Name: 海参肠细胞原培养的凋亡诱导与检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学习建立海参Apostichopus japonicus肠细胞原代培养体系，用于海洋无脊椎动物细胞生物学研究。该方案支持长期培养与传代，为海洋生物学实验提供稳定的遗传背景模型。

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作者感谢浙江大学周乃明教授提供的技术指导及其实验室设备的使用许可。本工作受到国家自然科学基金（项目编号 41876154、41606150 和 41406137）以及浙江省高校和科研院所基本科研业务费专项资金［项目编号 2019JZ00007］的资助。

1. 细胞培养基制备
<ol>
	<li>体腔液制备
	<ol>
		<li>体腔液采集：在无菌条件下解剖一只健康的海参（湿重85–105 g），收集体腔液，并将其储存在无菌玻璃瓶中。</li>
		<li>体腔细胞去除：将体腔液分装至50 mL离心管中，在1,700 × g 条件下离心5分钟，将上清液转移至新的无菌玻璃瓶中；随后获得无细胞的海参体腔液。</li>
		<li>补体成分灭活：将含有海参体腔液的无菌玻璃瓶置于40–50 °C水浴中孵育20–40分钟，以获得补体成分灭活的体腔液。</li>
		<li>微生物去除：通过0.22 μm膜过滤器过滤去除细菌和衣原体；接着使用0.1 μm膜过滤器过滤以去除支原体及其他微小颗粒，从而获得体腔液预处理液。</li>
		<li>盐度调节：通过添加20%高浓度预灭菌过滤NaCl溶液（用预处理体腔液稀释）或双蒸水（DDW），将体腔液预处理液的盐度调节至30‰（用盐度计测定）。将海参体腔液转移至无菌瓶中，密封后于4 °C保存，用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leibovitz's L-15细胞培养基优化
	<ol>
		<li>称取5.05 g NaCl、0.135 g KCl、0.15 g CaCl2、0.25 g Na2SO4、0.975 g MgCl2、0.25 g葡萄糖和6.25 mg牛磺酸，溶于50 mL无菌离心管中的40 mL Leibovitz's L-15培养基中。在摇床上震荡1小时，确保盐类完全溶解。</li>
		<li>向先前配制的Leibovitz's L-15培养基中加入2.5 mL L-谷氨酰胺（100 mg/mL）和500 μL VE溶液（1.75 mg/L），再经0.22 μm膜过滤器过滤培养基。</li>
		<li>用新鲜的Leibovitz's L-15培养基补足总体积至500 mL，并加入100 mL先前制备的体腔液；随后用NaOH溶液调节pH至7.6。整个操作过程需保持无菌环境。体腔液的配比可为10%–50%，其中20%适用于A. japonicus肠细胞的培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肠道细胞制备
<ol>
	<li>海参肠道处理
	<ol>
		<li>将健康的海参置于冰盒中进行麻醉。解剖并采集前端肠道，然后将组织样本纵向切开，并清除内部内容物。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织样本两次，并将其浸入75%（体积分数）的乙醇水溶液中消毒，时间不超过2秒。</li>
		<li>用PBS清洗组织样本三次以去除乙醇残留，然后将约100 mg的组织样本转移至一个2.0 mL无菌微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞收集
	<ol>
		<li>向海参肠组织块中加入1.5 mL预优化培养基，用灭菌手术剪将组织剪碎，直至溶液变浑浊。 
		注：对于可选的简化方案，向海参肠组织块中加入0.5 mL预优化培养基，用灭菌手术剪将组织切成约1 mm3大小，直接将组织转移至培养皿中，随后进行培养步骤。</li>
		<li>加入400 μL胰蛋白酶（0.25%），通过轻柔颠倒混匀，室温孵育5分钟，然后使用100 μm细胞筛过滤溶液。 
		注：在处理不同组织样本时，是否添加胰蛋白酶进行细胞分散为可选步骤。胰蛋白酶溶液中应含有乙二胺四乙酸（EDTA），以降低培养基中Ca2+和Mg2+的抑制作用。</li>
		<li>将滤液收集至新的无菌2.0 mL微量离心管中，在1,700 × g 条件下离心3分钟，弃去上清液，然后将沉淀重悬于含抗生素的培养基中，并清洗两次。 
		注：实验开始前，需新鲜配制添加了2%青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL青霉素和10 mg/mL链霉素）以及1%庆大霉素（4 mg/mL）的预优化培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞培养
<ol>
	<li>培养箱预设：为细胞培养预先设置培养箱，并提前至少运行24小时，温度设为18 °C，湿度保持饱和。 
	注意：根据细胞培养基的性质向培养箱中通入CO2；使用Leibovitz's L-15基础培养基时无需供应CO2。</li>
	<li>第一阶段细胞培养
	<ol>
		<li>为抑制微生物生长并促进细胞培养初期的增殖，每500 mL预优化培养基中加入10 mL青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL青霉素和10 mg/mL链霉素）以及0.5 mL庆大霉素（40 mg/mL）。此外，每500 mL培养基中补充0.6 mL胰岛素（10 mg/mL）、100 μL胰岛素样生长因子（0.1 μg/μL）和25 μL成纤维细胞生长因子（0.1 μg/μL）。</li>
		<li>将细胞收集至1.5 mL离心管中，用200 μL指定培养基重悬，移液至φ 4 cm培养皿中。</li>
		<li>将细胞置于培养箱中培养，6小时后向培养皿中加入2.0 mL指定培养基。每12小时更换一半培养基，直至进入下一阶段。 
		注意：更换培养基时操作应轻柔，因为细胞与培养皿的贴附不牢固。可使用聚-D-赖氨酸包被的培养皿以促进细胞松散贴附。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二阶段细胞培养
	<ol>
		<li>为减少抗生素对培养细胞的不利影响，将培养基中指定抗生素（青霉素、链霉素和庆大霉素）的浓度减半。 
		注意：胰岛素和生长因子的使用取决于细胞培养条件，为可选步骤。</li>
		<li>更换细胞培养基；根据细胞密度每两到三天更换一次培养基。 
		注意：每天在显微镜下观察培养细胞，并记录其生长状况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞传代 
	注意：当原代细胞密度达到60%时进行传代和继代培养。
	<ol>
		<li>用室温PBS洗涤培养细胞两次。每皿加入200 μL胰蛋白酶溶液（0.25%），手动轻轻晃动培养皿，确保溶液覆盖整个底部。弃去胰蛋白酶溶液，于室温下孵育5分钟。</li>
		<li>用1.0 mL新鲜培养基吹打洗涤并重悬细胞。将0.5 mL细胞悬液转移至新培养皿中，加入1.5 mL新鲜培养基，在18 °C下继续孵育。 
		注意：当胰蛋白酶溶液无法有效消化并使细胞从培养皿上脱落时（某些细胞系黏附性过强），可使用细胞刮刀收集细胞。但不可同时使用两种方法。</li>
		<li>12小时后更换培养基，并在显微镜下观察细胞以评估状态。继续培养细胞用于后续实验分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞凋亡诱导与检测 A. japonicus 肠细胞
<ol>
	<li>细胞培养与地塞米松处理
	<ol>
		<li>按照先前介绍的方案制备肠细胞，并将细胞以每孔2 × 10⁵个细胞的密度逐滴加入12孔板中6 每孔</li>
		<li>培养三天后，按照以下步骤进行 &#34;第一阶段细胞培养&#34;用 PBS 洗涤细胞三次，然后将培养基更换为优化培养基（不含抗生素和生长因子）。</li>
		<li>在开始实验前，用培养基稀释地塞米松（DXMS），配制新鲜的2 μM和200 μM DXMS溶液。</li>
		<li>将不同浓度的DXMS溶液加入培养基体积相同的培养细胞中；设置三个实验组，包括对照组（CTL）、1 μM DXMS组和100 μM DXMS组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoechst 染色 
	<ol>
		<li>孵育指定时间（0 h、24 h 和 48 h）有/无 DXMS 后，用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
		<li>向12孔板的每个孔中加入300 μL Hoechst 33258溶液，在18 °C孵育30分钟。轻轻振荡培养板，确保溶液覆盖所有细胞，使其充分染色。</li>
		<li>吸除Hoechst染色液，每孔加入300 μL 4%多聚甲醛溶液（溶于PBS中）固定细胞，室温轻柔振荡15分钟。 
		警告： 聚甲醛通过皮肤接触或吸入具有中等毒性，且被列为可能的人类致癌物。在称量和操作聚甲醛时，应使用化学通风橱、带通风的天平罩或其他防护措施。</li>
		<li>用 PBS 洗涤固定后的细胞三次。每次洗涤后不要弃去 PBS，以保持细胞始终被液体覆盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光显微镜分析
	<ol>
		<li>打开荧光显微镜硬件，包括汞灯电源、荧光光源电源和计算机。登录操作系统账户，启动软件并检查其配置。</li>
		<li>将准备好的样品板放置在显微镜载物台上。使用载物台控制器将样品移至物镜上方。</li>
		<li>在光学显微镜下找到目标细胞，切换至荧光显微镜，通过调整参数采集图像。 
		注意：为了观察与细胞核DNA结合的Hoechst 33258荧光信号，应使用荧光显微镜进行检测，激发波长和发射波长分别约为352 nm和461 nm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone%2C+Haliotis+rufescens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Marine+Biology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li>
<li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins%3A+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860(2015).</li>
<li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Genomics%22%5BJournal%5D)">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718(2016).</li>
<li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+%28Lamarck%2C+1816%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li>
<li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li>
<li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance%3A+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790(2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+D%3A+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li>
<li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29+during+aestivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li>
<li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%3A+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+biology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li>
<li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+invertebrate+cell+culture%3A+a+decade+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li>
<li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220(2018).</li>
<li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture%3A+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li>
<li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li>
<li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Excli+Journal%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+proliferation%2C+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li>
<li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li>
<li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+long-term%2C+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li>
<li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+marine+invertebrates%3A+new+insights+for+capturing+endless+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li>
<li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近几十年来，人们投入了大量研究努力以建立细胞系，然而，海洋无脊椎动物细胞的长期培养仍然难以取得进展14,22。已有报道称，来自再生海参组织的培养细胞可长期存活，并可在特定细胞中检测到较高的增殖活性17,23。然而，对于正常的海洋无脊椎动物细胞，目前尚未见任何实用的细胞培养方法被报道。本文所介绍的方案为来自海洋无脊椎动物物种 A. japonicus 的肠细胞的培养与传代提供了一种高效且易于理解的方法。该方法可轻松适用于多种不同海洋无脊椎动物（如乌贼和螃蟹）的原代细胞培养。
一系列关键因素影响着该实验方法的成功应用。在整个操作过程中，尤其是培养的第一周，防止微生物污染至关重要。水生动物通常会接触来自环境中的多种微生物，这些微生物会定植于其组织中，如鳃、肠道、鳍和皮肤。因此，在细胞培养开始前对组织样本进行彻底灭菌是不可行的。为了最大限度...

在人工控制条件下而非自然环境中培养细胞，可为生物学研究提供均一的实验材料，尤其适用于难以在实验室环境中培养的物种。海洋无脊椎动物占所有动物物种的30%以上1，并为研究特定生物学过程（如再生2,3、应激反应4和环境适应5,6）的调控机制提供了丰富的生物材料。
海参Apostichopus japonicus 是北太平洋沿岸温带水域中研究最为广泛的棘皮动物物种之一。该物种是重要的经济物种，在东亚地区，尤其是中国，已实现大规模海水养殖7。关于A. japonicus 的众多科学问题，包括自溶后肠道再生的调控机制8、夏眠过程中的退化机制9、代谢调控10,11，以及在热应激或病原体胁迫条件下的免疫应答12,13，均引起了科研人员的广泛关注。然而，与已被深入研究的模式动物相比，针对该物种的基础研究，尤其是在细胞水平上的研究，仍受限于技术瓶颈，例如缺乏先进的细胞培养方法。
研究人员在建立细胞系方面投入了大量努力，但也面临诸多挑战，目前尚未成功建立任何海洋无脊椎动物的细胞系14。然而，近几十年来，海洋无脊椎动物的原代细胞培养已取得进展15,16，为在细胞水平上开展实验研究提供了可能。例如，已利用刺参（A. japonicus）再生的肠道作为细胞来源，建立了长期细胞培养体系，为海洋无脊椎动物的原代细胞培养提供了一种实用方法17。本实验方案整合并优化了无脊椎动物细胞培养技术，建立了一种适用于海参或其他海洋无脊椎动物的通用型原代培养方法。
细胞凋亡是由多种外源性和内源性刺激触发的一种内在的细胞自我毁灭程序。协调有序的细胞凋亡对许多生物系统至关重要18,19，并且已被证实参与海参在夏眠期间的肠道退化过程9。为了研究目标生物中的细胞凋亡过程，已建立并成功应用了一系列方法，包括Hoechst染色和显微镜检测技术20。本文中，我们对海参原代培养的肠细胞进行了细胞凋亡诱导与检测，以评估原代细胞在海洋无脊椎动物生物学研究中的可用性。使用地塞米松（一种常用的合成糖皮质激素21）诱导海参原代肠细胞发生凋亡，并通过荧光显微镜在染色细胞中成功检测到显著的Hoechst 33258信号。

<table><tbody><tr><td>0.1 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>4 cm 培养皿</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0124</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛溶液</td><td>国药集团化学试剂</td><td>80096618</td><td>溶于 PBS</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>BeyoClick EdU-488 试剂盒</td><td>碧云天</td><td>C0071S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10005817</td><td></td></tr><tr><td>恒温培养箱</td><td>Lucky Riptile</td><td>HN-3</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>国药集团化学试剂</td><td>XW00500221</td><td></td></tr><tr><td>电热恒温水浴锅</td><td>senxin17</td><td>DK-S28</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>国药集团化学试剂</td><td>80176961</td><td>75%</td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子（FGF）</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica DMI3000B</td><td>DMI3000B</td><td></td></tr><tr><td>加雷霉素</td><td>国药集团化学试剂</td><td>XW14054101</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>国药集团化学试剂</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33258 染色液</td><td>碧云天</td><td>C1017</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>国药集团化学试剂</td><td>XW1106168001</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素样生长因子（IGF）</td><td>PEPROTECH</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基</td><td>Genom</td><td>GNM41300</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（100 mg/mL）</td><td>Genom</td><td>GNM-21051</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>国药集团化学试剂</td><td>XW77863031</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10020518</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10019308</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH 7.2–7.4</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Genom</td><td>GNM15140</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Bante</td><td>A120</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>SIGMA</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>VE</td><td>Seebio</td><td>185791</td><td></td></tr></tbody></table>

海参肠细胞原代培养中的细胞凋亡诱导与检测

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

原代培养细胞作为评估生物物质功能或表征特定生物活性的重要工具，被广泛应用于多种科学研究领域。然而，由于缺乏普适性的细胞培养基和标准化的培养方案，目前针对海洋生物的细胞培养方法仍较为有限。同时，海洋无脊椎动物细胞常出现的微生物污染问题及其多向分化特性，进一步阻碍了海洋无脊椎动物有效细胞培养策略的建立。本文介绍了一种易于操作的海参Apostichopus japonicus肠道细胞的培养方法，并提供了原代培养肠道细胞体外诱导与检测凋亡的实例。此外，本实验详细说明了适宜的培养基配方和细胞收集方法。该方案适用于多种常见海洋生物组织样本，包括棘皮动物门、软体动物门和甲壳动物亚门，可为多种体外实验应用提供足量细胞。该技术将有助于研究人员高效地操控海洋无脊椎动物原代细胞，进而促进对靶向生物材料在细胞水平上的功能评估。

本研究建立了A. japonicus的原代肠细胞培养体系并进行了细胞传代。图1展示了培养不同阶段的圆形细胞。EdU染色实验提供了直接证据，表明这些圆形细胞在培养后期具有增殖活性（图2）。我们还对实验方案进行了微调，改为培养剪碎的组织块而非过滤后的细胞；此外，成功培养出一种纺锤形细胞。该细胞类型出现在肠组织块周围，培养四天后即可观察到；然而，此类细胞未能成功传代（图3）。
培养的细胞可用于不同的生物学实验应用。我们用DXMS处理细胞不同时间，随后用Hoechst 33258染色检测凋亡细胞。图4显示了通过Hoechst 33258染色和荧光显微镜检测到的海参肠细胞中诱导产生的凋亡信号。图5展示了在DXMS刺激下，指定时间段内的细胞凋亡率。
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本方案提供了一种易于操作的方法，用于培养来自海参Apostichopus japonicus的肠细胞，并且适用于多种海洋生物组织样本，包括棘皮动物门、软体动物门和甲壳动物门。

原代培养细胞被广泛应用于多种科学领域，作为评估生物学功能的重要工具……

该方案提供了一种易于操作且广泛适用的海洋无脊椎动物原代细胞培养方法。该技术使研究人员能够相对长期地培养海洋无脊椎动物细胞。在海洋生物学研究中，为满足多种后续生物学实验应用的需求，细胞培养应提供一致的遗传背景。针对该领域的最新研究，我们认为上述简化后的实验方案是值得采用的优选方法。麻醉后，解剖并取出前段肠道，将组织样本垂直切开，并清除内部内容物。用 PBS 清洗组织样本两次，随后将其浸入 75% 乙醇溶液中消毒，浸泡时间不得超过两秒。然后用 PBS 清洗组织样本三次，以去除乙醇，并将约 100 毫克的组织样本转移至一个 2 毫升无菌微量离心管中。向海参肠道组织块中加入 1.5 毫升预优化的培养基，用灭菌的手术剪将组织块剪碎，直至溶液变浑浊。加入 400 微升 0.25% 胰蛋白酶。将溶液轻轻颠倒混匀，并在室温下孵育五分钟。随后使用100微米细胞滤网过滤溶液，将滤液收集至新的无菌2毫升微量离心管中。对于可选的简化操作步骤，可在培养基中切割的组织块直接转移至培养皿中，随后进行孵育。将离心管在1700×g下离心3分钟，弃去上清液，然后用含抗生素的培养基重悬沉淀，并用培养基洗涤两次。预先设定细胞培养用的培养箱，在18摄氏度及饱和湿度条件下提前运行至少24小时。随后用200微升指定培养基重悬细胞，并将其转移至4厘米培养皿中。将细胞置于培养箱中培养。六小时后，从培养箱中取出细胞，并向细胞培养皿中加入2 mL指定的培养基。每隔12小时更换一半的培养基。培养五到七天后，细胞开始分裂。将培养基中指定的抗生素（青霉素、链霉素和庆大霉素）浓度减半，以降低抗生素的不良影响。每两到三天更换一次细胞培养基。当原代细胞密度达到60%时，进行细胞传代。首先，在室温下用PBS洗涤培养的细胞两次。每皿加入200微升0.25%胰蛋白酶溶液，并手动轻轻晃动培养皿，确保溶液完全覆盖皿底。弃去胰蛋白酶溶液，在室温下将细胞孵育五分钟。用一毫升新鲜培养基通过移液洗涤细胞并重新悬浮。将0.5毫升细胞悬液转移至新的培养皿中。加入 1.5 毫升新鲜培养基，将细胞在 18 摄氏度条件下孵育。12 小时后更换培养基，在显微镜下观察细胞以评估状态。设置三个实验组，包括一个对照组和两个处理组，分别含有 1 微摩尔和 100 微摩尔的二甲沙龙（deximethazone）。在加入或不加入地塞米松于0、24或48小时后，用PBS洗涤细胞三次。关闭光源后，向12孔板每孔加入300微升Hoechst 33258溶液，并轻轻振荡培养板，使所有细胞均被覆盖，确保染色充分。于18°C孵育30分钟。然后去除 Hoechst 染色液，并通过向每个孔中加入 300 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液来固定细胞，轻轻振荡 15 分钟。随后，用 PBS 洗涤固定后的细胞 3 次。最后一次洗涤后保留 PBS，以保持细胞被液体覆盖。打开荧光显

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

海参肠细胞原培养的凋亡诱导与检测

我们介绍一种简单的方法，利用一种高溶解性的染料LysoTracker，对小鼠胚胎以及分化中的胚胎干细胞（ES细胞）培养物中程序性细胞死亡（PCD）的区域进行可视化观察。...

利用LysoTracker检测胚胎及分化中的胚胎干细胞的程序性细胞死亡

“anastasis”一词指的是濒死细胞在细胞自杀过程的晚期逆转该过程，自我修复并最终存活下来的现象。本文中，我们展示了检测和追踪经历anastasis细胞的实验方案。...

追踪复生现象的策略：一种逆转细胞凋亡的细胞存活现象

本文介绍了一种用于检测活细胞与邻近死亡或濒死细胞发生物理相互作用后所诱导的细胞内信号转导事件的实验方案。该方案侧重于由受体介导的对死亡细胞识别所引发的信号事件，而非对死亡细胞的吞噬摄取或可溶性介质的释放。...

通过与正在经历凋亡性细胞死亡的邻近细胞相互作用，在活细胞中诱导的细胞内信号事件的鉴定

我们在此描述一种使用分散的胚胎细胞的吞噬作用检测方法 果蝇能够使我们方便而精确地进行定量分析 体内...

Drosophila 胚胎中凋亡细胞的吞噬作用检测

胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对于维持机体稳态至关重要，该过程依赖于一系列受体和信号通路，以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。...

通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

建立了一种利用流式细胞术或差速离心的实验流程，用于从凋亡样本中高纯度地检测、定量和分离凋亡小体。...

高纯度凋亡小体的检测与分离

我们在此描述一种用于研究预先激活的CD8细胞毒性的实验方案+ 通过检测凋亡的癌细胞来识别针对癌细胞的T细胞 通过 实时显微镜技术。该方案可用于研究髓系细胞诱导的T细胞抑制机制，并评估旨在恢复T细胞功能的化合物 通过...

实时检测CD8+ T细胞诱导的体外肿瘤细胞凋亡以研究肿瘤浸润性髓系细胞的免疫抑制功能

本文介绍了一种制备凋亡胸腺细胞和腹腔巨噬细胞的方案，并分析了胞葬作用的效率以及特异性抑制剂介导的对凋亡胸腺细胞吞噬的阻断效果。该方案可广泛应用于细胞介导的其他颗粒清除研究，包括人工微球和细菌等。...

巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的实验分析

本方案采用流式细胞术定量培养的小鼠肠类器官中增殖细胞和死亡细胞的数量。该方法有助于评估药物处理对类器官增殖和存活的影响。...

类肠体中增殖细胞与死亡细胞的定量分析

细胞凋亡可通过流式细胞术分析早期和晚期凋亡生物标志物来表征。本研究使用台式流式细胞仪，检测经放线菌素D处理后宫颈癌细胞系SiHa的凋亡相关生物标志物。...

放线菌素D处理的SiHa宫颈癌细胞中凋亡生物标志物的流式细胞术分析

本方案描述了一种简单且经济高效的方法，用于研究和量化人结肠类器官在细胞毒性干扰物（如细胞因子）作用下的细胞死亡。该方法采用荧光细胞死亡染料（SYTOX Green...

利用活细胞荧光显微镜定量人结肠类器官中细胞因子诱导的细胞死亡

学习建立海参Apostichopus japonicus肠细胞原代培养体系，用于海洋无脊椎动物细胞生物学研究。该方案支持长期培养与传代，为海洋生物学实验提供稳定的遗传背景模型。

海参肠细胞原代培养中的细胞凋亡诱导与检测

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