冠状血管生成体模型

我们的协议很重要，因为它允许研究人员研究有机体外冠状血管生成分子机制。该技术的主要优点是，它准确地模拟了生物体内冠状动脉血管生成的过程，有助于研究冠状动脉发生机制。首先喷洒携带胚胎的怀孕小鼠11.5胚胎与70%乙醇。

用钳子将皮肤举过腹部，用剪刀使腹部皮肤和腹腔切口横向和前到隔膜上露出子宫角。抓住子宫，切割组织自由，拉出子宫角。将胚胎串放入冷无菌PBS的立体显微镜下，从每个胚胎上剥离子宫肌肉、蛋黄囊和安尼翁盖。

当每个胚胎被分离时，使用穿孔的勺子将组织转移到含有冰上无菌PBS的新培养皿中。要收获胚胎心脏组织，将第一个被解剖的胚胎移植到显微镜下的新培养皿中，然后将胚胎放在腹侧向上。使用细钳在胸部做一个小切口，略高于隔膜，并将封闭的钳子插入切口以扩大切口。

使用钳子将胸壁打开以暴露心脏和肺部，使用第二对钳子轻轻移动心脏前 90 度，以暴露背动脉和静脉。然后，抓住心脏底部的这些血管，小心地拔出心脏和肺，然后用冷的PBS冲洗组织。当所有心脏组织都收获后，将心脏样本放在显微镜下，从每颗心脏中去除肺叶。

将第一颗心放在其后侧，将心脏放在其底部，使用细钳从心脏中刮刮 SV 周围相邻组织中的左右角体。要隔离 SV，请将心后侧定向向上。小心地将 SV 从心脏中去除，并使用无菌转移移液器将分离的组织放入新的六厘米培养皿中，其中含有冰冷无菌 PBS。

要隔离整个心室，请清除流出的管，并使用新的无菌转移移液器将心室放入一个单独的六厘米培养皿中，其中含有冰冷无菌 PBS。要建立SV和整个心室培养物，首先在24孔培养板的井中，先涂上一个8微米孔PET培养物的膜，每培养物100微升新鲜稀释的细胞外基质，在37摄氏度下至少30分钟。当基质凝固后，使用转移移液器将一个外植转移到每个刀片上，并在显微镜下移动板。

使用清洁钳子，将外植物放在每个刀片的中心，以确保它们不会连接到侧壁上，并小心地移除任何额外的 PBS。接下来，将盖子关闭在层流组织培养罩下，将100微升预加热的完整介质添加到每个刀片，并在每个刀片下方的下面添加200微升。然后将300微升PBS添加到任何未使用的井中，并将板放入细胞培养箱5天。

对于培养的第二天的VEGF-A治疗，从每种培养物的两个腔室中去除介质，并在每个刀片中加入100微升PBS，在每井中加入200微升PBS。旋转板几次后，用300微升基底介质补充1%的胎儿牛血清代替PBS，开始培养，然后将板返回孵化器。在饥饿后的第三天，在控制井中加入300微升新鲜基底培养基加血清，将每毫升VEGF-A的50毫微克添加到治疗井中，并将板回细胞培养箱。

在培养的第六天，用PBS清洗房间，并修复培养物与200微升4%对甲醛在每个井，和100微升固定剂在每个插入。在 4 摄氏度下 20 分钟摇动后，用 300 微升 PBS 清洗培养物，每次洗涤 10 分钟，在室温下摇动。上次洗涤后，在井中加入300微升原抗体溶液，并在4摄氏度下插入一个带摇摆的过夜培养物。

第二天早上，用摇动在PBS中用非离子表面活性剂清洗培养物10次，每10分钟更换一次洗涤溶液，然后用300微升的合适荧光结合二次抗体在4摄氏度过夜与摇动标记。第二天，用非离子表面活性剂在新鲜的PBS中清洗10次培养物，如所证明的。最后一次洗涤后，使用细钳小心地从每个刀片中剥离膜，并将膜放在单独的玻璃显微镜幻灯片上，将外植侧向上。

用 DAPI 补充安装介质在盖滑中覆盖样品，用透明指甲油密封盖滑的边缘。指甲油干燥后，通过共和显微镜对幻灯片进行成像。当最初的SV细胞生长到心室时，它们停止产生静脉标记，如 Coup-TF2。

经过五天的培养，SV内皮细胞发芽并迁移到膜上。与胚胎心脏一样，Coup-TF2表达随着容器从SV迁移而减少。VEGF-A的培养物在密度和长度上都增加了血管生成芽的生长。与对等对子相比，VEGF-A刺激的进一步SV培养表明芽长度增加了近三倍，这表明SV和内膜芽对VEGF-A有反应。

重要的是不要失去SV组织，同时拉出心脏和肺，去除牙底，并清洁SV周围的相邻组织。可以进行实时成像实验，以可视化冠状动脉血管生成，并在这个过程中捕捉细胞和分子动力学的细节。这项技术对于评估冠心血管生成的潜在分子机制，作为一般血管生成研究的模型系统，是非常有用的。