一种改良的小鼠后肢继发性淋巴水肿诱导方法

本方法的总体目标是在不引起严重病态的情况下，在小鼠后肢诱导出稳定的继发性淋巴水肿。该方法可用于在小鼠后肢诱导继发性淋巴水肿。本方法的主要优势在于，可诱导出持续至少八周的显著淋巴水肿，同时不导致严重病态。

刚接触该操作的研究人员可能在显微外科技术方面遇到困难。因此，我们建议进行显微外科培训并开展多次练习操作，以确保获得成功的结果，同时帮助研究人员更高效地掌握该技术。按照本方案所述，设置辐射源并对小鼠实施麻醉。

放置一块1.5毫米厚的铅板，以确保仅有手术区域接受照射。图示为术后小鼠示例，用于明确照射区域。给予10 Gy的照射剂量。

研究人员在处理辐射时必须采取预防措施。本实验中，所有辐照操作均在具有辐射绝缘的房间内进行，且仅当所有人员离开房间后才启动辐射源。

术前称量小鼠体重。通过脚掌或尾部夹捏试验评估麻醉深度。剃除选定手术侧腿部的毛发。

将氧气流速设置为 0.8 升/分钟。通过鼻罩连接。涂抹眼用软膏。

皮下注射0.5毫升生理盐水，最好注射于小鼠颈背部，以防止手术期间发生低血容量。将小鼠仰卧位放置于手术布上。将鼻罩覆盖于小鼠口鼻部。

用胶带轻轻固定小鼠后肢末端，以防止手术过程中小鼠移动。用平头镊提起皮肤，在腘窝近端约五毫米处剪开一个小口。将锐利的剪刀插入切口，向膝关节方向剪开，使切口末端恰好位于膝关节上方。

使用镊子夹起皮肤进行剪切时，注意不要刺破下方的血管。将小鼠转为俯卧位，完成环形切口。将皮肤解剖至耳角上方几毫米处。

整个操作过程中，请务必使用无菌生理盐水保持组织湿润。使用弹性牵开器牵开近端伤口的皮肤，并确保坐骨静脉清晰可见，如图所示。

在第二和第三趾之间皮下注射 0.01 毫升专利蓝 V。轻轻按压足部数次，以促进专利蓝 V 的扩散。通过显微镜可观察到专利蓝 V 的分布情况。需要观察的结构包括近端淋巴管（PLV）、腘淋巴结（PLN）、第一远端淋巴管（DLV1）和第二远端淋巴管（DLV2）。

放大以观察前淋巴管（PLV），并使用10-0尼龙缝线将其结扎。按压足部，确保结扎远端无专利蓝染料向近端渗漏。按图示结扎两条远端淋巴管。

再次按压足垫数次，以确保专利蓝V不会通过结扎处向近端扩散。在此示例中，可见一条淋巴管因结扎阻碍淋巴液流动而破裂。切除腘窝淋巴结，该淋巴结表面光滑、呈珍珠样，且因专利蓝V染色而与周围脂肪组织形成对比。

在切除腹股沟脂肪垫之前，按图示烧灼该血管。然后完整地切除脂肪垫。确保无活动性出血。

这是一个位于腹股沟的淋巴结示例。位于腹股沟脂肪垫内的淋巴结很少被专利蓝V染色，因此很难与周围脂肪组织区分。将脂肪垫完整地一次性切除，是确保淋巴结已被完全切除的最佳方法。

使用镊子和持针器，以6-0尼龙缝线将皮肤边缘缝合至肌肉筋膜，留出2至3毫米的间隙，以限制浅表淋巴液流动。此图为完成缝合后的示例，位于后肢腘窝、膝关节上方外侧以及后肢内侧。术后给予小鼠镇痛处理并称重，随后将其置于加热恢复柜中。

重复进行术前照射的步骤。该图表显示了三项独立研究在术后八周内后肢体积的合并平均值。总共纳入了31只小鼠。

横轴表示术后周数。纵轴表示后肢体积，单位为立方毫米。误差条表示标准差。

预计术后肿胀及诱导产生的淋巴水肿将在术后前四周内逐渐减轻。四周后，淋巴水肿进入相对稳定的状态。然而，在八周的观察期间，对照后肢的体积有所增加，因此严格来说，淋巴水肿后肢与对照后肢之间的体积差异呈现出意料之外的变化。

推测其原因为小鼠在术后数周内更多地使用了未手术的后肢，而较少使用手术侧后肢。这可能导致对照后肢出现肥大，或许可以解释体积增加的现象。有关所包含的三项研究的个体数据图，请参阅实验方案。

本表格展示了三项纳入研究的总体积测量结果的Sidak多重比较检验。计算得到的P值表明，在随访的全部八周内，诱导淋巴水肿的后肢与对照后肢之间存在统计学上的显著差异。有关三项纳入项目的单独统计分析，请参阅本实验方案。

该方法可诱导出具有统计学意义的淋巴水肿，且持续时间至少八周。该手术可用于研究淋巴水肿的病理机制，并探索新的治疗方案。观看本视频后，您应已掌握如何通过显微外科手术结合术前与术后照射，在小鼠后肢诱导继发性淋巴水肿。

一旦掌握，该手术操作可在45分钟内完成。