Name: 冠状血管生成体模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学习冠状血管生成体模型用于心血管生物学研究，利用小鼠胚胎心脏组织外植体培养技术。该方法通过VEGF-A处理模拟体内血管生成过程，为研究冠状动脉发育机制提供可靠的体外实验平台。

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作者感谢Sharma实验室的成员提供了支持性的研究环境。我们特别感谢Diane (Dee) R. Hoffman，她负责维护和照料我们的小鼠种群。我们还要感谢Philip J. Smaldino博士和Carolyn Vann博士对稿件进行了仔细的校对，并提出了有益的建议。本研究得到了鲍尔州立大学教务长办公室和生物学系向B.S.提供的资金、印第安纳科学院高级研究资助向B.S.提供的资助，以及美国国立卫生研究院（RO1-HL128503）和纽约干细胞基金会向K.R.提供的资助支持。

本方案中所有动物的使用均遵循鲍尔州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导原则。
1. 建立小鼠繁殖对并检测阴道栓以确定定时妊娠
<ol>
	<li>设置一个用于小鼠繁殖的笼子，放入野生型雄性和雌性小鼠。确保繁殖用小鼠的年龄在6至8周之间。可采用配对方式（1只雄性与1只雌性）或三只组合方式（1只雄性与2只雌性）进行繁殖。</li>
	<li>次日早晨检查阴道栓。使用斜面金属探针插入阴道开口，以检测深部栓塞。将发现阳性阴道栓的当天早晨定为胚胎发育0.5天（e0.5）。 
	注意：阴道栓可分为表浅型（易于观察，见图1）和深部型（不易观察）。若存在深部栓塞，探针无法完全插入；若无栓塞，则探针可无阻力地完全插入。</li>
	<li>维持定时妊娠，直至胚胎发育至e11.5阶段，随后进行胚胎采集。在采集胚胎前，为确认是否妊娠，应在e7.5至e11.5期间记录雌性小鼠的体重变化。 
	注意：母鼠体重每日增加表明妊娠成功，而体重无变化则提示妊娠失败。</li>
</ol>
2. 从怀孕小鼠中采集胚胎
注意：开始前，请确保备齐以下仪器和试剂：CO2 安乐死舱、70% 乙醇、纸巾、普通镊子、精细镊子、剪刀、1× 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）、10 cm 无菌培养皿、装有冰的容器、带孔勺子、解剖体视显微镜。
<ol>
	<li>将一只妊娠11.5天的小鼠放入洁净的CO2安乐死舱中以实施安乐死。关闭舱盖，防止小鼠逃出。</li>
	<li>将小鼠固定于安乐死舱内后，开启CO2，并根据IACUC建议调节CO2流速（即每分钟10-30%的舱体置换率）。待小鼠完全安乐死后，实施颈椎脱位以确认死亡。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠体表。用镊子提起腹部皮肤，使用剪刀做一小切口，并向两侧延伸切口。向前扩大切口至膈肌处，暴露含有胚胎的子宫角（图2）。</li>
	<li>抓住子宫，将胚胎串（子宫角+胚胎）拉出并剪下。将胚胎串置于冰上预冷的无菌1×PBS中。</li>
	<li>在体视显微镜下，逐个剥离子宫肌层、卵黄囊和羊膜，将单个胚胎从子宫角中分离出来（图3A-F）。使用带孔小勺将清理后的胚胎转移至盛有冰上预冷无菌1×PBS的培养皿中。注意保持胚胎处于低温状态。</li>
</ol>
3. 从 e11.5 胚胎中分离心脏
注意：开始之前，请确保准备好以下仪器和试剂：普通镊子、精细镊子、1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）、10 cm无菌培养皿、6 cm无菌培养皿、装有冰块的容器、带孔勺子、解剖体视显微镜。
<ol>
	<li>在体视显微镜下，准备一个新的培养皿，其中加入冰冷的无菌1×PBS。将步骤2.5中的胚胎转移至该培养皿中，以分离心脏。</li>
	<li>使用镊子去除胚胎的头部。首先用一只手的镊子夹住头部，然后用另一只手以闭合的镊子刮除头部（图4A-C）。</li>
	<li>去除头部后，用一只手以镊子夹住胚胎腹部，使其腹侧朝上定位（图4D）。</li>
	<li>用另一只手打开胚胎的胸壁：首先用精细镊子在膈肌稍上方的胸部做一小切口；然后将闭合的镊子插入切口，通过张开镊子小心地撕开胸壁。注意不要插入过深，以免损伤心脏。借助镊子将胸壁充分撑开，以暴露胸腔内的心脏和肺（图4E）。</li>
	<li>使用精细镊子，轻轻地将心脏向前（90°）移动，暴露背主动脉/静脉。在心脏基底部夹住背主动脉/静脉，将心脏/肺组织向前拉出（图4F-H）。 
	注意：拉出心脏/肺组织时动作要轻柔，避免撕裂位于心脏背侧的静脉导管（SV）。</li>
	<li>用冷的1×PBS冲洗心脏/肺组织，以去除血细胞。</li>
	<li>重复步骤3.1–3.6，从其余胚胎中取出心脏/肺组织。确保将分离的心脏/肺组织置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 从 e11.5 胚胎小鼠心脏中分离 SV 和心室
<ol>
	<li>将步骤3.7中获得的心脏/肺组织置于体视显微镜下，以分离静脉窦（SV）和完整心室。使用精细镊子从根部逐个剥离附着的肺叶。</li>
	<li>将心脏背侧朝上放置，去除心房以及SV前方周围相邻的组织，注意不要撕破SV。用镊子夹住左、右心房基部，用精细镊子刮除心房组织（图5B）。采用类似方法去除SV周围相邻的组织（图5C）。 
	注意：右心房与SV相连，操作时需小心，仅去除心房组织。</li>
	<li>为分离SV，首先将心脏背侧朝上放置（因为SV位于心脏背侧），用镊子轻轻夹住心室以固定心脏，保持其位置稳定。 
	注意：SV是胚胎心脏的流入道结构，位于心脏背侧两心房之间。</li>
	<li>通过精细镊子小心剥离SV与其附着部位的连接，或用精细镊子夹住SV附着基部，闭合镊子轻轻刮下SV（图5D,E）。</li>
	<li>使用无菌转移移液管将分离的SV转移至一个新的6 cm培养皿中，该培养皿内含有预冷的无菌1×PBS并置于冰上，并将培养皿标记为“SV”。</li>
	<li>为分离完整心室，在去除SV后，从心脏上移除流出道（主动脉和肺动脉干）（图5F,G）。</li>
	<li>使用无菌转移移液管将完整心室转移至另一个含有预冷无菌1×PBS并置于冰上的6 cm培养皿中，并将培养皿标记为“心室”。将分离的SV和心室均保持在冰上。</li>
	<li>重复步骤4.1–4.7，从其余心脏中分离SV和心室。</li>
</ol>
5. 使用插入物和细胞外基质包被设置组织培养板
注意：实验开始前，请确保备有以下仪器和试剂：商用细胞外基质溶液（ECM；例如 Matrigel）、8.0 µM 聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）培养小室、24 孔板、37 °C、5% CO2 培养箱。
<ol>
	<li>将ECM溶液置于冰上解冻。保持ECM溶液处于冰上，以防止其凝固。</li>
	<li>将PET膜培养插件（孔径 = 8.0 µm，过滤面积 = 0.3 cm2，滤膜直径 = 6.5 mm）放入未经组织培养处理的24孔板的孔中。根据实验类型，将用于SV或心室内膜血管生成实验的孔板分别标记为SV或心室。 
	注意：若同时进行SV和心室的培养，应将插件分别设置在不同的孔板中。确保设置足够数量的孔以容纳所有实验样本和对照组。</li>
	<li>ECM溶液解冻后，立即用预冷的基础培养基（例如EBM-2基础培养基，参见材料表）将其按1:2比例稀释至所需体积（100 µL/插件 × 插件数量）。 
	注意：例如，若有6个插件，则总体积为100 µL × 6 = 600 µL。将200 µL ECM加入400 µL基础培养基中。</li>
	<li>通过直接将100 µL新鲜稀释的ECM加至膜表面，对插件进行包被。将孔板在37 °C孵育至少30分钟，以使ECM凝固。 
	注意：此操作必须在层流组织培养罩内进行，以避免污染。</li>
</ol>
6. 神经鞘膜细胞与完整脑室培养
注意：实验开始前，请确保备齐以下仪器和试剂：70% 乙醇、移液管、体视显微镜、镊子、层流组织培养罩、微血管内皮细胞补充剂试剂盒（材料表）、基础培养基、1× 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。图6 展示了静脉（SV）和心室培养的工作流程。
<ol>
	<li>将补充剂试剂盒中的内容物置于冰上解冻。在经认证的超净台内，将补充剂试剂盒中的全部组分加入500 mL基础培养基中，配制完全培养基。充分混匀后，分装成每份50 mL。</li>
	<li>用70%乙醇对体视显微镜底座及周围操作区域进行消毒。</li>
	<li>取步骤5.4中的组织培养板。借助移液管，小心地将步骤4.7中的组织块转移至插入膜表面。在体视显微镜下，使用洁净的镊子将组织块置于插入膜中央，确保其未卡在插入膜的角落或附着于侧壁上。</li>
	<li>待组织块放置并居中后，小心移除插入膜中多余的PBS，并盖上培养板盖。</li>
	<li>在超净台内，向插入膜上方加入100 µL预热的完全培养基，向孔中加入200 µL培养基，以在气液界面条件下培养组织块，使插入膜的基底面接触培养基，而顶面暴露于空气中。 
	注意：若使用不同规格的插入膜或孔板，请调整体积以确保形成气液界面。</li>
	<li>向24孔板中未使用的孔内加入300 µL PBS，并盖上盖子。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，培养5天。</li>
	<li>在后续几天中，定期在倒置光学显微镜下观察培养物，评估组织块培养状态。确保组织块呈现节律性收缩，并且所有组织块均附着在含有细胞外基质（ECM）的膜底部。记录任何漂浮的组织块。 
	注意：组织块的周期性收缩表明其具有活性。漂浮的组织块应从分析中剔除。</li>
	<li>评估培养状态后，将培养板放回培养箱，继续培养至最多5天。</li>
</ol>
7. 使用 VEGF-A 处理细胞培养物（阳性对照）
注意：实验开始前，请确保准备好以下仪器和试剂：超净台、1× PBS、含1%胎牛血清（FBS）的基础培养基、含VEGF-A的基础培养基、移液器及移液器吸头。
<ol>
	<li>配制基础培养基 + 1% FBS 和基础培养基 + VEGF-A。
	<ol>
		<li>配制基础培养基 + 1% FBS 时，首先确定所需对照孔的数量。例如，若有 3 个对照孔，则所需总体积为 300 µL/孔 × 3 = 900 µL。将 9 µL FBS 加入 891 µL 基础培养基中，制成基础培养基 + 1% FBS。</li>
		<li>配制基础培养基 + VEGF-A 时，首先确定需要添加 VEGF-A 培养基的总孔数。若有 3 个孔，则总体积为 300 µL/孔 × 3 = 900 µL，VEGF-A 总量为 50 ng/孔 × 3 = 150 ng。将 150 ng VEGF-A 加入 900 µL 基础培养基中，制成基础培养基 + VEGF-A。 
		注意：配制时应按比计算量更大的体积进行，以确保每次实验有足够的小份 aliquot 使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 2 天，从两个腔室（插入物和孔）中移除培养基。用 300 µL 1× PBS 洗涤培养物，向插入物中加入 100 µL，向孔中加入 200 µL。轻轻振荡培养板数次，然后移除 PBS。</li>
	<li>向每个孔中加入 300 µL 基础培养基 + 1% FBS（100 µL 加入插入物，200 µL 加入孔中），使细胞饥饿培养 24 小时。</li>
	<li>第 3 天饥饿处理后，分别向对照孔中加入 300 µL 基础培养基 + 1% FBS（100 µL 加入插入物，200 µL 加入孔中），向处理孔中加入基础培养基 + VEGF-A（50 ng/孔）。</li>
	<li>处理完成后，继续将培养物置于培养箱中培养。</li>
</ol>
8. 固定与免疫染色
注意：开始之前，请确保备有以下仪器和试剂：4% 多聚甲醛（PFA）、1× PBS、一抗和二抗、摇床、含 0.5% 非离子去污剂的 PBS 缓冲液（PBT）。
<ol>
	<li>培养第6天，移除培养基，并在室温（RT）下用1×PBS洗涤培养物。
	<ol>
		<li>向孔中加入200 µL 4% PFA溶液，向插入物中加入100 µL，进行固定。在4 °C条件下轻轻摇动固定20分钟。</li>
		<li>固定20分钟后，在通风橱中移除PFA，通过向孔中加入200 µL 1×PBS、向插入物中加入100 µL进行洗涤。</li>
		<li>重复洗涤3次，每次10分钟，同时轻轻摇动。随后进行免疫染色。 
		注意：所有洗涤步骤均在室温下于实验台进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一抗（抗VE-钙黏蛋白抗体、抗ERG 1/2/3抗体）用封闭液（5%驴血清，0.5% PBT）稀释。加入300 µL一抗溶液（底部孔中200 µL，插入物中100 µL）。在4 °C条件下轻轻摇动孵育过夜。 
	注意：抗VE-钙黏蛋白抗体用于标记内皮细胞膜，抗ERG 1/2/3抗体用于标记内皮细胞核，以便观察内皮细胞的血管生成出芽结构。</li>
	<li>次日，用0.5% PBT对培养板进行洗涤并轻轻摇动，共洗涤10次，每10分钟更换一次PBT。</li>
	<li>将二抗（驴抗大鼠Alexa Fluor 488和驴抗兔Alexa Fluor 555）用封闭液稀释。按照步骤8.2的方法加入300 µL二抗溶液，并在4 °C条件下轻轻摇动孵育过夜。次日，用PBT洗涤二抗10次，每10分钟更换一次PBT。 
	注意：至少洗涤10次，更多次洗涤效果更佳。洗涤完成后，培养物可用1×PBS保存，直至封片。</li>
</ol>
9. 将培养物固定于载玻片、成像与分析
注意：实验开始前，请确保准备好以下仪器和试剂：精细镊子、载玻片、含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂、盖玻片和共聚焦显微镜。在完成二抗染色后，按照以下步骤将样品接种到载玻片上，用于成像。
<ol>
	<li>使用精细镊子小心地从插入物上剥离膜，并将膜面朝下、外植体朝上的方式转移至载玻片上。将重复样本放置在同一载玻片上，并将载玻片标记为对照组或VEGF-A组。在膜上直接滴加数滴含DAPI的封片液，然后盖上盖玻片。 
	注意：盖上盖玻片时应避免产生气泡。</li>
	<li>用透明指甲油密封载玻片边缘，并静置晾干。 
	注意：载玻片可于-20 °C长期保存。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜对载玻片进行成像。</li>
	<li>进行分析以测量血管新生出芽的长度。通过测量内皮细胞（Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+）从心室培养物中ERG 1/2/3+细胞内边界延伸的距离，或从SV培养物中SV外植体中心延伸的距离，来定量血管新生出芽长度。
	<ol>
		<li>若使用FIJI/ImageJ进行定量分析，首先下载FIJI软件。</li>
		<li>在FIJI中打开图像文件：依次点击 文件 | 打开 | 文件夹 | 文件名 | 打开。</li>
		<li>点击 分析 | 设置测量 | 选择周长。</li>
		<li>从主窗口中选择 直线 工具。</li>
		<li>按照步骤9.4的建议，在出芽结构的长度方向上画一条直线。</li>
		<li>点击 分析 | 测量。 
		注意：长度测量结果将在新窗口中显示。</li>
		<li>对至少三个随机选择的视野图像进行定量分析。计算出芽长度的平均值，并以均值±标准差形式报告结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

成功从SV和内皮祖细胞组织中培养冠状血管的最关键步骤包括：1）正确识别并分离SV组织用于SV培养；2）使用胚胎年龄为e11至e11.5天之间的心室组织以获得准确的内皮细胞培养；3）在整个解剖过程中保持无菌条件，并始终将组织保持在低温状态；4）使外植体保持附着在ECM包被的膜上，以避免组织在培养基中漂浮。
首先，分离静脉窦（SV）组织可能具有挑战性。需要注意的是，静脉窦位于心脏背侧、左心房与右心房之间，隐藏于肺叶内部，因此难以直接分离和获取。取而代之的是，应先完整取出心脏与肺组织的联合标本（pluck）。随后，借助精细镊子小心去除肺叶并清理周围邻近组织，从该标本中分离出静脉窦。此外，在清理邻近组织时必须格外小心，以免丢失静脉窦组织。
其次，为了准确研究心内膜血管生成，培养胚胎年龄不超过 e11.5 的心室至关重要。在 e12.5 及更晚期的胚胎中，静脉窦（SV）来源的冠状血管已生长至心室的相当大比例区域。因此，来自较晚期心室的冠状血管可能同时包含静脉窦来源和心内膜来源的血管成分1<...

心脏的血管通常被称为冠状血管。这些血管由动脉、静脉和毛细血管组成。在发育过程中，首先形成高度分支的毛细血管，随后这些毛细血管重塑为冠状动脉和静脉1,2,3,4,5。这些初始的毛细血管由位于心外膜前体组织（proepicardium）、静脉窦（SV）和心内膜（Endo）组织中的内皮祖细胞构建而成1,6,7,8。静脉窦是胚胎心脏的流入道结构，而心内膜是心腔的内层衬里。来源于静脉窦和心内膜的内皮祖细胞构成了冠状血管系统的大部分，而心外膜前体组织仅贡献相对较小的部分2。冠状血管的毛细血管网络由已存在的前体细胞在心脏中生长发育的过程称为冠状血管生成（coronary angiogenesis）。冠状动脉疾病是全球主要的死亡原因之一，但目前仍缺乏有效的治疗方法。深入理解冠状血管生成的详细细胞与分子机制，有助于设计新型且有效的治疗策略，以修复和再生受损的冠状动脉。
近年来，随着新工具和技术的发展，我们对冠状血管发育机制的理解取得了显著进展。特别是体内谱系标记和先进成像技术，在揭示冠状血管的细胞来源及其分化路径方面发挥了重要作用9,10,11,12。尽管这些体内研究工具具有诸多优势，但在速度、灵活性和可及性方面仍存在局限。因此，建立稳健的体外模型系统，可与体内系统相辅相成，以高通量方式阐明冠状血管生成的细胞与分子机制。
本文描述了一种冠状动脉血管生成的体外模型。我们建立了一种体外组织块培养系统，可从两种前体组织——静脉窦（SV）和内皮（Endo）——培养出冠状血管。利用该模型，我们证明在生长培养基刺激下，体外组织块培养能够生成冠状血管芽。此外，当受到血管内皮生长因子A（VEGF-A）——一种高效促血管生成蛋白——刺激时，组织块培养的生长速度显著快于对照组。进一步研究发现，SV组织块培养产生的血管芽会发生静脉去分化（表现为COUP-TFII表达的丧失），这一机制与体内SV血管生成过程相似1。这些结果表明，该体外组织块培养系统能够真实重现体内发生的血管生成事件。综上所述，本文所述的血管生成体外模型非常适合以高通量且便捷的方式深入探究冠状动脉血管生成的细胞与分子机制。

<table><tbody><tr><td>100 x 20 毫米组织培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>877222</td><td>在实验方案中称为培养皿</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>8.0 µm PET膜培养小室</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 驴抗兔 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 驴抗大鼠 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>二抗</td></tr><tr><td>带角度金属探针</td><td>Fine science tools</td><td>10088-15</td><td>45度角，用于检测深层凝块</td></tr><tr><td>抗ERG 1/2/3抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab92513</td><td>一抗</td></tr><tr><td>抗VE-钙黏蛋白抗体</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB550548</td><td>一抗，生产商为BD BioSciences</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气瓶</td><td>多家供应商</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>13998223</td><td>用于37 &amp;deg;C、5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 条件下的培养</td></tr><tr><td>解剖体视显微镜</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Leica S9i 体视显微镜</td></tr><tr><td>EBM-2基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>内皮细胞生长基础培养基</td></tr><tr><td>ECM溶液</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>商品名为Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV SingleQuots试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>微血管内皮细胞补充剂试剂盒；与EBM-2混合配制成EGM-2完全培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>图像处理软件（&lt;a href=&quot;https://imagej.net/Fiji/Downloads&quot; target=&quot;_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads&lt;/a&gt;）</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine science tools</td><td>11412-11</td><td>用于胚胎解剖</td></tr><tr><td>Fisherbrand直刃手术剪</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone磷酸盐缓冲液（1×）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>层流式组织培养罩</td><td>Fisher Scientific</td><td>提供多种型号</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>含DAPI的Vectashield</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Electron Microscopy/Fisher</td><td>50-980-494</td><td>商品浓度为32%；需稀释至4%</td></tr><tr><td>带孔勺子</td><td>Fine science tools</td><td>10370-18</td><td>用于从溶液中取出胚胎或组织</td></tr><tr><td>重组小鼠VEGF-A 165</td><td>PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>标准镊子，Dumont #5</td><td>Fine science tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Sure-Seal小鼠/大鼠安乐死舱</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785</td><td>安乐死舱</td></tr></tbody></table>

冠状动脉血管生成的体外模型

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

本文介绍了一种用于研究冠状血管生成的体外培养实验方法。冠状血管为心肌供血，具有重要的临床意义。这些血管的缺陷会带来严重的健康风险，例如动脉粥样硬化，可能导致患者发生心肌梗死和心力衰竭。因此，冠状动脉疾病是全球主要的死亡原因之一。尽管其临床重要性显著，但关于如何再生受损冠状动脉的研究进展仍然相对有限。然而，近年来在理解冠状血管发育的细胞来源及其分化通路方面已取得一定进展。研究工具和技术的发展使科研人员能够对前体细胞进行荧光标记，追踪其命运，并在体内可视化其子代细胞，这些技术对阐明冠状血管发育机制起到了关键作用。体内研究具有重要价值，但在实验设计的速度、可及性和灵活性方面存在局限性。相比之下，精确的体外冠状血管生成模型可克服这些限制，使研究人员能够更快速、灵活地探究重要的生物学问题。缺乏合适的体外模型系统可能阻碍了人们对冠状血管生长过程中细胞与分子机制的理解。本文中，我们描述了一种体外培养系统，可用于从静脉窦（SV）和心内膜（Endo）这两种主要冠状血管前体组织中培养出冠状血管。我们还证实，该培养系统能够准确重现一些已知的体内发育机制。例如，我们发现，来自静脉窦的血管生成芽在培养中会下调COUP-TFII的表达，这与体内观察到的现象一致。此外，我们证明了VEGF-A（一种在体内已被广泛认知的促血管生成因子）能够显著促进静脉窦和心内膜来源的培养组织中的血管生成。综上所述，我们建立了一种精确的体外培养模型，可用于研究冠状血管生成。

SV 血管生成在体内的一个最显著特征是，它遵循特定的路径，并涉及细胞去分化和再分化事件，这些事件在典型的时间和位置发生1。当初始的 SV 细胞生长至心脏心室时，它们停止产生静脉标志物，例如 COUP-TFII（图 7）。随后，冠状血管 sprout 采取两条迁移路径，一条沿心脏表面迁移，另一条深入心肌层内。表面血管最终发育为静脉，而侵入性血管则形成动脉和毛细血管1,6,7。随着心脏的生长和冠状血管系统的扩展，这种区别得以维持。
为了促进冠状动脉发育分子机制的研究，我们建立了一种体外静脉窦（SV）出芽模型，可用于基因功能缺失和功能获得实验。从小鼠胚胎心脏中分离出静...

冠状血管生成的体外模型可用于揭示冠状血管生成的细胞和分子机制。静脉窦和心内膜组织的体外植块培养在VEGF-A刺激下表现出显著的生长，并显示出与体内相似的COUP-TFII表达模式。

在此，我们介绍一种用于研究冠状动脉血管生成的体外培养实验方法。冠状血管为心肌供血，具有重要的临床意义。缺陷……

本方案的意义在于，它使研究人员能够在生物体外研究冠状血管生成的分子机制。该技术的主要优势在于能够准确模拟生物体内冠状血管生成的过程，从而促进对冠状血管生成机制的研究。首先，用70%乙醇喷洒携带胚胎发育第11.5天胚胎的怀孕小鼠。用镊子提起腹部皮肤，用剪刀在腹部皮肤和腹膜上做一侧向和前向切口，直至横膈膜，以暴露子宫角。抓住子宫，剪下组织并拉出子宫角。将胚胎串置于冰上预冷的无菌 PBS 中，在体视显微镜下剥离每个胚胎的子宫肌层、卵黄囊和羊膜覆盖物。分离每个胚胎时，使用带孔的勺子将组织转移至一个新的含有预冷无菌PBS的培养皿中，并置于冰上。为获取胚胎心脏组织，将第一个待解剖的胚胎转移至显微镜下的新培养皿中，并使其腹面朝上。用精细镊子在膈肌稍上方的胸部做一小切口，然后将闭合的镊子插入切口以扩大切口。 用镊子夹住胸壁以打开并暴露心脏和肺，再用另一把镊子将心脏轻轻向前移动90度，以暴露背主动脉和静脉。然后在心脏基部夹住这些血管，小心地将心脏和肺向前拉出，并用冷的PBS冲洗组织。当所有心脏组织采集完毕后，将心脏样本置于显微镜下，并从每个心脏上分离去除肺叶。将第一个心脏腹面朝上放置，用精细镊子夹住心脏基部，刮除静脉窦（SV）周围邻近组织中的左、右心房。为分离静脉窦，将心脏背面向上放置。小心地将静脉窦从心脏上剥离，并使用无菌移液管将分离的组织转移至一个新的、内含冰上预冷的无菌 PBS 的 6 厘米培养皿中。为了分离完整的心室，需去除流出道，并使用新的无菌移液管将心室转移至另一个含有冰冷无菌磷酸盐缓冲液（PBS）并置于冰上的六厘米培养皿中。为了建立心室小梁（SV）和完整心室的培养体系，首先在24孔培养板的每个孔中放置一个孔径为八微米的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）培养插件，并在每个插件的膜上加入100微升新鲜稀释的细胞外基质，于37摄氏度孵育至少30分钟进行包被。当基质凝固后，使用移液管将一个组织块转移至每个插件上，然后将培养板移至显微镜下观察。使用洁净的镊子将组织块置于每个插入物的中央，确保其不附着于侧壁，并小心去除多余的 PBS。接着，将盖好盖子的培养板转移至超净工作台内的层流组织培养罩中，向每个插入物内加入 100 微升预热的完全培养基，向每个插入物下方的孔中加入 200 微升培养基。然后，向所有未使用的孔中加入 300 微升 PBS，并将培养板放入细胞培养箱中孵育五天。在培养的第二天对各培养孔的两个腔室进行 VEGF-A 处理时，吸去培养基，每个插入物中加入 100 微升 PBS，每个孔中加入 200 微升 PBS。轻轻晃动培养板数次后，弃去 PBS，每孔加入 300 微升添加了 1% 胎牛血清的基础培养基以启动培养，并将培养板放回培养箱。在饥饿处理后的第三天，向对照孔中加入 300 微升新鲜的基础培养基加血清，向处理孔中加入含 50 纳克/毫升 VEGF-A 的新鲜基础培养基，并将培养板放回细胞培养箱中。在培养的第六天，按照演示方法用 PBS 清洗小室，在每个孔中加入 200 微升 4% 多聚甲醛，在每个插入物中加入 100 微升固定液。在 4 摄氏度下轻轻摇动固定 20 分钟后，于室温下用 300 微升 PBS 洗涤培养物，每次洗涤 10 分钟，期间持续摇动。最后一次洗涤后，在孔和插入物中各加入 300 微升一抗溶液，于 4 摄氏度轻轻摇动过夜培养。第二天早晨，用含非离子表面活性剂的 PBS 溶液在摇床上洗涤培养物 10 次，每次间隔 10 分钟更换洗涤液，随后加入 300 µL 与适当荧光染料偶联的二抗，在 4°C 条件下于摇床上避光孵育过夜。次日，按照上述方法，用含非离子表面活性剂的新鲜 PBS 溶液将培养物再洗涤 10 次。最后一次洗涤后，用精细镊子小心地将每个插入物上的膜剥离，并将膜放置在单独的玻璃显微镜载片上，组织外植体一侧朝上。用含 DAPI 的封片剂在盖玻片中覆盖样品，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。待指甲油干燥后，通过共聚焦显微镜对切片进行成像。随着初始心静脉细胞在心室上生长，它们将停止表达静脉标志物，例如 Coup-TF2。培养五天后，静脉窦内皮细胞从组织块中出芽并迁移至膜上。与胚胎心脏中的情况相似，当血管从静脉窦迁移出去时，Coup-TF2 的表达水平降低。经 VEGF-A 刺激的培养物中，血管生成出芽的密度和长度均增加。进一步实验显示，经 VEGF-A 刺激的静脉窦培养物其出芽长度较对照组增加近三倍，表明静脉窦和心内膜来源的内皮出芽均对 VEGF-A 产生反应。在取出心脏和肺部、去除心房以及清理静脉窦（SV）周围邻近组织时，必须注意不要丢失SV组织。可通过活体成像实验来观察冠状血管生成过程，并捕捉该过程中细胞与分子动态的详细信息。该技术对于评估冠状血管生成的潜在分子机制具有极高价值，也可作为研究血管生成的通用模型系统。

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