Name: 使用嘧啶类似物5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）和细胞周期标志物在质谱细胞术平台中建立细胞周期期 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习使用质谱流式细胞术和IdU标记技术进行单细胞水平细胞周期分析的方法。该技术可直接检测S期细胞，适用于急性髓系白血病等癌症研究，帮助理解稀有癌细胞生长特性及免疫细胞增殖规律。

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作者谨此感谢Palak Sekhri、Hussam Alkhalaileh、Hsiaochi Chang和Justin Lyeberger在实验方面提供的支持。本研究由Pelotonia研究员项目资助。本文所表达的观点、发现和结论均为作者（们）的观点，不一定反映Pelotonia研究员项目的立场。&#34;

1. IdU 储存液的制备
<ol>
	<li>将5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）溶于DMSO中，配制成50 mM的溶液。经无菌过滤后，分装至10–50 µL离心管中，于-80 °C保存。</li>
	<li>从冷冻箱中取出IdU，在室温下解冻。用RPMI-1640培养基稀释IdU，制备终浓度为1 mM的工作液。通过反复吹打或涡旋混匀。
	<ol>
		<li>通常将浓缩的IdU稀释至细胞培养所用的培养基中（例如DMEM、IMDM等），或将其稀释于PBS中，以便直接加入外周血或骨髓穿刺样本。此预稀释步骤有助于DMSO与目标细胞所处的水相培养基充分混合。 
		注意：孵育过程中IdU的终浓度应为10 µM；可将1 mM的溶液以每1 mL培养基加入10 µL的比例添加。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. IdU 孵育与样品保存
<ol>
	<li>将样品置于37 °C、加湿的培养箱中孵育。从培养箱中取出样品，并转移至生物安全柜中。</li>
	<li>向每1 mL样品中加入10 µL的1 mM IdU。
	<ol>
		<li>对于6孔板，向每孔中的3 mL培养基中加入30 µL的1 mM IdU。IdU也可直接用于骨髓穿刺液以及小鼠研究4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品重新放回37 °C培养箱中孵育10–15分钟。在IdU孵育期间，保持细胞处于最佳生长条件下，以获得最准确的S期测量结果。</li>
	<li>IdU孵育结束后，取出样品并转移至锥形管中。</li>
	<li>在室温下以400 × g 离心10分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用200 µL PBS重悬细胞。
	<ol>
		<li>如需要，可在该步骤进行活/死细胞染色（使用顺铂）以在固定和冷冻前标记死细胞。 
		注意：铑标记的活/死细胞染色在甲醇透化后效果不佳，因此不推荐用于细胞周期分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向PBS中加入18.75 µL的16%多聚甲醛（PFA），使终浓度为1.5% PFA。室温孵育10分钟。然后在室温下以400 × g 离心10分钟。</li>
	<li>吸除PBS/PFA溶液，并将样品重悬于500 µL细胞染色缓冲液（CSM；含0.5% BSA和0.02%叠氮化钠的1× PBS）中，加入10% DMSO，再进行冷冻。
	<ol>
		<li>若使用商用蛋白质组稳定剂，向重悬于200 µL PBS中的样品中加入280 µL蛋白质组稳定剂（1:1.4）。室温孵育10分钟后，直接放入-80 °C保存。 
		注意：研究表明，IdU在37 °C孵育10–15分钟内即可有效掺入。IdU孵育时间超过10–15分钟会逐渐降低S期和G2期细胞群的分辨率，因为被IdU标记的细胞会离开S期并进入G2期或M期。我们还观察到，长时间孵育IdU可能导致细胞死亡及细胞周期假象。后续的细胞处理和抗体染色步骤足以洗去未掺入S期细胞中的残余IdU。使用本实验方案时，我们未观察到显著的碘背景信号；然而，在极少数临床样本中曾观察到碘污染，可能来源于医疗操作（如CT扫描中的碘造影剂）或含碘药物。若发现大量IdU背景信号，不应上机检测，以避免对质谱流式细胞仪检测器造成损害。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 质谱流式细胞术样本染色
<ol>
	<li>从 -80 °C 取出样本，待其解冻后再进行表面染色。
	<ol>
		<li>若使用 SmartTube 固定方法，需在 0-4 °C 下解冻样本，以避免样本升温过程中发生额外固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本解冻后，将约 100 万至 200 万个细胞转移至 5 mL FACS 管中。</li>
	<li>以 600 × g 离心 5 分钟，并用细胞染色缓冲液（CSM）充满 FACS 管以洗涤细胞，重复此步骤一次。
	<ol>
		<li>若已知细胞易发生聚集，可在 CSM 洗涤液中加入 400 U/mL 肝素以防止细胞间接触，但此步骤并非严格必需。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 FC 封闭剂，每 100 µL 细胞悬液中加入 5 µL 封闭剂，在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>配制用于染色细胞表面或细胞外部分的抗体混合物。每次检测中，每 100–200 万个细胞的总染色体积为 100 µL。染色混合物中的 CSM 和肝素应根据鸡尾酒配方和 FACS 管中的总体积进行相应调整。 
	注意：此步骤中加入 CSM 可减少非特异性染色伪影8。该染色混合物的具体组成完全取决于研究目标和细胞表面表型（例如，T 细胞相关研究将使用 CD45、CD3、CD4、CD8 等表面标记组合）。有关样本处理与染色的详细方案，可参见 Behbehani 和 McCarthy 等人的文献9,10。</li>
	<li>将表面染色混合物加入细胞中，在室温下持续振荡孵育 30–60 分钟。</li>
	<li>染色完成后，用 CSM 充满 FACS 管，并以 600 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>再用 CSM 洗涤两次，每次以 600 × g 离心 5 分钟，并吸除上清液。</li>
	<li>通过加入含 10% CSM 和 1.5% PFA 的 1 mL PBS 来固定细胞外抗体。</li>
	<li>用 CSM 充满含有 PBS/CSM/PFA 混合液的 FACS 管，以 600 × g 离心 5 分钟后吸除上清液。</li>
	<li>加入 -20 °C 的甲醇。</li>
	<li>涡旋震荡样本 1–2 分钟，以获得单细胞悬液，并确认所有细胞团块均已重新悬浮。</li>
	<li>在样本缓慢涡旋过程中，使用带滤芯吸头的 1000 µL 移液器迅速加入 1 mL 冰冷甲醇。</li>
	<li>将 FACS 管置于光源前检查，确保无可见团块；出现浑浊属正常现象。任何残留团块将导致样本无法用于后续 MCM 分析。</li>
	<li>将样本在 -20 °C 下保存 10–20 分钟。</li>
	<li>在此期间配制细胞内染色混合物。该混合物的具体组成取决于研究目标。若进行细胞周期分析，应在染色混合物中包含 CyclinB1、pRb、Ki67 和 pHH3，也可根据需要添加其他细胞内标记物。</li>
	<li>在 -20 °C 孵育 10–20 分钟后，取出样本，加入 1.5 mL PBS，并用 CSM 补足体积。</li>
	<li>以 600 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。</li>
	<li>再用 CSM 洗涤两次，每次以 600 × g 离心 5 分钟，并吸除上清液。</li>
	<li>最后一次 CSM 洗涤后，离心样本并保留约 50 µL 残余液体。</li>
	<li>向样本中加入已配制的抗体混合物（通常加入 50 µL 抗体染色鸡尾酒，使最终染色体积达到 100 µL），在振荡平台上室温孵育 30 至 60 分钟。</li>
	<li>染色完成后加入 CSM，并以 600 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除 CSM，再次用 CSM 洗涤，以 600 × g 离心 5 分钟，吸除 CSM 后加入 PBS。</li>
	<li>完成细胞内染色后，将细胞置于一种嵌入剂溶液中，该溶液可将抗体固定于细胞并染色每个细胞的 DNA，从而实现细胞识别。嵌入剂溶液中含有非同位素纯的铱嵌入剂（五甲基环戊二烯基-Ir(III)-二吡啶并菲嗪），由厂家储备液加入，终浓度为 500 µM。将铱储备液按 1:4000 比例稀释于含 1.5% PFA 的 PBS 溶液中。每百万细胞加入 100–200 µL 铱嵌入剂溶液，以实现均匀染色并避免过度染色。 
	注意：该嵌入剂溶液中的铱用于单细胞门控识别，不应作为活/死细胞染色使用。如需进行活/死细胞染色，应在固定前完成，具体操作参见 McCarthy 等人文献9。</li>
	<li>将样本置于嵌入剂溶液中，于 4 °C 冰箱中保存，最长可保存两周，之后进行 CyTOF 检测。</li>
</ol>
4. 质谱流式细胞仪操作
注意：质谱流式细胞术的操作可能因仪器型号而异。操作前务必查阅CyTOF用户手册。此外，目前JoVE已有两篇关于仪器启动和维护的文章9,11。
<ol>
	<li>在操作质谱流式细胞仪之前，检查雾化器是否存在堵塞、裂纹或其他异常情况。</li>
	<li>将雾化器连接至细胞仪，并开始预热程序。未安装雾化器时，不得启动质谱流式细胞仪。</li>
	<li>质谱流式细胞仪完成预热后，用水冲洗样品管路。喷雾室需升温至约 200 °C 后，方可进行调谐或样品分析。</li>
	<li>用水冲洗 5–10 分钟。5–10 分钟后，加载调谐液并选择调谐管理器。调谐液是含有固定浓度金属的溶液，用于在样品采集前优化质谱流式细胞仪性能。</li>
	<li>在调谐管理器中，当调谐液达到稳定的信号记录状态时，选择 预览，以启动自动调谐过程。</li>
	<li>调谐完成后，将水加载至进样器，并在样品处理期间让水持续流经样品管路。有关质谱流式细胞仪日常操作与调谐的详细方案，请参见 Leipold11。</li>
	<li>有时自动调谐无法使仪器达到最佳性能，可重复调谐步骤以纠正此问题。</li>
	<li>在样品采集前，先用 CSM 洗涤一次，再用纯去离子水洗涤两次。用水洗涤对于去除 PBS/CSM 中残留的盐分至关重要。</li>
	<li>使用制造商提供的平衡微珠（即负载已知金属浓度的聚苯乙烯微珠）检查灵敏度和样品流速。</li>
	<li>将采集模式从调谐模式切换至事件捕获模式。将采集时间上限设为 120 秒。在点击 记录 前，等待 45 秒。</li>
	<li>质谱流式细胞仪将在 120 秒后自动停止样品采集。使用雨滴图查看器检查 Eu151 和 Eu153 的信号强度。</li>
	<li>用纯去离子水按 1:20 的比例稀释平衡微珠。</li>
	<li>在样品采集前检查实验管理器。使用实验管理器为通道命名，并添加需要记录的通道。
	<ol>
		<li>若使用 IdU，需确保已添加 127-I 通道。</li>
		<li>请注意，必须在样品采集前将质谱流式细胞仪设置为检测所需参数（例如 IdU）。若未提前选择通道，则无法采集未选通道的数据，且数据不可恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 1:20 的纯去离子水与平衡微珠混合液，将细胞稀释至浓度约为 1–2 × 106/mL。将细胞通过装有滤膜的 FACS 管过滤，以去除任何残留的细胞团块。</li>
	<li>加载样品并更改采集时间。</li>
	<li>按下 预览，等待每秒事件数稳定。
	<ol>
		<li>每秒事件数不得超过 400 个，否则将产生大量双联体和碎片。我们通常采集至少 20,000 至 50,000 个细胞事件，但最佳数量取决于实验设计。对多达 200 万个细胞进行染色，通常可获得 300,000 至 400,000 个细胞事件。请注意，并非所有事件均为细胞（事件计数中还包括碎片和微珠事件）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品采集完成后，加载清洗液，启动样品进样并运行 5–10 分钟。5–10 分钟后停止样品进样，再用水运行 10–20 分钟。清洗液为低浓度氢氟酸溶液，旨在清除样品管路中残留的金属。</li>
	<li>关闭质谱流式细胞仪并取下雾化器。雾化器温度较高，操作时需小心。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>为了去除微珠并校正样本采集过程中的信号漂移，使用 Fluidigm 软件或 Finck 开发的应用程序对 FCS 文件进行归一化处理12。</li>
	<li>将 FCS 文件上传至 Cytobank 或其他流式细胞术分析软件。FCS 文件可在任何兼容软件中使用，但本实验方案中的所有设门及后续分析均在 Cytobank 中完成13。</li>
	<li>在绘制细胞周期门之前，需排除双联体或细胞碎片，以避免其对下游分析造成干扰。可通过事件长度（Event Length）与 191-Ir 的双变量图进行排除（图 1a）。细胞会形成一个明显且明亮的 Irhigh 单一群体，可用于排除双联体和碎片。此即为单细胞门（singlet gate）。该设门方法通常可去除约 50–60% 的双联体事件，因此可能需要额外策略以进一步清除残留的双联体事件。
	<ol>
		<li>调整事件长度的标度（最小值和最大值），使细胞群体更加突出，便于单细胞设门。</li>
		<li>通过高斯参数（Gaussian parameters）残差（Residual）和偏移量（Offset）进一步去除双联体和碎片。残差较高而偏移量较低的信号也代表碎片和双联体，围绕该群体设门可进一步清除双联体和碎片（图 1b,c）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>S 期设门——S 期是最容易绘制但也是最重要的门。使用 IdU 与 pRb、Ki67 或 cyclinB1 的双变量图进行 S 期门的绘制。在这些双变量图中，S 期 IdU+ 细胞会形成一个明显的群体（图 2b）。</li>
	<li>G0/G1 期和 G2/M 期设门——在 IdU 与 CyclinB1 的图上建立 G0/G1 期和 G2/M 期门，其中 IdU 的掺入对于确定 G0/G1 期与 G2/M 期门之间的边界至关重要。G0/G1 期细胞表现为 CyclinB1low/IdU-，而 G2/M 期细胞表现为 CyclinB1high/IdU-。良好的 CyclinB1 染色会在 G0/G1 和 G2/M 群体之间显示出一个自然的过渡群体；然而，该特征会因实验条件下的样本类型和细胞类型不同而有所变化。在细胞周期分布可能受到影响、CyclinB1 标记的 G0/G1 期与 G2/M 期之间分离不明显的情况下，利用 S 期群体可为特定细胞类型在每次实验中提供一致的设门依据。具体方法如下所述。
	<ol>
		<li>仅将 S 期细胞绘制在 CyclinB1 与 IdU 的图上，以帮助明确 G0/G1 期与 G2/M 期之间的分界。在 CyclinB1high 群体上绘制一个门，并调整至大约 S 期群体顶部的 5% 位于门内（图 2c）。这即确立了 G0/G1 期与 G2/M 期门之间的分界点（图 2e,f）。将活动群体切换为目标群体，位于此前门内的部分即为 G2/M 期群体，其余部分则为 G0/G1 期群体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>G0 期设门——在 pRb 与 IdU 的双变量图上建立 G0 期门。G0 期由 pRblow/IdU- 群体表示。活跃增殖的细胞群体则表现为 pRb 高表达并掺入 IdU，G0 期门可绘制在该边界上，因其通常形成两个明显不同的群体（图 2g,i）。
	<ol>
		<li>通过将先前绘制的 S 期群体（图 2b）设为活动群体，并绘制一个包含 pRbhigh 群体顶部 90–100% 的门来定义 G0 期。此即 pRb+ 增殖群体（图 2i），位于该门之外的 pRblow 群体即为 G0 群体（图 2j）。</li>
		<li>若 pRb 不可用或无法检测，可使用 Ki67 与 IdU 的双变量图来确定 G0 期群体。绘制一个代表大部分 S 期群体的门，并以此门作为 Ki67 与 IdU 图的边界，其余群体即为 G0 期（图 3a）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M 期设门——在 IdU 与 pH3 的双变量图中建立 M 期门。M 期细胞仅占极小比例，通过 pH3high 群体进行设门（图 2d）。</li>
	<li>IdU 掺入失败或不可行——若无法使用 IdU，可通过 Ki67 和 pRb 来定义增殖与非增殖细胞群体。在正常条件下，Ki67 和 pRb 会形成两个明显不同的群体：Ki67high/pRbhigh 和 Ki67low/pRblow。双阳性群体代表活跃增殖细胞，对应于 G1 期、S 期、G2 期和 M 期；双阴性群体代表非增殖细胞，对应于 G0 期（图 3b）。 
	注意：使用 Ki67 与 pRb 无法区分各个具体的细胞周期阶段，但可评估实验处理对增殖与非增殖细胞群体比例的影响。</li>
	<li>细胞周期分析——在完成设门后，导出各门的数值以进行进一步分析。各周期阶段的百分比可通过从联合群体中减去单一群体获得。例如，将 G0 期（基于 pRblowIdUlow 门）的百分比从 G0/G1 期（基于 CyclinB1lowIdUneg 门）中减去，即可得到 G1 期的百分比。类似地，G2 期百分比可通过从 G2/M 期门中减去 M 期门的百分比获得。由此可获得每个独立细胞周期阶段（G0、G1、S、G2 和 M）的数值，这些数值可用于后续分析，如作图和统计学分析。</li>
</ol>

<ol><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li>
<li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li>
<li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).</li>
<li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-Hoechst+flow+cytometry%3A+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li>
<li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).</li>
<li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li>
<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).</li>
<li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li>
<li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li>
<li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).</li>
<li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+procurement%2C+storage%2C+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology%2C+biorepository%2C+and+biobank+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li>
</ol>

Behbehani 博士获得 Fluidigm 提供的差旅资助。Fluidigm 还为实验室采购了试剂和材料。

本文展示的示例说明了如何使用 MCM 平台分析细胞周期分布。同时已证明，细胞周期分析对实验条件（如时间和温度）具有敏感性，这是研究人员在考虑将 MCM 用于细胞周期分析时必须重视的因素14。样本在储存条件下停留较短时间（不超过一小时）时，其 IdU 掺入水平与正常状态相当；而在密闭系统中长时间存放（约两小时）的样本，其 IdU 掺入量会降低，但循环与非循环细胞的比例仍保持不变，因此仍可进行粗略的细胞周期分析。深低温储存及后续的解冻过程会在较长时间内显著干扰正常的细胞周期分布。此前已有报道指出深低温储存会破坏蛋白质和 RNA 的分布，而最近的研究进一步表明其同样会干扰细胞周期14,15,16,17。综上所述，若预计需要长期储存或采用深低温保存样本，则最好在储存或深低温冷冻前先用 IdU 对细胞进行染色，随后固定细胞并保存，直至进行分析。由...

质谱流式细胞术利用质谱技术的高分辨率和定量特性，可实现约40个参数的检测。该技术采用金属标记抗体，取代传统荧光素偶联抗体，从而提供更多的检测通道，并显著减少信号溢出。1,2与流式细胞术相比，质谱流式细胞术（MCM）在细胞周期分析方面具有优势和局限性。MCM 的主要优势在于其能够通过大量参数，同时检测高度异质性样本中多种免疫表型不同的T细胞类型的细胞周期状态。MCM 已成功应用于检测人类骨髓中正常造血过程中的细胞周期状态。3 端粒酶缺陷的转基因小鼠模型4急性髓系白血病（AML）的细胞周期状态分析表明，细胞周期与已知的临床治疗反应相关，为体内功能特征提供了深入见解，有助于指导治疗方案的选择5质谱流式细胞周期分析的第二个优势在于能够同时检测大量其他功能性标志物，这些标志物可能与细胞周期状态相关。近期研究已通过使用碘脱氧尿苷（IdU）以及针对BRU和rRNA的金属标记抗体，实现了蛋白质和RNA合成水平与细胞周期状态之间的关联分析。6这种高度参数化的分析需要在连续分化过程中的多个细胞群体中测量细胞周期状态，而使用当前的流式细胞术技术几乎无法实现。质谱流式细胞术（MCM）的主要缺点是缺乏与荧光流式细胞术中常用的DNA或RNA染料（如DAPI、Hoechst、Pyronin Y等）相类似的染色剂。荧光染料能够相对精确地测量DNA和RNA含量，这种精确性之所以实现，是因为这些染料在插入核苷酸碱基之间时其荧光特性会发生改变。因此，MCM分析无法以同等精度直接测定DNA或RNA含量。相反，质谱流式细胞术的细胞周期分析依赖于对与细胞周期状态相关的蛋白质的检测，例如周期蛋白B1（cyclin B1）、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）和磷酸化组蛋白H3（pHH3），并结合对S期细胞中碘脱氧尿苷（IdU）掺入后所含碘原子的直接测量。这两种测量方法在正常细胞增殖过程中结果高度一致，但在细胞周期进程受到干扰时可能出现差异。
测定各细胞周期时相中的细胞数量，对于理解正常细胞周期发育以及细胞周期紊乱（常见于癌症和免疫系统疾病）具有重要意义。质谱流式细胞术（MCM）利用金属标记抗体可对细胞外和细胞内因子进行可靠检测；然而，由于基于铱的DNA嵌入染料无法区分2N与4N DNA，导致S期的检测受到限制。为明确界定细胞周期各时相，Behbehani开发了一种利用质量为127的碘脱氧尿嘧啶核苷（IdU）的方法，该质量处于质谱流式细胞仪的检测范围内，可直接测定处于S期的细胞3。这种直接检测方法避免了使用二抗或DNA变性试剂（如酸或DNase）的需要。结合细胞内周期标志物，该方法可在实验模型中实现对细胞周期分布的高分辨率分析。
本方案将常规流式细胞术用于MCM的细胞周期检测进行了改进。我们的方法提供了一种便捷且简单的手段，可将细胞周期参数纳入实验分析。体外样本的IdU掺入仅需在37 °C孵育10至15分钟，时间短于大多数BrdU染色方案，后者通常建议孵育数小时3,7。掺入IdU或BrdU的样本可使用蛋白质组稳定剂进行固定，随后可在-80 °C冰箱中长期保存。这使得大量IdU染色样本能够被归档并进行批次分析，且不会降低样本质量。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td>CSM 的组分</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>样品离心</td></tr><tr><td>裂解-PARP（D214）</td><td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>凋亡细胞的鉴定</td></tr><tr><td>细胞周期蛋白 B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 期解析</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>冷冻保护剂</td></tr><tr><td>EQ 四元素校准微球</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>CyTOF 性能的内部金属标准品</td></tr><tr><td>带滤网的 FACS 管</td><td>Corning</td><td>08-771-23</td><td>在 CyTOF 运行前去除细胞团块/碎片的细胞滤器</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>细胞培养生长补充剂</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>CyTOF 系统/平台</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>防止非特异性染色的染色添加剂</td></tr><tr><td>IdU（5-碘-2&amp;prime;-脱氧尿苷）</td><td>Sigma</td><td>I7125</td><td>在 S 期掺入 DNA</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences</td><td>SolA15</td><td>确认 G0/G1 期</td></tr><tr><td>MaxPar 多重标记试剂盒</td><td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>金属标记试剂盒，用于将金属连接至抗体</td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>染色过程中混合样品</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15710</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>五甲基环戊二烯基-铱(III)-二吡啶并菲嗪</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>CyTOF 检测过程中的细胞识别</td></tr><tr><td>p-H2AX（S139）</td><td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>DNA 损伤检测</td></tr><tr><td>p-HH3（S28）</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td><td>M 期解析</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>细胞培养洗涤液及固定液组分</td></tr><tr><td>p-Rb（S807/811）</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td><td>G0/G1 期解析</td></tr><tr><td>蛋白质组稳定剂</td><td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>样品固定剂</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>细胞培养生长培养基</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Acros Organics</td><td>AC447810250</td><td>CSM/抗体缓冲液组分，杀菌剂</td></tr></tbody></table>

利用嘧啶类似物5-碘-2′-脱氧尿苷（idu）与细胞周期标志物结合在质谱流式细胞平台中确定细胞周期时相

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

细胞周期时相的调控是细胞增殖与稳态维持的重要方面。细胞周期调控机制的失调是包括癌症在内的多种疾病的特征之一。对细胞周期的研究需要能够明确界定处于细胞周期各个阶段的细胞数量，并清晰区分各细胞周期时相。质谱流式细胞术（MCM）的出现，通过直接检测元素同位素，为高通量单细胞分析提供了巨大潜力；而建立一种利用MCM测量细胞周期状态的方法，进一步拓展了MCM的应用价值。本文描述了一种在MCM系统中直接检测5-碘-2′-脱氧尿嘧啶核苷（IdU）的方法，其原理类似于5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）。该基于IdU的MCM方法具有多项优势：第一，IdU在DNA合成过程中可快速掺入，因此仅需10–15分钟的孵育即可可靠地检测处于S期的细胞；第二，IdU的检测无需使用二抗或DNA降解步骤；第三，IdU染色可轻松与细胞周期蛋白B1（cyclin B1）、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）以及磷酸化组蛋白H3（pHH3）的检测相结合，从而共同实现对五个细胞周期时相的清晰划分。将这些细胞周期标志物与MCM所能实现的高参数数量相结合，可同时兼容多种其他检测指标。

利用HL-60细胞和人骨髓穿刺液，可以展示实验条件如何影响细胞周期分布及分析。首先，必须建立设门策略，以说明细胞周期各时相是如何确定的。在 图1 我们展示了单细胞门控的建立，该步骤对于分离细胞碎片和双联体细胞、获得单细胞群体至关重要。对于细胞系而言，建立单细胞门控后即可直接进行细胞周期分析。图 2a）。对于人源样本，通常需要在细胞周期分析之前确定免疫表型群体，因为不同细胞类型的各个细胞周期门控边界可能有所不同。一旦确定了目标群体（通常通过设门特定表面标志物来定义该群体），就需要建立相应的细胞周期门控。 图2b 在IdU与CyclinB1双轴图上展示S期的确定方法。该图还用于确定G2/M期门控的边界图 2f）。一旦确立G2/M期，其余部分即为G0/G1期门控（图 2f）。IdU 与 pRb 的比较用于确定 pRb+ 通过建...

本方案将细胞周期检测方法适配于质谱流式细胞技术平台。利用质谱流式细胞技术的多参数检测能力，通过直接测量碘的掺入可识别处于S期的细胞，同时借助细胞内周期标志物，能够在多种实验条件下对各细胞周期时相进行表征。

利用嘧啶类似物5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）与细胞周期标志物结合在质谱流式细胞平台中确定细胞周期时相

细胞周期时相的调控是细胞增殖与稳态维持的重要方面。调控机制的紊乱会影响……

本方案允许我们利用质谱流式细胞仪在单细胞水平上分析细胞周期，从而能够开展多项新颖的研究和临床研究。该技术的主要优势在于其简便性。只需将IdU直接加入细胞中，无需进一步处理或使用抗体。我们已采用该技术研究急性髓系白血病患者中干细胞和祖细胞区室内的细胞周期状态。结果表明，这些特定细胞类型的细胞周期特性可能与患者的临床预后相关。该技术有助于理解稀有癌细胞的生长特性以及免疫细胞亚群的增殖情况。在向细胞样品添加IdU之前和之后，均需将细胞维持在所需的生长条件下。本实验中，使用含5%CO2的湿润化37摄氏度培养箱。为用IdU标记细胞，将浓缩的IdU储存液按1:50的比例稀释至细胞培养基中。随后将样品转移至生物安全柜内，每1毫升细胞悬液中加入10微升1毫摩尔的IdU。将细胞放回培养箱中孵育10至15分钟，然后将样品转移至各自的锥形管中。在15毫升锥形管中通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于每管200 µL的PBS中。如有需要，可使用适当的活/死细胞染料对细胞进行标记，以区分死细胞。经过活/死染色后，用培养基洗涤细胞，再用 CSM 洗涤，随后用 25 微升 16% 多聚甲醛固定细胞。室温孵育 10 分钟后，通过离心收集细胞。加入 5 至 15 毫升 CSM 并再次离心。将沉淀重悬于500微升细胞染色缓冲液中，该缓冲液需添加10%二甲基亚砜。然后将细胞转移至较小的离心管中，于负80摄氏度保存。为标准化细胞周期分析，将文件导入合适的流式细胞术分析软件，并创建事件长度对191铱的双轴图。细胞将形成一个明显明亮的高铱阳性群体。调整事件长度比例，使细胞更突出。然后创建一个单细胞门，以排除50%至60%的双联体和碎片，并设置残余和偏移高斯参数，以去除任何残留的双联体和碎片。为设定S期门控，请创建IdU与增殖标志物的双变量图。S期IdU阳性细胞将形成一个明显的细胞群。对于G0/G1期和G2/M期的门控，应在IdU与Cyclin B1的散点图上设定门控区域。G0/G1 期细胞表现为 Cyclin B1 低表达、IdU 阴性，而 G2/M 期细胞表现为 Cyclin B1 高表达、IdU 阴性。为了圈选特定的细胞类型，可在 Cyclin B1 与 IdU 的散点图上仅绘制 S 期细胞，以帮助区分 G0/G1 期与 G2/M 期细胞。在 Cyclin B1 高表达的细胞群周围绘制门控区域。在某些情况下，这可能难以分辨，但通常以 S 期细胞群中约前 5% 的 Cyclin B1 水平作为 G0/G1 期与 G2/M 期门控之间的分界点。位于此前一门控内的细胞为 G2/M 期细胞群，其余细胞则为 G0/G1 期细胞群。为了确定 G0 期细胞群，需绘制磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（phosphorylated retinoblastoma protein）与 IdU 的散点图。G0 期将表现为磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白水平低、IdU 阴性的细胞群体。由于活跃增殖的细胞群体表现出高磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白水平并掺入 IdU，因此通常可在该边界上圈定 G0 期门控，因为这两群细胞通常表现为明显分离的两个群体。如果 G0 期门控难以界定，可将 S 期细胞群体视为活跃增殖群体，并圈定一个包含磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白高表达群体中前 90% 至 100% 的门控。门控区域外磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白水平较低的细胞群体通常为G0期细胞，而pRb水平落在该门控区域内的G0/G1细胞则为G1期细胞。对于M期细胞的门控，绘制IdU与磷酸化组蛋白H3的轴向散点图。M期细胞表现为磷酸化组蛋白H3阳性群体中极小部分的细胞亚群。G2/M 期细胞群中 pHH3 水平较低的细胞为 G2 期细胞。如果 IdU 掺入失败或无法进行，可使用 Ki67 和磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白来界定增殖和非增殖细胞亚群。双阳性细胞群代表处于活跃增殖状态的细胞，对应于 G1 期、S 期、G2 期和 M 期。双低表达细胞群将代表非增殖细胞群体，对应于G0期。在所有门控设置完成后，导出各门控的数值结果。通过从联合群体中减去单一群体的百分比，可获得各细胞周期时相的百分比数值，用于后续的图表绘制和统计分析。建立单细胞门控对于分离细胞碎片和双联体细胞、从而获得单细胞群体至关重要。随后可对单个细胞进行细胞周期分析。IdU标记及后续的细胞周期分析会显著受到时间和温度的影响。例如，细胞若在密闭容器中停留过久或在转移过程中时间过长，其S期比例会降低，从而导致细胞周期分析结果不准确。细胞样本若仅短暂保存一小时或更短时间，仍可保持正常的细胞周期分布，表明快速转运可能不会对分析产生不利影响。冻存细胞在恢复活跃的细胞周期之前，可能需要较长的平衡期，即便如此，其细胞周期状态仍可能无法真实反映冻存前的原始状态。不同类型的细胞可能对培养条件产生不同的响应。例如，在此份人类骨髓样本中，T细胞的数量较同一样本中的单核母细胞有所减少。质谱流式细胞术的另一优势在于能够区分处于细胞周期阻滞或具有异常细胞周期分布的细胞。该技术的一个主要优势在于，它可轻松与其他质谱流式检测方法兼容，例如表面表型分析、染色质结构分析以及细胞内细胞因子刺激检测，这些均可与细胞周期状态进行关联分析。我们已利用该技术研究了免疫细胞耗竭和细胞衰老，并证明急性白血病患者对化疗的反应可能与白血病细胞的细胞周期特性相关。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用嘧啶类似物5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）和细胞周期标志物在质谱细胞术平台中建立细胞周期期

我们建立了一种策略，用于检测胸苷类似物（CldU和IdU）在成年小鼠组织中的顺序掺入，以量化连续两轮的细胞分裂。该策略适用于检测长寿命组织的细胞更新、致癌转化或过渡性增殖细胞。...

免疫荧光法检测原代组织中的两种胸腺嘧啶类似物（CldU 和 IdU）

通过本方案，利用流式细胞术可轻松测定细胞群体的细胞周期位置，或了解信号如何影响细胞增殖。我们报告了一种简单的实验方法，用于对细胞进行染色并定量分析其在细胞周期中的位置。...

哺乳动物细胞周期位置分析

通过联合使用BrdU对核酸进行代谢标记以及碘化丙啶对总基因组DNA染色，可实现对细胞周期各阶段进展及动力学的细微变化进行追踪。该方法无需对增殖细胞进行化学同步化处理，从而避免了非特异性DNA损伤的引入，进而防止对细胞周期进程造成影响。...

利用代谢标记与流式细胞术测量细胞周期进程动力学

本视频介绍了BrdU免疫荧光染色的实验方案。该技术可用于鉴定细胞周期不同阶段的细胞。通过添加DNA染料和抗体标记，可对S期细胞在后续时间点的命运进行详细分析。...

BrdU免疫荧光染色：一种用于鉴定细胞周期不同阶段细胞的技术

该视频展示了一种基于免疫荧光的方法，用于定量癌细胞中的复制应激。经羟基脲处理的细胞会产生单链DNA，可通过免疫荧光检测。绿色荧光焦点的数量反映了癌细胞中复制应激的水平。...

一种基于免疫荧光的癌症细胞复制应激定量方法

本方案描述了利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入来追踪在特定时间点处于S期的细胞的时序动态。通过添加DNA染料和抗体标记，可对S期细胞在后续时间点的命运进行详细分析。...

利用流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪而无需同步化处理

本文概述了如何研究一种（细胞周期）激酶在线粒体中的定位，以及如何确定其在线粒体内的亚结构定位和潜在的线粒体底物或靶标。将蛋白强制表达于线粒体中，是研究目的蛋白在线粒体定位后所产生功能效应的有效工具。...

研究核细胞周期激酶Cdk1在线粒体定位与功能的实验方法

在本实验方案中，我们演示了如何利用基于免疫荧光的方法，在细胞周期的 S/G2 期可视化 DNA...

利用BrdU-DNA标记联合细胞周期区分成像评估全基因组DNA双链断裂末端切除

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和磷酸化组蛋白H3（pH3）标记进行细胞周期分析是一种多步骤实验流程，可能需要进行大量优化。本文提供了一个详细方案，描述了该流程的全部步骤，包括图像分析和定量方法，以区分处于不同细胞周期阶段的细胞。...

5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸化组蛋白 H3 双标记细胞周期进程分析方案 果蝇 神经干细胞

我们描述了两种互补的实验方案，可准确测定S期持续时间 S. cerevisiae 使用EdU（一种胸苷类似物），其可被掺入 体内...

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

学习使用质谱流式细胞术和IdU标记技术进行单细胞水平细胞周期分析的方法。该技术可直接检测S期细胞，适用于急性髓系白血病等癌症研究，帮助理解稀有癌细胞生长特性及免疫细胞增殖规律。

利用嘧啶类似物5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）与细胞周期标志物结合在质谱流式细胞平台中确定细胞周期时相

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