Name: 斑马鱼胚胎和幼虫的整个山免疫性化学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学习整胚免疫组织化学技术，利用荧光标记抗体在斑马鱼胚胎和幼虫中检测蛋白质表达，无需切片即可观察完整组织中的蛋白定位，结合共聚焦显微镜生成三维图像，为发育生物学和疾病机制研究提供有力工具。

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由 NIH 资助项目 8P20GM103436 14 提供支持。

本方案中所述的斑马鱼成鱼繁殖及胚胎操作程序已获得默里州立大学机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 胚胎收集与固定
<ol>
	<li>通过将成年斑马鱼雌雄配对或群体放入装有网格或带槽内衬并充满系统用水的繁殖缸中，过夜准备产卵。</li>
	<li>光照开始时，更换繁殖缸中的水为新鲜的系统用水以去除粪便。采用14小时光照/10小时黑暗的光周期，光照在上午9点开启。</li>
	<li>一旦产卵完成，将成鱼移回其原饲养缸中。</li>
	<li>使用移液管吸取或倾倒至带网格的滤器中收集卵子。</li>
	<li>将卵子转移至盛有半量胚胎培养基（如30% Danieau溶液或含0.5 mg/L亚甲蓝的E2胚胎培养基）的培养皿中，每皿胚胎数量不超过50个。</li>
	<li>移除死亡或未能分裂的卵子。 
	注：死亡的胚胎容易识别，因其变得不透明，通常呈现&#34;浑浊&#34;状。若在胚胎培养基中添加了亚甲蓝，死亡胚胎会呈现深蓝色。</li>
	<li>将卵子在28.5 °C条件下孵育至所需发育阶段。本实验中，将胚胎培养至23 hpf（受精后小时）。</li>
	<li>可选）在24 hpf时将胚胎转移至含200 µM 1-苯基-2-硫脲（PTU）的胚胎培养基中，以抑制黑色素生成16,17。或者，在固定后进行胚胎漂白处理（见可选步骤5）。</li>
	<li>每天更换胚胎培养基或PTU培养基。</li>
	<li>在体视显微镜下使用超细尖镊子去除未孵化胚胎的卵膜。或者，通过在含1 mg/mL蛋白酶（Pronase）的胚胎培养基中室温孵育数分钟进行化学去膜。从蛋白酶溶液中取出胚胎，并用胚胎培养基洗涤三次。</li>
	<li>去膜后的胚胎易粘附于塑料表面。应将其保存在涂有1–2%琼脂糖（溶于胚胎培养基）的玻璃或塑料培养皿中。使用火焰抛光的巴斯德移液管转移去膜胚胎，以尽量减少损伤。</li>
	<li>使用塑料或火焰抛光的移液管将胚胎转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>用微量移液器移除胚胎培养基，每次更换液体后仅保留足够覆盖胚胎的液量。</li>
	<li>在化学通风橱中配制4%多聚甲醛（PFA）溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。 
	注意：PFA为危险物质。操作时需佩戴手套，并将受污染的液体和固体废弃物丢弃至指定区域。</li>
	<li>在室温下轻轻振荡，用4% PFA固定胚胎1–2小时。或者，在4 °C条件下固定4小时至过夜。</li>
	<li>用1× PBS + 1% Triton-X（PBTriton）洗涤三次，每次5分钟。</li>
	<li>可立即使用胚胎，或在4 °C下保存最多一周。</li>
	<li>如需长期保存，将胚胎在100%甲醇（MeOH）中脱水2小时或过夜（-20 °C）。之后可在-20 °C的甲醇中保存数月。 
	注意：甲醇为危险物质。操作时需佩戴手套，并将受污染的液体和固体废弃物丢弃至指定区域。</li>
</ol>
2. 胚胎制备
<ol>
	<li>通过一系列室温孵育使胚胎复水。
	<ol>
		<li>在 75% 甲醇/25% 1x PBS 中孵育 5 分钟，摇动。</li>
		<li>在 50% 甲醇/50% 1x PBS 中孵育 5 分钟，摇动。</li>
		<li>在 25% 甲醇/75% 1x PBS 中孵育 5 分钟，摇动。</li>
		<li>在 100% PBTriton 中孵育 5 分钟，摇动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）在冰上配制新鲜的蛋白酶 K 工作液（10 µg/mL 溶于 PBTriton），方法是加入 10 µL 新鲜解冻的蛋白酶 K 原液（10 mg/mL）。
	<ol>
		<li>用蛋白酶 K 消化胚胎以实现通透，最长可消化 30 分钟。 
		注：建议消化时间：&#60;24 hpf：无需消化；24 hpf：消化 15 分钟；7 日龄：消化 30 分钟。</li>
		<li>用 PBTriton 漂洗通透后的胚胎，并在 4% 多聚甲醛中于室温重新固定 20 分钟。</li>
		<li>在室温下用 PBTriton 轻柔摇动清洗胚胎三次，每次 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 一抗孵育
<ol>
	<li>选择一种商用封闭液或与二抗宿主物种相匹配的血清（例如，PBTriton 中含 10% 山羊血清），可添加或不添加 2 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）。</li>
	<li>在封闭液中于室温下封闭胚胎 1–3 小时，或在 4 °C 下过夜，同时轻轻振荡。</li>
	<li>将胚胎与用封闭液或 PBTriton 中含 1% 血清稀释的一抗于 4 °C 下孵育过夜，同时轻轻振荡。本实验使用的一抗为抗 NMDAR1 抗体、抗 pan-AMPA 受体抗体和抗磷酸化组蛋白 H3 抗体，均用含 1% 山羊血清的 PBTriton 稀释至终浓度 1:500。</li>
	<li>用 PBTriton 在室温下振荡洗涤 5 次，每次 10 分钟。</li>
</ol>
4. 二抗孵育
<ol>
	<li>根据一抗的宿主物种及所需的激发波长选择合适的二抗。</li>
	<li>将样品在封闭液或含1%血清的溶液中稀释二抗，室温下振荡孵育2小时（或4 °C过夜）。 
	注意：荧光标记的二抗对光敏感。本实验采用1:500稀释的Alexa488标记山羊抗小鼠IgG，溶于含1%山羊血清的PBTriton溶液中。</li>
	<li>从本步骤开始及后续所有操作，均需用铝箔包裹管子或使用避光盒进行避光处理。</li>
	<li>用PBTriton溶液在室温下振荡洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>将胚胎转移至含有2%琼脂糖的胚胎培养基上，并置于含50%甘油的PBS溶液中，随后进行成像记录，或继续进行下述进一步处理步骤。</li>
</ol>
可选步骤
5. 漂白
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中加入810.7 µL的ddH2O、89.3 µL的2 M KOH和100 µL的30% H2O2，配制漂白液。</li>
	<li>将离心管颠倒三次以混匀。</li>
	<li>用移液器将1 mL漂白液直接加入胚胎中。</li>
	<li>打开胚胎管盖以释放气体。轻轻敲击离心管管壁，使气泡脱离。</li>
	<li>观察漂白过程（必要时使用显微镜），当色素充分去除后停止反应（约24小时孵育胚胎需5分钟，72小时孵育胚胎需10分钟）。</li>
	<li>用移液器小心吸除漂白液，并用1 mL PBTriton溶液将胚胎清洗三次。 
	注意：此步骤中胚胎具有黏性。</li>
	<li>继续进行后续的成像记录或进一步处理步骤。</li>
</ol>
6. 胚胎解剖与去卵黄
<ol>
	<li>为去除卵黄，将少量（约 200 µL，足以完全覆盖胚胎但体积受限以限制其漂浮范围）1x PBS 转移至凹面载玻片或普通玻璃载玻片上。</li>
	<li>使用塑料移液管将一个或多个胚胎转移至 PBS 液滴中。</li>
	<li>使用超细镊子和 00 号昆虫针将卵黄打散，并轻轻刮除胚胎腹面的卵黄颗粒（另见 Cheng 等，2014）18。</li>
	<li>根据需要清除卵黄颗粒并补充 PBS。</li>
	<li>重复操作，直至胚胎基本无卵黄残留。</li>
</ol>
7. 载玻片上的平铺封片
<ol>
	<li>使用塑料移液管或剪去尖端的1 mL微量移液器（以减少剪切应力），将去卵黄的胚胎转移至带电的玻璃载片上。用200 µL微量移液器吸头或昆虫针按所需方向调整胚胎位置。</li>
	<li>用Kimwipe纸或纸巾通过毛细作用吸除多余的PBS。</li>
	<li>在载玻片和盖玻片上加入2–3滴封片介质。</li>
	<li>室温下空气干燥约5至10分钟。</li>
	<li>用透明指甲油将盖玻片密封固定在载玻片上。 
	注意：盖玻片的边缘必须完全覆盖一层薄而连续的指甲油。</li>
	<li>成像前静置干燥约10分钟。</li>
</ol>
8. 琼脂糖包埋
<ol>
	<li>在微波炉适用的烧瓶或烧杯中（体积至少为所需体积的3倍），将0.5 g琼脂糖加入50 mL胚胎培养基中，配制1%琼脂糖溶液。</li>
	<li>放入微波炉加热，每隔30秒摇动一次，直至琼脂糖完全溶解。</li>
	<li>将溶液分装为每管1 mL，置于1.5 mL离心管中。分装后于室温保存。</li>
	<li>加热前用管盖锁覆盖管盖。</li>
	<li>将琼脂糖管放入盛有半杯水的烧杯中，并使用漂浮管架固定。</li>
	<li>将装有漂浮管的烧杯用微波炉加热2–3分钟，或直至琼脂糖完全融化。</li>
	<li>使用塑料移液管或剪去尖端的200 µL微量移液器（以减少剪切应力）将胚胎转移至桥式载玻片上。</li>
	<li>用00号昆虫针将胚胎固定在矩形盖玻片上，并直接向胚胎加入约20 µL融化的琼脂糖。</li>
	<li>使用00号昆虫针迅速调整感兴趣区域，使其最接近盖玻片。 
	注意：此为倒置封片。</li>
	<li>每次使用后，将琼脂糖管放回热水漂浮架中，必要时再次微波加热。</li>
	<li>待琼脂糖凝固后，使用显微镜进行成像。若使用倒置显微镜，保持胚胎倒置状态；若使用正置显微镜，则将盖玻片翻转（使琼脂糖位于盖玻片下方）。</li>
</ol>
9. 在桥接载玻片上封片
<ol>
	<li>制作桥式载玻片时，使用少量瞬间胶将方形盖玻片粘附到玻璃载玻片上。 
	注意：盖玻片之间应留出至少 5 mm 宽的凹槽。对于 24–48 hpf 胚胎，通常两个 #1 盖玻片的厚度较为合适，而对于 72 hpf 胚胎，可能需要三个盖玻片的厚度。</li>
	<li>用塑料移液管或剪切过尖端（以减少剪切应力）的 200 µL 微量移液器，将 1–2 个去卵黄的胚胎转移至桥式载玻片上。</li>
	<li>用无尘纸或纸巾通过毛细作用吸除多余液体。</li>
	<li>直接向胚胎添加一滴浓度 ≥80% 的甘油。</li>
	<li>盖上矩形盖玻片，使甘油液滴与盖玻片接触。</li>
	<li>根据需要，在盖玻片与载玻片之间的空隙中添加更多甘油，确保胚胎完全被甘油覆盖，并在胚胎两侧留有甘油边缘。</li>
	<li>轻轻滑动矩形盖玻片，使胚胎滚动至成像所需位置。</li>
</ol>
10. DAB 染色
注意：本步骤从上述 4.2 步骤之后开始，并替代第 4 步的其余部分。
<ol>
	<li>将胚胎置于封闭液中，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2小时或4 °C过夜，同时进行振荡。</li>
	<li>在PBTriton中室温洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>使用移液管将胚胎转移至培养皿或凹玻片中。</li>
	<li>将50 µL 1% DAB（3,3'-二氨基联苯胺）溶解于ddH₂O中混合2加入0.3%过氧化氢50 µL，并用PBS定容至1 mL。 
	警告：DAB 为有害物质。操作时需佩戴手套，并将受 DAB 污染的液体和固体弃置于指定区域。</li>
	<li>用上述配制的DAB溶液覆盖HRP染色的胚胎，并在显微镜下观察显色情况（通常为1-5分钟）。</li>
	<li>当达到理想的显色程度后，用 PBS 短暂冲洗胚胎。</li>
	<li>将胚胎转移回1.5 mL离心管中，再进行固定。</li>
	<li>在室温下用4% PFA重新固定胚胎15-20分钟。</li>
	<li>用PBTriton洗涤胚胎3次，每次5分钟。</li>
	<li>继续进行记录。</li>
</ol>
11. 针对载玻片上固定组织切片的改良染色方案
<ol>
	<li>用防水笔在待染色组织周围画圈。</li>
	<li>将玻片转移至湿盒中。</li>
	<li>直接向玻片上加入 1 mL PBS。</li>
	<li>室温孵育 7 分钟，以去除包埋介质。</li>
	<li>将玻片倒置，弃去 PBS。</li>
	<li>在最多 1 mL 的 TNT 缓冲液（100 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% Tween20）中再水化 1 分钟。</li>
	<li>在最多 1 mL 的封闭液（商品化封闭液或含 10% 血清和 2% BSA 的溶液）中室温封闭 1 小时。</li>
	<li>加入用 1% 血清或封闭液稀释的一抗，4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>室温下用最多 1 mL 的 TNT 缓冲液洗涤 5 次。</li>
	<li>加入二抗，室温孵育 2 小时或 4 °C 过夜。用铝箔覆盖湿盒或使用避光盖子。</li>
	<li>室温下用 TNT 缓冲液洗涤 5 次。弃去最后一次洗涤液。</li>
	<li>滴加 2–3 滴封片剂，盖上盖玻片。静置 5–10 分钟。</li>
	<li>用透明指甲油将盖玻片密封固定在玻片上。成像前需完全干燥。</li>
</ol>
12. 文档记录
<ol>
	<li>在实验记录本中记录完整的实验步骤及任何偏差。</li>
	<li>记录一抗的浓度、名称、货号、生产厂家和批号。</li>
	<li>将适当固定的样品置于显微镜载物台上，定位目标区域。</li>
	<li>选择一个相对较亮的示例，调整相机曝光时间和增益，使信号足够明亮但不饱和。</li>
	<li>比较不同实验组抗体标记胚胎与对照抗体（如 IgG）胚胎时，应使用相同的曝光设置比较同一目标区域的染色强度。</li>
</ol>

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免疫组织化学是一种多功能工具，可用于表征生物体内几乎所有目标蛋白的时间和空间表达情况。该技术广泛应用于多种组织和模式生物。本实验方案已针对斑马鱼的使用进行了优化。不同物种的免疫组织化学可能需要不同的固定和处理方法、根据物种及内源性过氧化物酶的存在情况选择的封闭液，以及因组织厚度和组成不同而调整的孵育时间。斑马鱼中的免疫组织化学研究在推动我们对癌症24、代谢性疾病25、神经功能障碍26以及众多其他与人类健康密切相关领域认知方面发挥了关键作用。免疫组织化学的一大优势在于，与其他技术（如原位杂交）相比，其实验流程相对较短，且技术要求不高。然而，该方法仍包含多个需要根据样本年龄、靶向抗原以及所用抗体进行优化的步骤。
本方案中多个步骤的持续时间具有灵活性。标注为可变步骤的时间通常代表所需的最短时间。一般而言，当胚胎在PBTriton中洗涤三次或以上时，若有必要，可在最后一次洗涤液中于4 °C条件下保存过夜。通透化和固定时间的灵活性较低，仅应在作为故障...

斑马鱼（Danio rerio）因其世代周期短、发育迅速以及易于进行遗传操作等多种原因，已成为研究生物学过程的有力模型。因此，斑马鱼常被用于高通量小分子筛选，以开展毒理学研究和药物发现。斑马鱼也是研究发育过程的理想模型，因为单只雌鱼通常一次可产下50–300枚卵，且其胚胎透明并在体外发育，便于高效观察发育过程。然而，早期研究主要依赖于使用N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）或其他诱变剂进行的正向遗传筛选，这是由于反向遗传技术的建立面临诸多挑战。大约二十年前，吗啉寡核苷酸（morpholino）首次被应用于斑马鱼，以敲低特定靶基因1。吗啉寡核苷酸是一种小分子反义寡核苷酸，在胚胎发育早期显微注射入胚胎后，可抑制靶mRNA的翻译。吗啉寡核苷酸的主要缺陷在于，随着细胞分裂其浓度被稀释，通常在受精后72小时（hpf）失去效应。尽管如此，吗啉寡核苷酸仍是斑马鱼基因功能干扰的重要工具，而近年来转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）、锌指核酸酶（ZFNs）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）正被越来越多地用于直接靶向斑马鱼基因组2,3。这些反向遗传策略，结合正向遗传学和高通量筛选，已确立了斑马鱼作为研究基因表达与功能的强有力模型。
研究基因功能通常需要评估基因或其产物在时空上的分布情况。在早期发育过程中，可视化此类表达模式最常用的两种技术是原位杂交（ISH）和整体免疫组织化学（IHC）。原位杂交技术于1969年首次建立，依赖于使用标记的反义RNA探针来检测生物体内的mRNA表达4。相比之下，免疫组织化学则使用标记的抗体来可视化蛋白质的表达。利用标记物检测蛋白质的概念可追溯至20世纪30年代5，而首个IHC实验发表于1941年，当时使用FITC标记的抗体在感染组织中检测病原菌6。在随后的几十年中，ISH和IHC技术不断发展并显著改进，如今二者均已常规应用于分子生物学与诊断研究实验室7,8,9,10,11。尽管这两种技术各有优缺点，但IHC相较于ISH具有若干优势。从实践角度看，IHC比ISH更节省时间，且通常成本更低，具体取决于一抗的价格。此外，mRNA表达并不总是蛋白质表达的可靠指标，因为在小鼠和人类中的研究表明，仅有约三分之一的蛋白质丰度变化可由mRNA丰度解释12。因此，在条件允许的情况下，IHC是验证ISH数据的重要补充手段。最后，IHC能够提供ISH无法获得的亚细胞定位和共定位信息13,14,15。本文中，我们描述了一种在整体斑马鱼胚胎和幼体中可靠检测蛋白质的分步免疫组织化学方法。该技术的目标是确定目标蛋白在整个胚胎中的时空表达模式。该方法利用抗原特异性的一抗和荧光标记的二抗。本方案可轻松调整用于载玻片上的组织切片，也可用显色底物替代荧光检测。通过本方案，我们证明了发育中的斑马鱼骨骼肌除表达乙酰胆碱受体外，还表达离子型谷氨酸受体。在23 hpf时，可在纵向肌纤维上检测到NMDA型谷氨酸受体亚基。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>铝箔，加厚型</td><td>柯克兰</td><td></td><td>可使用任何品牌替代</td></tr><tr><td>抗NMDA抗体</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化组蛋白 H3（Ser10），克隆 RR002</td><td>默克生命科学</td><td>05-598</td><td></td></tr><tr><td>抗泛AMPA受体（GluR1-4）</td><td>Millipore Sigma</td><td>MABN832</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钙 [Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4955</td><td></td></tr><tr><td>离心管，1.5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>Sally Hanson</td><td></td><td>可使用任何指甲油或硬化剂替代</td></tr><tr><td>凹陷载玻片</td><td>电子显微镜科学</td><td>71878-01</td><td></td></tr><tr><td>二氨基联苯胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1855920</td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养基，Danieau，30%</td><td></td><td></td><td>17.4 mM NaCl，0.21 mM KCl，0.12 mM MgSO₄，0.18 mM Ca(NO₃)₂&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1.5 mM HEPES 溶于超纯水中。</td></tr><tr><td>胚胎培养基，E2</td><td></td><td></td><td>7.5 mM NaCl，0.25 mM KCl，0.5 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 75 &amp;mu;M KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，25 μM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.35 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，0.5 mg/L 亚甲蓝</td></tr><tr><td>漂浮式试管架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>59744015</td><td></td></tr><tr><td>荧光复合显微镜</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica Biosystems</td><td>M165-FC</td><td></td></tr><tr><td>18 mm × 18 mm 玻璃盖玻片</td><td>康宁</td><td>284518</td><td></td></tr><tr><td>22 mm × 60 mm 玻璃盖玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22-050-222</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>带盖湿盒</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢，30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>免疫笔 Pap Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>00号昆虫针</td><td>Stoelting</td><td>5213323</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO₄）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>网筛</td><td>奥奈达</td><td></td><td>可使用任何品牌替代</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>微管帽锁扣</td><td>研究产品国际公司</td><td>145062</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>演讲会</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>默克生命科学</td><td>S02L1ML</td><td></td></tr><tr><td>摆动式混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-044</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBTriton</td><td></td><td></td><td>1% TritonX-100（溶于1x PBS）</td></tr><tr><td>Permount封片剂</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（玻璃）</td><td>Pyrex</td><td>3160100</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（塑料）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1-苯基-2-硫脲</td><td>Acros Organics</td><td>207250250</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓缩液，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1×</td><td></td><td></td><td>1x 溶液由10x 储存液用dH₂O稀释制成&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>带盖和内胆的产卵缸</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>SuperBlock PBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>37515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost + 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水凝胶</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNT</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris，pH 8.0；150 mM NaCl；0.1% Tween20；用dH₂O配制&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸（Cl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CCOOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>超细镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>水，超纯/双蒸馏</td><td>Fisher Scientific</td><td>W2-20</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼胚胎和幼鱼的整体免疫组织化学染色

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

免疫组织化学是一种广泛应用的技术，用于研究正常发育过程及疾病状态下蛋白质的表达与定位。尽管已有许多针对哺乳动物组织及组织切片优化的免疫组织化学方案，但这些方案通常需要进行修改和优化，才能适用于非哺乳动物模式生物。斑马鱼作为一种模式系统，在基础研究、生物医学研究和转化研究中被越来越多地用于探究发育过程中的分子、遗传及细胞生物学机制。斑马鱼作为模式系统具有诸多优势，但在蛋白质检测方面也需要采用改良的技术。本文中，我们提供了在斑马鱼胚胎和幼鱼中进行整体荧光免疫组织化学的实验方案。该方案还描述了多种不同的封片策略及其各自的优缺点。此外，我们还介绍了对该方案的若干修改，以实现对整体组织中显色底物的检测，以及对切片幼鱼组织中荧光信号的检测。本方案可广泛应用于多个发育阶段及胚胎结构的研究。

整体免疫组织化学利用抗体检测完整动物体内蛋白质表达的空间模式。免疫组织化学的基本操作流程（如图1所示）包括斑马鱼的繁殖、胚胎的培养与制备、封闭非特异性抗原、使用抗原特异性的初级抗体靶向目标蛋白、用标记的次级抗体检测该初级抗体、样本封片以及记录表达情况。
整体免疫组织化学是研究斑马鱼发育过程中蛋白质时空表达的重要工具。斑马鱼在19 hpf之前——即运动神经元接触之前——便开始出现由缝隙连接介导的自发性收缩19。斑马鱼的神经肌肉接头与其他脊椎动物类似，由作用于烟碱型乙酰胆碱受体的乙酰胆碱介导。这些组装完成的受体最早在约16 hpf时被检测到，随着神经元形成连接，其表达逐渐扩展并发生重塑20。在青蛙21和大鼠22</sup...

本文介绍了一种利用荧光抗体在斑马鱼胚胎和幼鱼整体样本中检测蛋白质的实验方案。

免疫组织化学是一种广泛应用的技术，用于研究蛋白质在正常发育过程和疾病状态下的表达与定位。

整体免疫组织化学是一种相对快速且简单的技术，可通过标记的抗体直接在组织或生物体中观察蛋白质的空间和时间分布。该技术的优势在于，无需预先对组织或生物体进行切片，即可实现完整组织或生物体的染色，并可通过共聚焦显微镜生成蛋白质表达模式的三维图像。免疫组织化学广泛应用于生物医学研究，以揭示疾病发生的原因及其分子机制。它也是一种有价值的诊断工具，可用于识别病理样本中的肿瘤。首先，准备装有系统用水的产卵缸，并放置网状或带槽的衬垫。将成年斑马鱼按雌雄混合配对，分组放入产卵缸中过夜。采用14小时光照/10小时黑暗的光周期，光照于上午9点开启。次日早晨在光照条件下，用新鲜的系统水更换产卵缸中的水以去除粪便。一旦产卵完成，即将成鱼移回各自的饲养缸中。使用移液管吸取并收集卵子。将50个卵子转移至每个已加入半满胚胎培养基的培养皿中。去除任何不透明或浑浊的、已死亡或未能分裂的卵子。将卵皿置于28.5摄氏度条件下孵育，直至受精后23小时。若胚胎超过受精后24小时，需用移液器将胚胎转移至含有200微摩尔PTU的胚胎培养液中，以抑制黑色素生成。在体视显微镜下，使用超细尖镊子去除未孵化胚胎的卵膜。使用火焰抛光的巴斯德移液管以尽量减少损伤，将胚胎转移至涂有1-2%琼脂糖（溶于胚胎培养基）的玻璃或塑料培养皿中。然后用塑料或火焰抛光的移液管将胚胎转移至1.5毫升离心管中。用微量移液器吸除胚胎培养基。仅保留足以浸没胚胎的液体。在室温下，用 4% PFA 轻柔振荡固定胚胎 1 至 2 小时。随后，用 1× PBS 和 1% PBTriton 洗涤胚胎 3 次，每次 5 分钟。立即使用胚胎，或在4°C下保存最多一周。如需长期保存，用100%甲醇脱水后于-20°C保存。重新水化胚胎时，依次在甲醇和PBS中室温孵育，每次5分钟，甲醇浓度逐渐降低，最后用PBTriton洗涤。按照文稿进行胚胎样品的制备。选择与二抗宿主物种相匹配的封闭液，例如在PBTriton中加入10%的山羊血清，可选择性添加或不添加每毫升含2毫克的BSA。向含有胚胎的离心管中加入0.5毫升封闭液，并将离心管置于摇床上，在室温下孵育1至3小时。然后将胚胎置于含阻断液和PBTriton的封闭溶液中，加入一抗并稀释，于4摄氏度摇床孵育过夜。次日早晨，在室温下用PBTriton溶液洗涤胚胎5次，每次10分钟，同时保持摇动。随后根据一抗的宿主物种及所需的488纳米激发波长，选择相应的二抗。将用封闭液稀释的二抗加入含有胚胎的离心管中。用铝箔纸包裹离心管，在室温下振荡孵育两小时。随后，在室温下用PBTriton洗涤胚胎三次，每次10分钟，孵育和洗涤过程均用铝箔纸覆盖并保持振荡。用移液器将胚胎转移至含有2%琼脂糖的胚胎培养基中的50%甘油PBS溶液。为去除卵黄，将200微升1×PBS转移至凹面载玻片或普通玻璃载玻片上。使用塑料移液管将一个或多个胚胎转移至PBS液滴中。使用超细镊子和00号昆虫针将卵黄打散，并从胚胎腹面轻轻刮除卵黄颗粒。根据需要移除卵黄颗粒并补充PBS。封片后，将样品置于显微镜载物台上。通过选择一个相对较亮的示例来定位目标区域。调整相机的曝光时间和增益，使信号足够明亮但不饱和。在比较实验抗体标记的胚胎与对照抗体标记的胚胎时，应使用相同的曝光设置。该全胚免疫组织化学方案是利用斑马鱼发育过程研究蛋白质时空表达的有力工具。NMDA型谷氨酸受体的GluN1亚基显示，在受精后23小时，斑马鱼发育中的肌肉组织中存在谷氨酸受体亚基的表达。将受精后72小时胚胎的冷冻切片置于载玻片上，并用针对磷酸化组蛋白H3（phospho-H3）的抗体进行免疫染色，后者是增殖细胞的标志物。多个细胞表达磷酸化-H3，且在脑室区表达最为显著。使用小鼠IgG对照抗体以及省略一抗均显示出较低水平的非特异性表达。选择适当的封闭溶液和与一抗宿主物种相匹配的二抗对于确保检测信号并最大限度减少非特异性染色至关重要。必须验证免疫组织化学结果，以确保所观察到的信号确实是目标蛋白。后续实验通常涉及使用经过遗传或环境修饰的生物体。免疫组织化学使研究人员能够原位观察蛋白质，极大地推动了我们在基础和应用生物学领域对多种系统的理解，尤其是在胚胎发育过程中。甲醇和甲醛具有毒性，应小心操作。废弃物需根据机构规定程序收集并妥善处理。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

斑马鱼胚胎和幼虫的整个山免疫性化学

整体原位杂交是发育生物学中最常用的技术之一。本文中，我们介绍一种高分辨率的双荧光原位杂交实验方案，用于分析单个基因的精确表达模式，并确定两个基因表达区域的重叠情况。我们同时包含碘化丙啶核复染步骤，以突出显示组织结构。...

斑马鱼全胚胎高分辨率双荧光标记 原位 杂交

本文介绍了一种快速对斑马鱼胚胎心脏进行免疫染色的方法。与整体免疫染色法相比，该方法显著增强了抗体的渗透性，可在更短的处理时间内获得高分辨率图像，从而清晰显示心脏中的细胞/亚细胞结构。...

解剖的斑马鱼胚胎心脏免疫染色

斑马鱼是一种小型热带鱼，已成为研究脊椎动物发育和疾病过程中基因功能的常用模型。通过以下方法可确定目标基因的时间和空间表达模式： 原位...

高分辨率整体成像 原位 斑马鱼胚胎杂交技术用于研究基因表达与功能

斑马鱼脊髓中的增殖、模式形成、分化和轴突导向等发育过程可被便捷地建模。本文介绍一种优化斑马鱼胚胎固定的方法，以实现对这些事件的清晰可视化。...

斑马鱼胚胎的解剖与侧向封片：脊髓发育分析

斑马鱼胚胎是发育生物学研究的理想模型。在胚胎发育过程中，斑马鱼胚胎带有卵黄团，给样本的观察与分析带来了三维结构上的挑战。本实验方案描述了如何制备整体样本的二维平面封片 原位 经 (WISH)...

用于整体染色斑马鱼胚胎标本观察与分析的平铺制备 原位 杂交

本文描述了在整只斑马鱼胚胎中对磷酸化表位进行免疫染色的技术，并进一步在小至初级纤毛的细胞结构中进行双色荧光共聚焦定位。这些固定和成像技术可用于确定特定蛋白质出现或激活的位置及其动力学特征。...

对整装斑马鱼胚胎纤毛器官中的磷酸化表位进行免疫染色

纤毛发育对正常器官形成至关重要。本方案描述了一种优化的方法，用于标记和观察斑马鱼的纤毛细胞。...

通过整体荧光标记联合方案可视化斑马鱼中的多纤毛细胞 原位 杂交与免疫荧光

本方案展示了在早期斑马鱼胚胎冷冻切片上进行连续免疫荧光和免疫组织化学染色的方法，从而实现对特定细胞群体中蛋白共定位的精确分析。...

石蜡切片斑马鱼胚胎的连续免疫荧光与免疫组织化学染色

本文介绍了一种用于长时间延时共聚焦显微镜观察的脆弱斑马鱼胚胎固定方法。该低成本方法易于操作，可使用常规的玻璃底培养皿，在任何倒置显微镜上进行成像。固定过程采用不同浓度的琼脂糖分层进行。...

一种用于延长斑马鱼全胚胎共聚焦显微延时成像的分层封片方法

本方案描述了如何通过结合获取图像的方法 原位 斑马鱼胚胎切片的杂交与免疫组织化学 原位...

原位 杂交联合免疫组织化学在冰冻切片斑马鱼胚胎中的应用

本文介绍了一种实验方案 体内...

体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

学习整胚免疫组织化学技术，利用荧光标记抗体在斑马鱼胚胎和幼虫中检测蛋白质表达，无需切片即可观察完整组织中的蛋白定位，结合共聚焦显微镜生成三维图像，为发育生物学和疾病机制研究提供有力工具。

斑马鱼胚胎和幼鱼的整体免疫组织化学染色

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