Name: 生产近红外敏感、核心壳疫苗输送平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 了解利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚己内酯制备近红外敏感核壳聚泡疫苗递送平台的方法。该技术通过延迟爆发释放机制提高小分子和蛋白质货物的稳定性，为发展中国家改善疫苗可及性提供新策略。

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我们感谢德克萨斯农工大学（TAMU）化学系元素分析实验室的 Bryan E. Tomlin 博士，他在中子活化分析（NAA）方面提供了协助。

1. 聚己内酰胺三丙烯酸酯（PCLTA）的合成
<ol>
	<li>将 3.2 mL 分子量为 400 Da 的聚己内酯三醇（PCL 三醇）在 50 °C 下于敞口的 200 mL 圆底烧瓶中干燥过夜，同时将 K2CO3 在玻璃小瓶中于 90 °C 干燥。</li>
	<li>在氩气氛围下，将该三醇与 6.4 mL 二氯甲烷（DCM）及 4.246 g 碳酸钾（K2CO3）混合。</li>
	<li>将 2.72 mL 丙烯酰氯溶于 27.2 mL DCM 中，然后在 5 分钟内逐滴加入圆底烧瓶中的反应混合物中。</li>
	<li>用铝箔包裹反应混合物，在氩气氛围下于室温静置 24 小时。</li>
	<li>反应 24 小时后，在减压条件下使用布氏漏斗和滤纸过滤反应混合物，以除去多余的试剂。</li>
	<li>将步骤 1.5 所得滤液（含有封端聚合物）在二乙醚中以 1:3（体积比）的比例沉淀，并在 30 °C 下旋转蒸发以除去二乙醚。</li>
</ol>
2. 多重气泡的形成
注意：将聚合物注入去离子（DI）水中会导致多泡迁移至小瓶底部，从而形成扁平底部。应使用10%（wt/vol）羧甲基纤维素（CMC）填充玻璃小瓶，以避免多泡变形。
<ol>
	<li>在去离子水中配制10%（wt/vol）的羧甲基纤维素钠（CMC）溶液。</li>
	<li>使用1 mL移液管将0.8 mL的10% CMC溶液加入0.92 mL玻璃小瓶中。</li>
	<li>将1000 mg/mL的14 kDa聚己内酯（PCL）溶于二氯甲烷（DCM）中，并以1:3（vol/vol）的比例合成PCLTA，总体积为200 µL；或在氯仿中配制200 µL的1000 mg/mL的5 kDa聚（乳酸-共-乙醇酸）二丙烯酸酯（PLGADA）。</li>
	<li>将2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮（光引发剂）与聚合物（PLGADA或PCL/PCLTA）混合物按0.005:1（vol/vol）比例混合。</li>
	<li>将200 µL聚合物混合物装入安装在注射泵上的1 mL玻璃注射器中，该注射器连接内径为0.016英寸的不锈钢分配管。</li>
	<li>使用微型电机控制聚合物管的前后运动，将聚合物注入玻璃小瓶中的10% CMC溶液内，以形成聚泡（polybubble）。</li>
	<li>在波长254 nm的紫外光（UV）下，以2 W/cm2的强度照射60秒，使聚泡固化。</li>
	<li>将聚泡在液氮中快速冷冻，并在0.010 mBar真空和-85 °C条件下冷冻干燥过夜。</li>
	<li>使用镊子将聚泡从干燥的CMC中分离，并用去离子水洗涤聚泡以去除残留的CMC。请注意，其他聚合物也可使用，但可能需要进行适当调整以改变释放动力学。</li>
</ol>
3. 多重气泡直径的调控
<ol>
	<li>使用1 mL移液管将10%羧甲基纤维素（CMC）加入0.92 mL玻璃小瓶中。</li>
	<li>将PCL/PCLTA按1:3（体积比）混合，其中PCL浓度为1000 mg/mL，分子量为14 kDa，并合成PCLTA。将光引发剂与聚合物混合物按0.005:1（体积比）混合。</li>
	<li>将聚合物混合物装入安装在注射泵上的1 mL玻璃注射器中，该注射器连接内径为0.016英寸的不锈钢分配管。</li>
	<li>使用微型电机控制聚合物管的前后运动，将聚合物注入玻璃小瓶中的10% CMC中，以形成聚泡（polybubble）。</li>
	<li>通过调节分配速率为0.0005至1 µL/s，获得不同直径的聚泡。</li>
	<li>对含有不同直径聚泡的小瓶进行成像。</li>
	<li>使用ImageJ软件测量聚泡的直径，并以小瓶的实际尺寸作为标尺进行定量分析。</li>
</ol>
4. 将货物置于多泡中心
<ol>
	<li>使用 K2CO3 调节 PCL/PCLTA 的黏度： 
	注意：PLGADA 的黏度无需使用 K2CO3 进行调节，因为 5 kDa 的 PLAGDA 在 1000 mg/mL 浓度下的黏度已足以使载物居中。
	<ol>
		<li>将 PCLTA 反应后分离得到的 K2CO3 以不同浓度（包括 0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL 和 60 mg/mL）加入 PCLTA 中。</li>
		<li>使用流变仪测量溶液的动态黏度，剪切速率范围设定为从 0 到 1000 1/s。</li>
		<li>将载物手动注入由含不同浓度 K2CO3 的 PCL/PCLTA 溶液（步骤 4.1.1）形成的聚泡中心（参见步骤 4.2 制备载物混合物）。通过观察步骤 4.1.1 中哪种溶液能使载物保持在中心位置，确定 K2CO3 的最佳浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 CMC 实现载物的居中（已证实对小分子具有可行性）
	<ol>
		<li>将载物与 5%（wt/vol）CMC 在旋转仪中混合过夜，以提高载物的黏度。</li>
		<li>将 2 µL 载物混合物手动注入聚泡中，并在 254 nm 波长、2 W/cm2 条件下进行 60 秒的紫外光固化。</li>
		<li>将聚泡在液氮中快速冷冻 30 秒，随后在 0.010 mBar 真空、-85 °C 条件下冷冻干燥过夜。</li>
		<li>使用镊子将聚泡与干燥的 CMC 分离，并用去离子水洗涤以去除残留的 CMC。</li>
		<li>将聚泡切开成两半，使用共聚焦显微镜对切片成像，以确认载物是否居中（参见步骤 6 中使用的激发和发射波长）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 货物配制
注意：Polybubble 制剂可容纳多种类型的货物，包括小分子、蛋白质和核酸。
<ol>
	<li>根据以往研究，对于蛋白类货物，可使用包括聚乙二醇（PEG）6、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和糖聚合物6在内的辅料，以提高蛋白在聚泡制剂过程中的稳定性。</li>
	<li>按照步骤2中的方案制备聚泡。</li>
	<li>通过将17.11 g海藻糖加入625 µL的HIV gp120/41抗原中，制备抗原溶液。</li>
	<li>手动将1 µL抗原溶液注入聚泡中心。</li>
	<li>在第0、7、14和21天打开聚泡，分别以497 nm和520 nm为激发波长和发射波长，记录抗原的荧光信号。</li>
	<li>采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测抗原的功能性，并使用5%脱脂牛奶作为封闭缓冲液。</li>
</ol>
6. 货物释放
注意：小分子或抗原可用作货物类型
<ol>
	<li>小分子
	<ol>
		<li>将负载吖啶橙的微泡在400 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育，PLGADA微泡在37 °C和50 °C下孵育，PCL/PCLTA微泡在37 °C、50 °C和70 °C下孵育。 
		注意：推荐在高于体温的温度下测试的原因是：a）模拟在激光照射PCL和PLGA中金纳米棒（AuNRs）时微泡所达到的温度（50 °C）；以及b）加速PCL的降解过程（50 °C，70 °C）。</li>
		<li>在每个时间点，收集上清液，并替换为400 µL新鲜PBS。</li>
		<li>使用酶标仪定量测定所收集上清液中的荧光强度。 
		注意：吖啶橙的激发/发射波长为416 nm/514 nm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原
	<ol>
		<li>将负载荧光标记牛血清白蛋白（BSA-488）的微泡在400 µL PBS中孵育，PLGADA微泡在37 °C和50 °C下孵育，PCL/PCLTA微泡在37 °C和50 °C下孵育。</li>
		<li>在每个时间点，收集上清液，并替换为400 µL新鲜PBS。</li>
		<li>使用酶标仪定量测定所收集上清液中的荧光强度。BSA-488的激发/发射波长为497 nm/520 nm。 
		注意：不应在70 °C下对PCL/PCLTA微泡进行释放研究，以避免抗原暴露于极端温度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 毒性
<ol>
	<li>使用中子活化分析（NAA）定量聚泡中的氯含量
	<ol>
		<li>将聚泡在0.010 mBar真空和-85 °C条件下分别冻干2、4、6、20和24小时，用于本研究。</li>
		<li>称取5–9 mg聚泡样品，置于低密度聚乙烯（LDPE）辐照小瓶中。</li>
		<li>使用可追溯至美国国家标准与技术研究院（NIST）的校准溶液配制1000 g/mL的氯标准校准溶液。</li>
		<li>使用1兆瓦Triga反应堆对每个样品进行中子辐照，中子注量率为9.1 × 1012 /cm2·s，辐照时间为600秒。</li>
		<li>将聚泡转移至未辐照的小瓶中。</li>
		<li>在衰变360秒后，使用高纯锗（HPGe）探测器采集伽马射线谱，测量时间为500秒。</li>
		<li>使用Canberra Industries公司的NAA软件分析数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用NAA定量聚泡释放的氯含量
	<ol>
		<li>将经冻干过夜（0.010 mBar真空、-85 °C）的聚泡在37 °C条件下悬浮于400 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中进行孵育。</li>
		<li>在孵育后的第1、2和3周分别收集上清液。</li>
		<li>采用与上述7.1步骤相同的方法，通过NAA分析上清液中的氯含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Kittler S. 等人报道的金纳米棒合成方法8
<ol>
	<li>通过将 250 µL 的 10 mM 氯金酸（HAuCl4）、7.5 mL 的 100 mM 溴化十六烷基三甲铵（CTAB）和 600 µL 的 10 mM 冰冷硼氢化钠（NaBH4）混合，制备金纳米棒（AuNR）种子溶液。</li>
	<li>通过将 40 mL 的 100 mM CTAB、1.7 mL 的 10 mM HAuCl4、250 µL 硝酸银（AgNO3）和 270 µL 的 17.6 mg/mL 抗坏血酸加入试管中，制备生长溶液。</li>
	<li>将 420 µL 种子溶液与生长溶液在 1200 rpm 条件下剧烈混合 1 分钟，然后静置反应 16 小时。</li>
	<li>将混合物在 8000 × g 条件下离心 10 分钟，去除过量试剂，并弃去上清液。</li>
</ol>
9. Soliman, M.G. 等人报道的金纳米棒疏水化方法9
<ol>
	<li>使用 1 mM 氢氧化钠（NaOH）将 1.5 mL 合成的 CTAB 稳定金纳米棒（AuNRs）溶液的 pH 值调节至 10。</li>
	<li>在 400 rpm 条件下，加入 0.1 mL 的 0.3 mM 甲基化巯基聚乙二醇（mPEG）溶液，搅拌过夜。</li>
	<li>将 PEG 修饰的 AuNRs 与 0.4 M 十二胺（DDA）的氯仿溶液在 500 rpm 条件下混合反应 4 天。</li>
	<li>用移液器吸取含有疏水化 AuNRs 的上层有机相，并于 4 °C 保存以备后续使用。</li>
</ol>
10. 近红外光激活聚合物气泡
<ol>
	<li>将聚合物（PLGADA 或 PCL/PCLTA）溶液与疏水化处理的金纳米棒（AuNRs）按 1:9（体积比）混合。</li>
	<li>向聚合物-AuNR 混合物中加入光引发剂，比例为 0.005:1（体积比）。</li>
	<li>将聚合物-AuNR 混合物注入含有 10% CMC（质量/体积）的 0.92 mL 玻璃小瓶中，形成聚泡（参见步骤 2）。</li>
	<li>在 2 W/cm2 功率下，用波长为 254 nm 的紫外光照射 60 秒，使聚泡固化。</li>
	<li>在液氮中快速冷冻 30 秒，随后在 -85 °C 和 0.010 mBar 真空条件下冷冻干燥过夜。</li>
	<li>用镊子分离干燥后的聚泡，并用去离子水洗涤以去除残留的 CMC。</li>
	<li>将聚泡置于 400 µL 的 PBS 溶液中，在 37 °C 下孵育。</li>
	<li>每周一、三、五使用 801 nm 近红外激光（8A）照射 5 分钟以激活聚泡。</li>
	<li>在激光激活前后拍摄前视红外（FLIR）图像，获取温度值。</li>
	<li>根据 FLIR 图像中的温度值，计算激光激活前后的温度差。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

现有技术与挑战 
基于乳液的微粒和纳米颗粒常被用作药物递送载体。尽管这些载体中货物分子的释放动力学已被广泛研究，但控制突释动力学仍是主要挑战11。由于货物在过量水相和有机溶剂中暴露，基于乳液的系统在货物多样性与功能性方面也受到限制。蛋白质类货物通常难以与微粒和纳米颗粒兼容，因为存在货物变性和聚集的风险12。除了货物稳定性外，货物释放动力学在疫苗应用中尤为重要，因为需要通过加强针实现血清学转换。以往针对疫苗递送中这些挑战所进行的努力尚未取得足够成功，单次注射疫苗系统的概念虽已提出数十年，但至今尚未实现临床转化。
我们的多泡疫苗递送平台有望通过减少货物暴露于有机溶剂的体积，从而克服因暴露增加而带来的挑战。该技术可容纳至少两个货物区室：壳层中的货物和中心区域的货物。具有中心化货物的多泡结构可用于控制货物的突释行为，同时兼容多种类型的货物，包括小分子和抗原。在本研究中，我们采用具有不同降解时间的聚酯类聚合物——PLGADA（降解时间较短）和 PCL/P...

免疫接种覆盖率不足导致每年有300万人死于疫苗可预防疾病1。由于储存和运输条件不当，有效疫苗被浪费，从而进一步降低了全球免疫接种水平。此外，未能遵循规定的疫苗接种时间表导致接种不完全，这一问题在发展中国家尤为突出2。在推荐的时间范围内，接种加强针需要多次前往医疗机构，因此限制了完成全程接种的人口比例。因此，亟需开发新型的疫苗控释策略以应对这些挑战。
目前，疫苗递送技术的开发研究包括基于乳液的聚合物系统3,4。然而，货物通常会暴露于较大量可能引起聚集和变性的有机溶剂中，特别是在基于蛋白质的货物背景下尤为明显5,6。我们开发了一种新型疫苗递送平台——&#34;polybubbles&#34;，该平台可容纳多个货物区室，同时最大限度地减少暴露于溶剂中的货物体积7。例如，在我们的 polybubble 核-壳平台中，一个直径为 0.38 mm（SEM）的货物袋被注入到一个 1 mm 的 polybubble 中心。在此情况下，暴露于有机溶剂的货物表面积约为 0.453 mm2。在考虑了球体（微粒）在球形（货物库）内的堆积密度后，可容纳在该库中的实际微粒（直径 10 µm）体积为 0.17 mm3。单个微粒的体积为 5.24×10-8 mm3，因此可容纳在该库中的微粒数量约为 3.2×106 个。如果每个微粒通过双重乳化形成 20 个直径为 0.25 µm 的货物袋，则暴露于有机溶剂的货物总表面积为 1274 mm2。因此，polybubble 内的货物库暴露于有机溶剂的表面积比微粒中暴露于有机溶剂的货物表面积减少了约 2800 倍。因此，我们基于聚酯的平台有望减少暴露于有机溶剂的货物量，从而避免由此引发的货物聚集和不稳定性问题。
聚泡基于相分离原理形成，其中有机相中的聚酯被注入水溶液中，从而形成球形气泡。随后可将水相中的货物注入聚泡中心。通过将不同货物与聚合物壳混合，可在聚泡内部实现另一个货物区室。此时聚泡具有可塑性，随后经固化形成中间含有货物的固体聚泡结构。选择球形聚泡而非其他几何形状，旨在增加聚泡内部的载货容量，同时最小化聚泡的整体尺寸。选择将货物置于中心的聚泡，以展示延迟爆裂释放效果。此外，聚泡中还引入了近红外（NIR）敏感（即具备诊疗功能）的试剂——金纳米棒（AuNR），以引起聚泡温度升高。该效应可能促进聚泡更快降解，并可用于未来应用中释放动力学的调控。本文中，我们描述了构建和表征聚泡的方法，实现聚泡的延迟爆裂释放，并将AuNR整合入聚泡以实现近红外激活。

<table><tbody><tr><td>一步法超敏四甲基联苯胺（TMB）-酶联免疫吸附测定（ELISA）底物溶液</td><td>Thermo scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2-羟基-2-甲基苯丙酮</td><td>TCI AMERICA</td><td>H0991</td><td></td></tr><tr><td>TMB底物用450 nm终止液</td><td>Abcam</td><td>ab17152</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰氯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A24109-100G</td><td></td></tr><tr><td>吖啶黄</td><td>Chem-Impex International</td><td>22916</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醚</td><td>Fisher Chemical</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>抗HIV1 gp120抗体-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-CF488染料偶联物</td><td>Invitrogen</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>溴水杨酸</td><td>Acros Organics</td><td>AC162142500</td><td></td></tr><tr><td>羧甲基纤维素（CMC）</td><td>Millipore Sigma</td><td>80502-040</td><td></td></tr><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19400480</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Chemical</td><td>C2984</td><td></td></tr><tr><td>包被缓冲液</td><td>Abcam</td><td>ab210899</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷（DCM）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Fisher Chemical</td><td>E1384</td><td></td></tr><tr><td>十二胺</td><td>Acros Organics</td><td>AC117665000</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多柔比星</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP251610</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Acros Organics</td><td>A61 100</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>14 831 212</td><td></td></tr><tr><td>mPEG 巯基</td><td>Laysan Bio</td><td>NC0702454</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Andwin Scientific</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钾</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>聚（己内酯）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-250G</td><td></td></tr><tr><td>聚（己内酯）三醇</td><td>Acros Organics</td><td>AC190730250</td><td></td></tr><tr><td>聚（乳酸-共-乙醇酸）二丙烯酸酯</td><td>CMTec</td><td>280050</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钾</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>重组HIV1 gp120 + gp41蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab49054</td><td></td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>Acros Organics</td><td>S181 25</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S678 10</td><td></td></tr><tr><td>四氯金酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>G54 1</td><td></td></tr><tr><td>海藻糖</td><td>Acros Organics</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Acros Organics</td><td>AC157910010</td><td></td></tr></tbody></table>

近红外敏感型核壳疫苗递送平台的制备

Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

能够限制抗原在递送过程中接触有机溶剂，同时实现新型释放模式的疫苗递送策略，对于提高全球免疫覆盖率至关重要。本文介绍了一种新型可注射、可紫外光固化并能实现延迟爆发释放的疫苗递送平台——聚泡（polybubbles）。将抗原载入在10%羧甲基纤维素水溶液中形成的聚酯基聚泡内。本文提供了维持聚泡球形结构、优化抗原定位与保留效果的实验方案，以最大化聚泡内部的抗原载量。为确保安全性，采用中子活化分析法检测了聚泡中氯化溶剂的残留含量。通过将小分子作为模型抗原进行释放实验，验证了聚泡的延迟爆发释放特性。为进一步展示聚泡按需递送抗原的潜力，将金纳米棒掺入聚合物壳层中，以实现近红外激光触发释放。

采用扫描电镜（SEM）和中子活化分析（NAA）对聚合物泡进行了全面表征。成功实现了载荷的中心化定位，从而产生延迟的突发释放效果。由于聚合物泡内含有金纳米棒（AuNRs），还可实现成功的激光激活。
多泡体表征 
将多泡体注入不含羧甲基纤维素（CMC）的水溶液中时，由于多泡体与玻璃小瓶底部接触，导致其形状变扁平（图1A,B）。当使用5% CMC水溶液替代去离子水时，观察到多泡体部分扁平化（图1C）。随后，在玻璃小瓶中使用10% CMC水溶液时，多泡体悬浮于溶液中，从而成功维持了多泡体的球形形态（图1D）。
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本文描述了用于开发一种新型疫苗递送平台的实验方案， &#34;多泡体，&#34; 以实现延迟爆破释放。采用聚酯类材料如聚（乳酸-共-乙醇酸）和聚己内酯形成聚泡，小分子和抗原被用作载荷。

能够在限制货物暴露于有机溶剂的同时实现新型释放特性的疫苗递送策略，对于改进……至关重要

该方案可通过使用多泡体来维持货物的稳定性，这些货物可以是小分子或蛋白质，同时多泡体能够减少碳与溶剂之间的相互作用。这一新技术可用于提高发展中国家的疫苗覆盖率，因为疫苗的功能常因运输和储存设施不完善而受到影响。制备多泡体时，首先使用1毫升移液管将800微升10%羧甲基纤维素（CMC）加入0.92毫升玻璃小瓶中。合成PCLTA时，将每毫升1,000克的14千道尔顿PCL溶于200微升二氯甲烷（DCM）中。合成PLGADA时，将每毫升1,000克的5千道尔顿PLGADA溶于200微升氯仿中。将光引发剂与目标聚合物混合物按0.005比1的比例混合，然后将所得溶液200微升装入固定在注射泵上的一毫升玻璃注射器中，该注射器连接内径为0.016英寸的不锈钢分配管。使用微型电机控制聚合物管的前后运动，将聚合物注入玻璃小瓶中的10%羧甲基纤维素（CMC）溶液以形成聚泡，并在波长254纳米、功率2瓦/平方厘米的紫外光下照射60秒使其固化，随后将聚泡在液氮中速冻30秒，并在-85摄氏度、0.01毫巴真空条件下冷冻干燥过夜。为使目标货物分子位于聚泡中心，可将货物分子与5% CMC溶液在旋转仪中混合过夜以增加其黏度，随后手动将2微升该混合物注入聚泡内。当全部货物注入后，按照上述方法再次进行固化、速冻和冷冻干燥处理。第二天早晨，使用镊子将聚泡从干燥的羧甲基纤维素（CMC）上分离，并用去离子水洗涤聚泡，以去除任何残留的 CMC。随后将聚泡切成两半，并通过共聚焦显微镜对两半进行成像，以确认载荷位于中心。对于小分子载荷的释放，将载有中心化吖啶橙（acriflavine）的聚泡置于 400 微升磷酸盐缓冲液（PBS）中，在 37 摄氏度下孵育适当的时间长度。在每个实验时间点，收集上清液，并向小瓶中加入 400 微升新鲜 PBS。然后使用酶标仪定量所收集上清液的荧光强度。对于近红外激活，将聚合物溶液与疏水化金纳米棒按 1 比 9 的比例混合，并以 0.005 比 1 的比例加入光引发剂。将所得混合物注入含有800微升10%羧甲基纤维素（CMC）的0.92毫升玻璃小瓶中，并如图所示在紫外光下固化生成聚泡。如图所示进行快速冷冻和冻干后，用去离子水洗涤聚泡，并将载体在400微升磷酸盐缓冲液（PBS）中于37摄氏度孵育适当的孵育时间。孵育结束后，在每周三次、每次使用801纳米近红外激光以8安培功率照射5分钟的条件下，对PLGADA聚泡持续激活4周、对PCL-PCLTA聚泡持续激活14周，分别在激活前后获取聚泡的前视红外图像。在每个实验时间点，收集上清液并向小瓶中加入 400 微升新鲜 PBS。然后根据前视红外图像中的温度值，计算激光激活前后聚泡的温度差异。添加基于 10% 羧甲基纤维素钠（CMC）的水溶液可实现聚泡的完全悬浮，从而成功维持聚泡的球形结构。在没有羧甲基纤维素（CMC）的情况下将货物注入多泡囊会导致泄漏，从而无法在多泡囊内保留货物。为解决泄漏问题，可通过在使用三丙烯酸酯封端聚己内酯后分离得到的碳酸钾来增加PCLTA的黏度，同时可通过将货物与5% CMC混合来增加货物本身的黏度。PLGADA多泡囊的黏度足以促进货物的居中定位，无需通过碳酸钾进行调节。请注意，在聚泡注射前，将HIV gp120/41抗原与海藻糖混合或不与海藻糖混合，抗体结合效率之间未观察到具有统计学意义的差异。在37摄氏度孵育的PLGADA聚泡中，含有中间插入吖啶黄的聚泡在第19天出现延迟性爆发释放；而在50摄氏度孵育的聚泡中，该现象出现在第5天。此外，含有金纳米棒的PLGADA聚泡以及PCL和PCLTA聚泡均可成功实现多次激光激活。制备多泡体时，请注意避免试剂暴露于光线下，并立即使用相关溶液。在开发该技术后，我们还希望探索实现此过程的自动化，以扩大多泡体的生产规模。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

生产近红外敏感、核心壳疫苗输送平台

本方案描述了研究基于重组受体结合域（RBD）的SARS亚单位疫苗的一般步骤。内容包括在293T细胞中转染和表达RBD蛋白的方法、用RBD免疫小鼠，以及利用已建立的SARS假病毒中和实验检测小鼠血清的中和活性。...

基于重组RBD的SARS疫苗方案：蛋白制备、动物免疫与中和检测

本视频展示了一种制备可展示多种抗原的外膜囊泡（OMV）疫苗的方法。首先，转染哺乳动物细胞，使其表达并分泌与SpyTag及多聚组氨酸标签融合的病毒抗原。随后，利用镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析柱纯化这些抗原。将纯化后的抗原与表面表达SpyCatcher（SC）蛋白的外膜囊泡混合。多个抗原通过其SpyTag（ST）与SpyCatcher发生共价结合，从而在OMV表面展示抗原，形成多价疫苗。...

生成多价展示外膜囊泡疫苗

本视频展示了一种用于构建聚合物气泡（polybubble）新型平台的方法，该平台可实现延迟爆裂释放。采用聚酯类聚合物形成具有核-壳结构的聚合物气泡，并可将小分子和抗原作为载荷物质。...

一种用于分子延迟爆发释放的新型递送平台的制备技术

本视频展示了一种利用聚合物纳米颗粒制备mRNA疫苗候选物的方法。阳离子聚合物与带负电荷的mRNA相互作用，形成聚集体（polyplexes）。聚集体的形成可稳定mRNA，使其成为免疫治疗应用中未来mRNA疫苗的潜在候选物。...

用于疫苗接种的mRNA负载纳米颗粒的制备

本文提供了一种详细的方法，用于自组装蛋白纳米颗粒（SAPNs）的纯化、复性及表征，以应用于疫苗开发。...

E. coli表达的自组装蛋白质纳米颗粒的制备：适用于需要三聚体表位呈递的疫苗

本方案描述了使用商用的无细胞蛋白表达试剂盒来生产以纳米盘为支撑的膜蛋白，这些膜蛋白可用作亚单位疫苗中的抗原。...

无细胞规模化生产及佐剂添加的Chlamydia muridarum重组主要外膜蛋白用于疫苗开发

本方案描述了外膜囊泡的生物工程化，以构建“即插即用”型疫苗平台，包括其制备、纯化、生物偶联及表征。...

基于展示SARS-CoV-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

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鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价 体外 和 体内

本方法描述了将狂犬病抗原包封于可生物降解的聚合物微粒中，其结构和材料特性可在预设延迟后实现脉冲式释放。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）对从微粒核心释放的抗原进行检测，证实了在微粒制备过程中完整三聚体狂犬病病毒糖蛋白的存在。...

制备包载狂犬病抗原的脉动型聚合物微粒

在本方案中，我们开发了一种阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸（RA），用作佐剂以促进抗原特异性的全身和黏膜免疫应答。通过将美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的视黄酸添加到纳米乳剂中，在肌肉注射该纳米乳剂后，可促进阴道和小肠中的抗原特异性分泌型IgA（sIgA）产生。...

阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进OVA特异性全身及黏膜免疫应答

了解利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚己内酯制备近红外敏感核壳聚泡疫苗递送平台的方法。该技术通过延迟爆发释放机制提高小分子和蛋白质货物的稳定性，为发展中国家改善疫苗可及性提供新策略。

近红外敏感型核壳疫苗递送平台的制备

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