利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

人类胚胎干细胞可被诱导分化为神经前体细胞，进而分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。然而，传统的人类胚胎干细胞培养方法及其向神经前体细胞的分化效率极低，且依赖开放式的体内共培养系统。本文介绍一种改进的、稳健的培养体系，该体系采用高密度的单细胞类型培养人类胚胎干细胞，易于扩增。人类胚胎干细胞的单细胞类型培养为研究调控多步骤分化过程（包括神经前体细胞及其进一步向多种不同神经谱系分化）的分子机制，提供了一个快速且高效的系统。

首先准备适用于人胚胎干细胞的基底膜基质包被培养板。将基底膜基质溶液在4°C条件下缓慢解冻，至少2至3小时或过夜。解冻后，用冷的DMEM/F-12将基质稀释至2%，充分混匀，并在六孔板的每个孔中加入1 mL稀释后的溶液进行包被。

将包被的培养板在室温下孵育至少三小时，或在4摄氏度下过夜。传代培养在基底膜基质上生长的集落型H9人胚胎干细胞无饲养层培养物时，吸去孔中的培养基，并用一毫升DPBS洗涤一次。每孔加入一毫升Dispase溶液，将培养板在37摄氏度孵育20分钟。

去除 Dispase，用两毫升 DMEM/F-12 轻轻洗涤细胞一次。洗涤后，移除培养基，并向每孔加入两毫升 DMEM/F-12。通过上下吹打轻轻吹下细胞集落，转移至 15 毫升离心管中。

将离心管在370 × g条件下离心2分钟。吸除上清液。然后加入2毫升细胞解离溶液，于37°C孵育10分钟，将细胞沉淀解离为单个细胞。

重复离心并去除消化溶液。用移液器轻轻吹打，将细胞重悬于mTeSR-1人胚胎干细胞培养基中。为了将集落型人胚胎干细胞适应为单细胞型培养，将约150万至200万个细胞接种至每孔含有2毫升mTeSR-1培养基的基底膜基质包被培养板中，培养基中需添加10 µM ROCK抑制剂。

24小时后，更换为不含ROCK抑制剂的新鲜mTeSR-1培养基。让细胞以单细胞类型继续生长三天，每天更换培养基。第四天时，用解离溶液将细胞解离，并按照此前所述方法重新接种。

根据文稿说明重悬并孵育细胞后，将小型胚胎体转移至15毫升离心管中，静置使其沉降至管底，然后用移液器轻轻吸除培养基。将胚胎体转入EB培养基中，并在低吸附培养皿中培养7天以使其扩增。为诱导神经前体细胞（NPC）分化，使用1毫升解离溶液对单细胞类型的人胚胎干细胞进行解离，并在37摄氏度下孵育10分钟。

以370 × g离心细胞2分钟。弃去消化液上清。随后将细胞重悬于DMEM/F-12培养基中。

将细胞以每毫升含10微摩尔ROCK抑制剂的mTeSR-1培养基，按每孔2×10⁵个细胞的密度接种于基底膜基质包被的六孔板中，每孔2毫升。24小时后，更换为添加了1微摩尔Dorsomorphin和5微摩尔SB431542的神经诱导培养基。在神经诱导的前4天内每隔一天换液一次，之后每天换液，直至第7天达到汇合。

神经诱导七天后，加入一毫升解离溶液，于37摄氏度孵育10分钟以解离细胞。将细胞以370 × g离心，去除解离溶液上清液。加入一毫升NPC扩增培养基，轻轻吹打细胞上下混匀以重悬细胞。

然后将每孔2毫升非必需细胞扩增培养基中接种1×10⁵个细胞，接种于包被有基底膜基质的六孔板中。当细胞培养物达到90%融合度时，根据需要进行传代，并在前3至4次传代过程中加入10 µM ROCK抑制剂。扩增期间每隔一天更换一次培养基。

为制备多聚赖氨酸-层粘连蛋白包被的培养板，将多聚赖氨酸储存液用 PBS 或水稀释至终浓度为每毫升 10 微克，充分混匀，然后每孔加入 1 毫升该溶液至六孔板的每个孔中。将培养板在 37 摄氏度孵育至少 2 小时，或在 4 摄氏度过夜。随后，用 PBS 洗涤每个孔，并立即在每孔中加入 1 毫升根据文稿说明配制的层粘连蛋白溶液进行包被。

将培养板置于 4 摄氏度保存，最多可保存一周。为将神经前体细胞（NPCs）分化为多巴胺能神经元，将细胞以约 50% 的密度接种于经 PLO-层粘连蛋白包被的培养皿中，使用 NPC 扩增培养基进行培养。24 小时后，更换为 DA1 培养基，并此后每隔一天更换一次培养基。当细胞培养物达到汇合状态需要传代时，使用 1 毫升解离溶液解离细胞，并在 37 摄氏度孵育 10 分钟。

然后在370 × g条件下离心，去除消化液上清。将细胞重悬于1 mL DA1培养基中，取1 × 10⁵个细胞接种至2 mL培养基中，置于PLO-层粘连蛋白包被的6孔板中。为将神经前体细胞（NPCs）诱导分化为星形胶质细胞，将细胞接种于PLO-层粘连蛋白包被的培养板中，在NPC扩增培养基中培养，细胞密度为50%；24小时后更换为星形胶质细胞培养基，并按前述方法进行传代。

当集落型人胚胎干细胞被适应于单细胞型培养时，发现这些细胞能够在高密度条件下维持生长，且在达到汇合状态后可被简单高效地传代。这些细胞保留了集落型人胚胎干细胞典型的细胞周期特征，例如较短的G1期以及处于S期的细胞占比较高。定量PCR分析也证实，它们表达胚胎干细胞标志物的水平与集落型细胞相当。

此外，研究表明，单细胞人胚胎干细胞能够形成包含三个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）细胞的类胚体。随后证明，单细胞类型的人胚胎干细胞可高效分化为神经前体细胞（NPC），表现为典型的胚胎干细胞形态消失并出现NPC形态。该分化过程得到标志性NPC标记物表达水平升高的支持，并通过免疫染色和流式细胞术分析得以确认。

相同的分析还显示，超过90%的细胞对SOX1、PAX6和NCAM蛋白染色呈阳性。此外，所获得的神经前体细胞能够分化为多巴胺能神经元和星形胶质细胞，表现为出现特征性形态以及表达谱系特异性标志物。在进行该操作时，必须以高密度接种人胚胎干细胞，以维持健康且未分化的人胚胎干细胞培养状态。

本方案为前体细胞和分化细胞的简单、稳健且可扩展的生产提供了平台，适用于基础研究、药物筛选以及神经退行性疾病治疗的应用。