神经球对用于分离的标志物 Prominin-1 呈阳性，同时也表达其他干细胞标志物，如 Nestin 和 GFAP13（图 1）。干细胞标志物的表达在培养期间持续维持，至少可保持至第八代20。当撤除生长因子并添加支持神经元和胶质细胞分化的因子 LIF 与 PDGF-AA 时21,22，神经球分化为神经元和胶质细胞谱系（图 2）。
<img alt="细胞分化过程；免疫荧光图像；Nestin、GFAP、β-III 微管蛋白、Prominin-1 分析。" class="xfig...

本文展示了一种高效且经济的方法，用于从出生后小鼠小脑的白质中分离、培养并分化神经干细胞。

从小鼠出生后小脑中分离Prominin-1+干细胞

大多数小脑神经元起源于两个胚胎干细胞微环境：菱形唇微环境产生所有小脑兴奋性谷氨酸能神经元，……

本方案描述了一种简单且经济的方法，用于从出生后小脑中纯化干细胞。这些干细胞可生成晚期出现的分子特征混乱的中间神经元，同时也可生成出生后来源的小脑星形胶质细胞。因此，研究这些细胞对于理解小脑的发育过程具有重要意义。采用本方案，干细胞的得率与基于FACS的方法相当，而后者成本通常高出约10倍。本方案可推广应用于从其他组织（如肠道和骨髓）中分离表达prominin-1的干细胞。首先，将盛有脑组织的培养皿置于解剖显微镜下。使用精细的5号镊子去除小脑的脑膜和大血管，然后用解剖刀将小脑与脑干分离。将小脑转移至含有5毫升冰上预冷的HBSS溶液的15毫升离心管中。冲洗后倾去HBSS溶液。重复洗涤两次。最后一次漂洗后，加入5毫升预热至37摄氏度的木瓜蛋白酶组织解离溶液。将组织在37摄氏度水浴中孵育15分钟，每隔3分钟轻轻倒置试管3至5次，以缓慢混匀管内内容物。使用本生灯对粗径和细径玻璃巴斯德移液管进行火焰抛光处理。孵育结束后，用五毫升 HBSS 溶液将组织清洗三次，倾倒时注意避免组织丢失。最后一次 HBSS 清洗后，向组织中加入五毫升含 250 微升 DNA 酶的 DPBS 溶液，并用粗径巴斯德移液管轻柔吹打 10 至 15 次以解离组织。然后使用细口巴斯德移液管将组织匀浆再吹打10次。如果仍有较大的组织碎片残留，可用移液管尖将其压向管底，并继续吹打，直至形成均匀的细小悬浮液。将离心管置于冰上。然后将解离的细胞通过40 µm细胞滤筛过滤至50 mL离心管中。用10 mL冰上预冷的HBSS溶液冲洗滤膜，以确保细胞完全通过滤网。将滤过的细胞转移至新的15 mL离心管中，在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。然后使用真空抽滤器彻底去除上清液。将细胞沉淀重悬于160 µL预冷的磁珠柱缓冲液中。向细胞悬液中加入40 µL抗prominin-1微珠。然后将试管置于冰箱中孵育15分钟，使抗体与表达prominin-1的细胞结合。用一到两毫升柱缓冲液X洗涤细胞，并在300 × g下离心10分钟。吸除上清液，并将沉淀物重悬于一毫升柱缓冲液X中。将磁性柱置于磁力架上，用500微升缓冲液X冲洗一次。将标记的细胞悬液加至柱上，并用新的15毫升试管收集穿流液。用500微升缓冲液X洗涤柱三次。然后将柱子从磁场中取出，放入1.5毫升离心管中。加入1毫升培养基，并将推杆插入柱中，以冲洗出与prominin-1磁珠标记的细胞。传代神经球时，将神经球连同培养基一起转移至无菌的15毫升离心管中。以300 × g离心5分钟，使神经球沉淀，弃去上清液。将沉淀物重悬于5毫升含木瓜蛋白酶或0.05%胰蛋白酶溶液的解离液中，于37°C孵育10分钟。再次离心细胞悬液。然后将细胞重悬于5 mL神经球培养基中，使用巴斯德移液管缓慢吹打10次使细胞解离。按照文本方案所述，将细胞接种于神经球培养基中，并在培养7至10天后，如

purification-of-prominin-1-stem-cells-from-postnatal-mouse-cerebellum

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科研

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Neuroscience

神经科学

从产后小鼠小脑中纯化Promin-1+干细胞

本文介绍了一种从出生后小鼠中分离并培养小脑颗粒神经元前体细胞及小脑颗粒神经元的方法。...

出生后小鼠小脑颗粒神经元前体细胞及神经元的分离与培养

从特定组织类型中解离细胞需要优化组织解离的参数，以获得大量具有活性且可培养的细胞。Miltenyi gentleMACS...

从小鼠神经组织制备单细胞悬液

本视频演示了从小鼠幼崽的小脑中分离和培养小脑神经前体细胞的过程。通过差速贴壁法分离并纯化小脑颗粒神经元前体细胞，有效去除星形胶质细胞。这些培养的前体细胞随后可分化为小脑颗粒神经元。...

分离与培养小鼠小脑颗粒神经元前体细胞

本视频展示了一种从出生后小鼠小脑中分离干细胞并将其分化为神经细胞的方法。利用抗体包被的磁珠从分离的细胞悬液中纯化干细胞，并进行培养以形成神经球。随后将神经球维持在分化培养基中，以诱导生成神经细胞。...

从小鼠出生后小脑中分离干细胞并诱导其分化为神经细胞

通过强制表达转录因子 Oct-4、Sox-2、Klf-4 和 c-Myc，可将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞，但效率较低。重编程过程中的稀有中间态细胞可通过针对细胞表面标志物 Thy-1.2、Ssea-1 和 Epcam...

由可重编程小鼠模型中利用细胞表面标志物介导分离iPS细胞中间态细胞

表达巢蛋白的 前体细胞是发育中小脑中一种新近发现的神经前体细胞群体。结合本文所述的显微解剖技术与荧光激活细胞分选，可有效分离该细胞群体，且不混杂其他小脑区域的污染细胞，进而可用于培养以开展后续研究。...

通过显微解剖法从发育中的小脑分离不同细胞群体

在此，我们介绍一种从新生小鼠（出生第1天）中分离小胶质细胞的实验方案 体外...

快速且优化的CD11b磁珠分离原代小胶质细胞方法，具有更高纯度与多功能性

我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。...

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

我们提出了一种从小鼠大脑中提取周细胞的方案。该方案基于一种不含抗生素的富集导向型周细胞提取方法，可实现高纯度和高得率，是体外研究的有力工具，有助于减少实验动物的使用数量。...

一种高效分离小鼠脑周细胞的方法

本方案描述了一种动态培养系统，用于在化学成分明确且无饲养层的条件下，利用一次性生物反应器生成尺寸可控的人多能干细胞聚集体，并进一步诱导其向小脑类器官分化。...

由人多能干细胞可扩展地生成成熟小脑类器官及通过免疫染色进行表征

此处，我们展示一种可重复的 体外...

一种高效且经济的电穿孔方法用于研究颗粒细胞前体中依赖初级纤毛的信号通路

了解从产后小鼠小脑中纯化Prominin-1阳性干细胞的经济高效方法。该技术通过磁珠分选获得高纯度神经干细胞，可分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，为研究小脑发育及相关疾病提供重要工具。

从小鼠出生后小脑中分离Prominin-1⁺干细胞

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