Name: 在沙门氏菌感染组织培养细胞中，NF-βB依赖性路西酶的激活和基因表达的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学习使用NF-κB荧光素酶报告基因检测HeLa细胞中NF-κB激活水平，并通过RT-qPCR分析沙门氏菌感染后的基因表达变化。该方法适用于高通量筛选炎症相关因子。

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Keestra-Gounder 实验室的研究工作获得了美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所资助，资助编号为 R21AI122092，以及美国糖尿病协会资助，资助编号为 1-18-JDF-035。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案的主要贡献在于提供了一种快速、简便的细胞内NF-κB活化检测方法，可用于高通量分析多种刺激条件或影响NF-κB活化的药物。本文描述了沙门氏菌（Salmonella）感染HeLa细胞中NF-κB活化的实验方案。该细胞体系也可用于其他病原体的感染实验，以研究细菌感染对NF-κB活化的影响。此外，HeLa 57A细胞中NF-κB依赖性的荧光素酶活化可用于筛选诱导或抑制NF-κB活化信号通路的分子。本实验中，我们将HeLa 57A细胞接种于48孔板中，但该实验体系可扩展至96孔板甚至384孔板，以实现单次实验检测更多样本。HeLa 57A细胞组成型表达LacZ，可通过β-半乳糖苷酶（β-gal）检测法测定其活性，作为细胞数量和存活率的内参对照。本文所述方案适用于稳定或瞬时转染了NF-κB::luciferase报告基因构建体的细胞系。RAW264.7巨噬细胞系此前已用于类似研究18。需要强调的是，该方法无法区分五种不同NF-κB亚基所形成的同源或异源二聚体的活化状态。不同的NF-κB同源或异源二聚体复合物对启动子序列具有不同的亲和力，并产生不同的转录调控效应<sup cla...

核因子-κB（NF-κB）蛋白家族是一类重要的转录激活因子，可调控多种生物通路中的基因表达。NF-κB的激活可诱导靶基因的转录，其中许多基因在免疫和炎症反应、细胞增殖、应激反应以及癌症进展中发挥重要作用1,2。NF-κB在介导病原体清除相关的早期炎症反应中起着关键作用。鉴于NF-κB激活参与调控多种生物学过程，其信号通路的异常可能对健康和疾病产生严重后果。NF-κB信号通路的功能缺失突变与多种免疫缺陷表型相关，而功能获得性突变则与多种癌症相关，包括B细胞淋巴瘤和乳腺癌3。此外，许多病原体已被证实可通过表达毒力因子直接调控NF-κB的活化状态4,5,6,7。
已知NF-κB的活化可由多种不同的刺激引发，包括细菌产物，如脂多糖（LPS）、鞭毛蛋白和肽聚糖，这些分子被称为病原体相关分子模式（PAMPs）。这些PAMPs可被模式识别受体（PRRs）识别，例如Toll样受体（TLRs）和Nod样受体（NLRs），从而导致NF-κB的活化，并继而诱导一系列NF-κB依赖性炎症基因的表达8。除了PAMPs对PRRs的激活作用外，其他细菌产物（如细菌效应蛋白）也可诱导NF-κB的活化。有趣的是，某些细菌还会表达能够主动抑制NF-κB信号通路的效应蛋白，从而增强其致病性，这进一步凸显了NF-κB作为免疫反应关键介质的重要性9。
组成 NF-κB 二聚体的亚基共有五种：p50、p52、RelA（p65）、RelB 和 cRel。其中最主要的两种 NF-κB 异源二聚体是 p50:RelA 和 p52:RelB 二聚体。活化的 NF-κB 二聚体会结合到多种靶基因启动子区和增强子区中的特定 DNA 位点，这些位点被称为 κB 位点。在正常的稳态条件下，NF-κB 通过与一类称为 IκB 蛋白的抑制蛋白相互作用而保持非活性状态。当受到刺激时，IκB 被 IκB 激酶（IKK）磷酸化，从而被标记进行泛素化修饰并随后降解。IκB 的降解使 NF-κB 暴露出核定位信号，从而被激活。随后，NF-κB 转位至细胞核，在靶基因的启动子区域结合 κB 位点，促进基因转录10。因此，NF-κB 的活化会提高其靶基因的 mRNA 表达水平，这种变化可通过 RNA 定量检测方法（如 RT-qPCR）进行测量11。
目前存在多种常用方法用于检测NF-κB的激活，包括电泳迁移率变动分析（EMSA）、核转位检测以及基因报告子检测。EMSA用于检测蛋白质与核酸之间的复合物。经刺激的细胞被分馏以分离核蛋白，其中包括转位至核内的NF-κB，随后将这些核蛋白与含有NF-κB结合域的放射性标记核苷酸共同孵育。样品在凝胶中电泳，并通过32P标记核酸的自显影成像。如果蛋白组分中存在NF-κB，它将与核苷酸结合，导致其在凝胶中的迁移速度变慢，从而形成清晰的条带。而缺乏活化NF-κB的细胞核组分（例如未受刺激的对照细胞）则不会产生条带，因为核苷酸会快速迁移至凝胶末端。该方法的一个主要缺点是其定量能力有限，仅能以二元方式（即“有”或“无”）进行判断，无法充分反映NF-κB结合能力的有意义差异。此外，该方法未考虑对NF-κB靶基因功能上重要的染色质结构12，13。
与之前的方法类似，还有一种&#34;非迁移&#34;检测方法，即使用含有 NF-κB 结合序列的核苷酸包被多孔板。在将细胞核蛋白组分处理细胞后，NF-κB 会结合到固定在孔板上的核苷酸。随后加入抗 NF-κB 抗体，该抗体与已结合的 NF-κB 相互作用，产生与 NF-κB 含量成正比的比色信号，从而反映 NF-κB 的活化程度。与 EMSA 相比，该方法的优势在于无需使用放射性标记的核酸，且具有定量能力。然而，该方法的一个局限性在于，同样无法区分 NF-κB 靶基因的染色质状态14。
检测NF-κB激活的另一种方法是染色质免疫沉淀（ChIP），该方法通过甲醛将DNA与其相互作用的蛋白质交联，再使用特异性的抗NF-κB抗体进行免疫沉淀。随后通过PCR扩增或直接高通量测序来纯化并鉴定特定的核苷酸片段。该方法所得结果可提供NF-κB与靶基因结合活性的半定量数据。然而，结果在很大程度上依赖于每一步骤中的交联条件和纯化过程15。
在核转位检测中，细胞经刺激以诱导NF-κB活化，随后被固定。向固定后的细胞中加入抗p65抗体。或者，p65亚基本身可标记荧光肽，例如绿色荧光蛋白（GFP）。无论采用哪种方法，均可通过免疫荧光成像来观察p65的定位，从而确定其在细胞内的分布情况。通过测量胞质和细胞核中定位蛋白的比例，研究人员可判断NF-κB的相对活化状态。该方法的缺点是免疫荧光操作相对耗时，需要昂贵的抗体，并且对技术操作要求较高16。
报告基因是研究目的基因调控和表达模式的常用工具。通常，报告基因由目的基因的启动子序列与编码易于检测蛋白的基因融合构建而成。具有酶活性、荧光或发光特性的蛋白因其可被检测和定量，常被选为报告蛋白。因此，检测信号（如发光、荧光）可作为基因表达的指示。这些报告基因构建体随后可被导入不同类型的细胞中，例如上皮细胞或巨噬细胞。
本方案描述了一种克隆的HeLa细胞系（HeLa 57A）的使用方法，该细胞系稳定转染了含有免疫球蛋白κ链启动子区三个拷贝κB共识序列的荧光素酶报告基因17。荧光素酶的表达依赖于NF-κB的激活，而NF-κB的激活发生在细胞受到刺激之后。刺激后的细胞可使用荧光素酶检测试剂盒中提供的细胞裂解缓冲液轻松裂解。取部分细胞裂解液与含有荧光素的荧光素酶检测缓冲液混合。荧光素是荧光素酶的底物，在荧光素酶存在的情况下是产生光所必需的。将检测缓冲液与裂解液混合后，溶液会通过一种称为发光的过程发射光。所产生的光量以流明为单位，与裂解液中荧光素酶的含量成正比，因而可作为NF-κB激活程度的衡量指标。通过与未刺激的对照样本进行比较来解读流明读数，以校正基础水平的NF-κB活性；且该信号在数分钟内保持稳定，便于可靠测量。此外，HeLa 57A细胞系还稳定转染了NF-κB非依赖性的β-半乳糖苷酶报告基因。该β-半乳糖苷酶报告基因组成性表达，可通过检测β-半乳糖苷酶活性来校正细胞活力或细胞数量的差异17。随后可将荧光素酶的检测值归一化至β-半乳糖苷酶的检测值，并以相对于未刺激对照细胞的倍数变化形式报告结果。
由于NF-κB是一种转录因子，可促进NF-κB依赖性靶基因的表达上调，因此可通过定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）作为后续实验，以检测NF-κB依赖性的基因表达增加情况。RT-qPCR是一种高度敏感的方法，能够对多个数量级范围内的基因表达变化进行定量分析。经刺激和未刺激的细胞通过苯酚-氯仿提取法收集RNA。经过相分离后，RNA主要存在于水相中并被提取出来。随后通过沉淀和洗涤步骤获得纯净的RNA沉淀。该沉淀被重新溶解，并通过DNase处理进一步去除污染的DNA。纯化后的RNA再经逆转录生成互补DNA（cDNA）。随后可利用定量PCR技术对cDNA进行分析，通过定量特定mRNA序列的丰度来确定基因表达水平。该技术无法揭示翻译调控、翻译后修饰、蛋白质丰度或蛋白质活性信息。然而，许多基因（尤其是参与促炎过程的基因）受NF-κB调控，其mRNA丰度可反映其表达水平。
本文提出的方法通过一种快速且简便的方式，利用细胞裂解液的发光检测来检测NF-κB的激活。通过检测NF-κB靶基因的表达，RT-qPCR可用于定量特定基因的表达水平，并验证NF-κB激活的功能活性。该系统的主要优势在于其简便性和快速性，适用于对多种调控NF-κB激活的条件进行高通量筛选。本实验方案适用于表达NF-κB::luciferase报告系统的其他细胞系，已在稳定转染的RAW264.7细胞中得到验证18。从细胞裂解到产生发光信号的整个样品处理过程耗时极少，约需一小时。检测NF-κB仅需基本的实验设备，如不透光的微孔板、具备发光检测功能的酶标仪，以及简单的数据分析软件（如电子表格程序）。

<table><tbody><tr><td>粘附膜</td><td>VWR International</td><td>60941-070</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11665092</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶处理试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>普洛麦格</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818100</td><td>分子级</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 57A 细胞</td><td></td><td></td><td>参考编号 15</td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>应用生物系统公司</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>溶菌肉汤</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>Promega 萤光素酶检测系统</td><td>普洛麦格</td><td>E1501</td><td>细胞裂解缓冲液 &amp;和荧光素底物</td></tr><tr><td>随机六聚体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>实时GAPDH正向引物</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC&lt;br/&gt; AAAGT-3'</td></tr><tr><td>实时GAPDH反向引物</td><td></td><td></td><td>5-'CCCACTCCTCCACCT&lt;br/&gt; TTGAC-3'</td></tr><tr><td>实时 IL-23 正向引物</td><td></td><td></td><td>5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC&lt;br/&gt; TGAT-3'</td></tr><tr><td>实时 IL-23 反向引物</td><td></td><td></td><td>5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'</td></tr><tr><td>实时 IL-6 正向引物</td><td></td><td></td><td>5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'</td></tr><tr><td>实时 IL-6 反向引物</td><td></td><td></td><td>5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG&lt;br/&gt; GCTG-3'</td></tr><tr><td>逆转录酶</td><td>应用生物系统公司</td><td>4308228</td><td></td></tr><tr><td>RNase抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RT缓冲液</td><td>普洛麦格</td><td>A3561</td><td></td></tr><tr><td>SL1344</td><td></td><td></td><td>参考编号 17</td></tr><tr><td>SL1344 &lt;em&gt;&amp;Delta;sipA sopB&lt;/em&gt;::MudJ &lt;em&gt;sopE2&lt;/em&gt;::pSB1039</td><td></td><td></td><td>参考编号 18</td></tr><tr><td>SL1344 &lt;em&gt;&amp;Delta;sopE &amp;Delta;sipA sopB&lt;/em&gt;::MudJ &lt;em&gt;sopE2&lt;/em&gt;::pSB1039</td><td></td><td></td><td>参考编号 18</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>应用生物系统公司</td><td>4309155</td><td>2x 预混液</td></tr><tr><td>三试剂</td><td>分子研究中心</td><td>TR 118</td><td>硫氰酸胍</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25300054</td><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP248450</td><td></td></tr><tr><td>用于 PCR 的孔板</td><td>VWR International</td><td>89218-294</td><td>384孔板</td></tr></tbody></table>

nf-κb依赖性荧光素酶激活及基因表达定量 沙门氏菌 感染的组织培养细胞

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

二聚体转录因子 NF-κB 调控多种细胞应答通路，包括通过诱导多种细胞因子和趋化因子的表达来调节炎症通路。NF-κB 组成性表达，并由抑制性蛋白 B 细胞κ轻链多肽基因增强子的核因子抑制蛋白α（IκBα）在细胞质中隔离。NF-κB 的激活需要 IκBα 的降解，从而暴露 NF-κB 上的核定位信号，促进其向细胞核的转运。进入细胞核后，NF-κB 结合到其靶基因（如白细胞介素 6（IL-6）和 IL-23）的启动子区域，促进这些基因的表达。
NF-κB 的激活与转录或翻译过程无关。因此，必须通过特异性定量细胞核内的 NF-κB，或定量 NF-κB 靶基因的表达水平来检测其激活状态。在本实验方案中，采用体外组织培养技术，检测稳定转染了 NF-κB::luciferase 报告基因构建体的细胞中 NF-κB 的激活情况。这些细胞被鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）感染以激活 NF-κB，活化的 NF-κB 进入细胞核并结合到荧光素酶基因启动子区域的 κB 位点，从而诱导其表达。随后裂解细胞，并使用荧光素酶检测系统进行分析。细胞产生的荧光素酶量与发光信号强度成正比，该信号由酶标仪检测。本方法产生的发光信号提供了一种快速且高度敏感的手段，可用于在多种条件下评估 NF-κB 的激活水平。本方案还利用定量反转录 PCR（RT-qPCR）检测反映基因表达水平的相对 mRNA 含量。

本文所述的检测方法聚焦于使用稳定转染了NF-κB依赖性荧光素酶报告系统的HeLa细胞系，以检测转录因子NF-κB的激活情况。活化的NF-κB会转位至细胞核，结合靶基因（包括促炎性细胞因子IL6和IL23）的κB结合位点。图1展示了NF-κB激活的总体示意图。本研究中采用革兰氏阴性菌Salmonella enterica血清型Typhimurium作为NF-κB的激活剂，并诱导IL6的表达（图2）。该菌致病所必需的主要毒力因子之一是III型分泌系统-1（T3SS-1），其使S. Typhimurium能够侵入细胞并诱导NF-κB的激活。T3SS-1的功能是将细菌蛋白（称为效应蛋白）递送至宿主细胞内。这些效应蛋白可靶向多种宿主细胞信号通路，介导宿主上皮细胞的侵袭。由S. Typhimurium诱导的NF-κB激活主要依赖于T3SS-1效应蛋白SopE、...

本文介绍一种快速简便的实验方案，通过检测细胞裂解液中的发光强度，来测定表达NF-κB::荧光素酶报告基因构建体的细胞系中活化B细胞核因子κ轻链增强子（NF-κB）的激活水平。此外，通过RT-qPCR检测鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）感染细胞后分离得到的基因表达水平。

NF-κB依赖性荧光素酶激活及基因表达定量 沙门氏菌 感染的组织培养细胞

二聚体转录因子NF-κB调控多种细胞应答通路，包括通过诱导基因表达来调节炎症通路……

该方案适用于检测表达NF-kappa-B荧光素酶报告基因的细胞中NF-kappa-B活化状态的变化。此技术的主要优势在于可对导致NF-kappa-B活化改变的因素或条件进行高通量筛选。NF-kappa-B是一种参与多种细胞过程的转录因子。NF-κB 的一个众所周知的功能是通过诱导多种细胞因子和趋化因子的表达来启动炎症反应。我们实验室特别关注由病原体鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）诱导的 NF-κB 激活。在此，我们使用了稳定转染了 NF-κB 萤光素酶报告质粒的 HeLa 细胞系。也可利用其他细菌，甚至病毒或化学化合物，在该细胞系中研究 NF-kappa-B 的激活。如果能够将 NF-kappa-B 荧光素酶报告质粒导入其他细胞系，则也可使用这些细胞系。初次进行该实验的研究人员可能在正确使用细胞培养和细菌操作所需的无菌技术方面遇到困难。细胞刺激前一天，吸出已生长至约75%汇合度的HeLa 57A细胞的培养基。用一毫升0.05%胰蛋白酶EDTA洗涤细胞。更换为另一毫升胰蛋白酶EDTA，将培养瓶转移至37摄氏度培养箱中孵育五分钟。细胞从培养瓶中脱离后，将其悬浮于10毫升培养基中。取10微升细胞悬液与10微升台盼蓝混合，吹打混匀，再转移10微升至细胞计数板。使用细胞计数仪对悬液中的细胞进行计数，并用培养基将细胞稀释至最终浓度为每毫升2.5 × 10⁵个细胞，置于50毫升锥形管中。将250微升细胞悬液转移至48孔板的每个孔中。定期盖紧并翻转锥形管，以确保细胞悬液均匀。轻轻敲击培养板侧面，确保细胞在孔中均匀分布。将培养板转移至37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中，过夜培养使细胞贴壁并生长。将冻存的沙门氏菌划线接种于LB琼脂平板上，以获得单菌落。将平板转移至37摄氏度的培养箱中，过夜培养。第二天，向无菌细菌培养管中加入 3 mL LB 培养基，并向培养基中加入适当的抗生素。使用无菌接种环，从划线培养的细菌平板上挑取单个菌落，并将接种环接触 LB 培养基。接种后盖好管盖，并丢弃接种环。将试管放入设置为37摄氏度、180转/分钟的摇床培养箱中，使细菌过夜培养。次日早晨，从培养箱中取出过夜培养的细菌菌液。通过向每管中加入3毫升新鲜LB培养基和抗生素，准备用于传代培养的试管。将30微升过夜培养的细菌培养物转移至 freshly prepared 培养基中。将试管置于37摄氏度的摇床培养箱中培养三小时。三小时培养后，取1毫升无菌LB肉汤加入塑料比色皿中，作为空白对照。将900微升LB培养基转移至其他将用于样品分析的比色皿中。取100微升细菌亚培养物加入含有900微升LB培养基的比色皿中，并上下吹打数次以混匀。对每种细菌悬液重复此操作。打开分光光度计，用于在600纳米波长下测量细菌培养物的光密度。将空白对照放入分光光度计中，并注意其方向。关闭盖子，按下分光光度计上的空白对照按钮，获取背景吸光度。将空白比色皿替换为待测样品比色皿，保持相同方向，然后按下读数按钮。记录这些样品的OD600值。将该数值乘以 10 以校正稀释倍数。在比色皿中将菌悬液按 1 比 10 稀释后测定吸光度，其值应约为 0.1，大致相当于每毫升 1 × 10⁹ CFU。在新的离心管中，加入适量稀释后的过夜培养液至新鲜 LB 培养基中，制备浓度为 1 × 10⁸ CFU/mL 的菌悬液，作为接种物使用。通过将50微升细菌悬液转移至含有450微升无菌PBS的离心管中，对接种物进行连续稀释，直至获得每毫升约100 CFU的终浓度。取每毫升100和1000 CFU这两个最低稀释度的悬液各100微升，分别接种到两块LB琼脂平板上，用涂布棒均匀涂布以获得单菌落。将这些平板转移至37摄氏度培养箱中，过夜培养。第二天，计数菌落并计算初始接种物的细菌浓度，以确定实际的接种浓度。同一天，根据每个孔将使用的感染条件标记平板盖子，每种条件设三个重复。向相应的孔中加入 10 µL 接种物，向未感染的对照孔中加入 10 µL 无菌 LB 培养基。为了同步感染时间，将培养板放入台式离心机中，在500 × g 条件下离心5分钟，并确保培养板已平衡。随后，将感染的细胞转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育1小时。取一支15 mL锥形管，其中含有分装的细胞培养基，放入37 °C水浴中预热，以用于下一步操作。感染后一小时，从水浴中取出含有细胞培养基的15毫升锥形管，并用70%乙醇擦拭管外表面。将组织培养板从培养箱转移至生物安全柜中。使用无菌吸头吸去孔中的培养基，并更换为250微升新鲜的温热细胞培养基。将培养板放回37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中继续孵育额外四小时。之后，从二氧化碳培养箱中取出培养板，吸去各孔中的培养基。进行荧光素酶分析时，向各孔中加入100微升1X细胞裂解缓冲液。将培养板转移至负80摄氏度冰箱中，孵育至少30分钟，以确保细胞充分裂解。随后，将含有冷冻细胞裂解液的培养板置于实验台解冻，并根据生产商的建议配制荧光素酶底物试剂。使荧光素酶底物试剂平衡至室温。接下来，打开酶标仪并启动相应的读板软件。将仪器设置为检测发光信号。将每种细胞裂解液各10微升转移至不透光的96孔板的孔中。使用多通道移液器，向不透明白板的每个孔中加入 50 µL 荧光素酶检测试剂。轻轻侧向敲击板子以混匀各孔，确保底部表面被液体覆盖。将板子放入酶标仪中并开始读数。将发光值复制到电子表格程序中并绘制结果。本实验方案重点研究转录因子NF-kappa-B的激活，采用稳定转染了NF-kappa-B依赖性荧光素酶报告基因的HeLa细胞系。该图展示了在感染鼠伤寒沙门氏菌不同菌株的HeLa 57A细胞中，NF-kappa-B依赖性荧光素酶激活和IL6基因表达的代表性实验结果。野生型SL1344菌株感染在RLU和IL6表达中均诱导出强烈的荧光素酶信号，而感染sipA sopB sopE2三重突变株后信号减弱，并在感染sipA sopB sopE2 sopE四重突变株后降低至对照水平。进行连续稀释和涂板时需格外注意，以确保各菌株间的接种量保持一致。在确定参与 NF-κB 激活及下游 mRNA 表达变化的因素后，可采用蛋白质印迹技术（western blot）来检测蛋白质表达水平的改变。本实验方案不仅使我们实验室能够评估沙门氏菌诱导的 NF-κB 激活，还可用于研究其他与 NF-κB 激活相关的化合物和蛋白质。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种人类病原体。处理这些细菌时应穿戴适当的个人防护装备。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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NF-κB依赖性荧光素酶激活及基因表达定量沙门氏菌感染的组织培养细胞

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