Name: 在 Vivo 增强的古特-霍姆调节 T 细胞诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习利用工程化树突状细胞在炎症环境中诱导肠道归巢调节性T细胞的方法。本方案通过活性维生素D和A调控免疫系统，为免疫治疗提供新策略。

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本研究工作由美国国防部卫生事务助理部长办公室通过同行评审医学研究项目资助，资助编号为 W81XWH-15-1-0240（XT）。文中观点、解释、结论和建议均为作者个人意见，并不一定代表美国国防部的观点或得到其认可。本研究工作还部分得到了洛马林达大学医学院研究创新基金的资助（编号分别为 681207-2967 [XT 和 GG]、681205-2967 [XT] 和 325491 [DJB]）。

所有体内动物研究方案均经洛马林达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）以及美国国防部陆军医学研究与物资司令部（USAMRMC）动物照护与使用审查办公室（ACURO）审查并批准。
1. 表达1α-羟化酶和RALDH2的慢病毒（lenti-CYP-ALDH病毒）的制备
<ol>
	<li>第0天：清晨时，将293T细胞以5 × 105 个细胞/mL的密度接种于CM-10-D细胞培养基中。</li>
	<li>每块150 mm × 25 mm培养皿中接种20 mL，于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。24小时后细胞融合度将达到约80–90%。</li>
	<li>第1天：配制2× HBS溶液（含50 mM HEPES、280 mM NaCl和1.5 mM Na2HPO4，pH 7.1）。分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>配制2 M CaCl2溶液，室温保存。</li>
	<li>针对每块150 mm × 25 mm培养皿，在无菌50 mL离心管中配制DNA沉淀混合液。首先加入1,620 µL 2× HBS、9.5 µg PMD2G（VSVG）、17.5 µg pCMVR8.74（衣壳）和27 µg Lenti-CYP-ALDH质粒（一种携带CYP27B1和ALDH1a2的慢病毒载体）。然后加入H2O至终体积为3,037.5 µL。</li>
	<li>最后，在混合过程中逐滴加入202.5 µL 2 M CaCl2，使终浓度为1× HBS和125 mM CaCl2。CaCl2必须最后加入。将转染混合物于室温放置20分钟，期间偶尔混匀。若需处理多个150 mm × 25 mm培养皿，请按比例放大试剂用量。</li>
	<li>将3,240 µL DNA沉淀混合液逐滴加入含293T细胞的一块150 mm × 25 mm培养皿中。加液时轻轻左右摇晃培养皿。将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
	<li>第2天：移除磷酸钙转染液，用1× PBS轻柔洗涤，更换为CM-4-D细胞培养基。于37 °C、5% CO2条件下继续孵育24小时。</li>
	<li>第3天：收集上清液至无菌储存瓶中，于4–8 °C保存。补充新鲜CM-4-D培养基继续培养细胞。于37 °C、5% CO2条件下再培养24小时。</li>
	<li>第4天：将上清液收集至无菌储存瓶中。将第3天和第4天的上清液通过0.45 µm滤膜过滤。为浓缩VSVG假型病毒，将上清液转移至离心管中，在4 °C条件下以4,780 ×g离心24小时。</li>
	<li>第5天：倒掉上清液（沉淀通常可见），将离心管在无菌生物安全柜中的纸巾上静置数分钟以充分沥干。</li>
	<li>用含5%甘油的无菌PBS通过移液器重悬沉淀。每块150 mm × 25 mm培养皿对应的重悬体积为33.3 µL。</li>
	<li>分装为200 µL/管，于-80 °C保存。另单独分装50 µL/管用于滴定。病毒滴度应在108–109 转导单位（TUs）/mL范围内。</li>
	<li>向培养皿中加入漂白剂后丢弃。 
	注意：这些转染后的细胞是本实验方案中最大的安全风险，因为所有慢病毒元件均在细胞中表达。</li>
</ol>
2. 骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的制备
<ol>
	<li>从4–5只Balb/c小鼠中取出胫骨和股骨，放入含有培养基的50 mL无菌聚丙烯管中6。</li>
	<li>将胫骨和股骨转移至含有培养基的100 mm × 20 mm培养皿中，使用解剖剪和镊子去除骨骼上的肌肉等组织。</li>
	<li>切断胫骨和股骨两端，以暴露骨髓腔。</li>
	<li>用连接30 G针头的10 mL注射器吸取10 mL培养基。</li>
	<li>小心将针头插入骨髓腔，冲洗骨髓至一个洁净的50 mL无菌聚丙烯管中。如有必要，重复此操作，确保骨髓完全冲洗出来。</li>
	<li>在2–8 °C条件下，以400 × g离心5分钟，沉淀骨髓细胞，吸除上清液。</li>
	<li>用5 mL 1×红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。</li>
	<li>室温孵育4–5分钟，期间偶尔轻轻振荡。</li>
	<li>加入30 mL培养基以终止反应。</li>
	<li>在2–8 °C条件下，以400 × g离心5分钟，沉淀细胞，然后用10 mL CM-10-R细胞培养基重悬细胞。如需要，可通过40 µm细胞筛网过滤，以去除碎片。</li>
	<li>进行细胞计数，并用CM-10-R细胞培养基将细胞浓度调整至1 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>加入重组小鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF，终浓度 = 100 U/mL）和小鼠白细胞介素-4（IL-4，终浓度 = 10 U/mL）。 
	注意：GM-CSF和IL-4的储存液分别在-80 °C保存，浓度为100,000 U/mL（1,000倍浓缩液）和10,000 U/mL（1,000倍浓缩液）。</li>
	<li>将细胞以每孔4 mL接种至6孔板中，在37 °C、5% CO2条件下培养48小时。</li>
	<li>通过轻柔吹打去除非贴壁细胞。</li>
	<li>加入含GM-CSF（100 U/mL）和IL-4（10 U/mL）的新鲜CM-10-R细胞培养基，继续培养48小时。</li>
	<li>收集非贴壁细胞（BMDCs），用于慢病毒CYP-ALDH的转导。</li>
</ol>
3. 利用慢病毒 CYP-ALDH 转导 DC 以生成 DC-CYP-ALDH 细胞
<ol>
	<li>在6孔培养板中，用含有50 µL病毒和8 µg/mL鱼精蛋白的0.5 mL CM-10-R细胞培养基，每孔接种1 × 106个DC细胞。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。</li>
	<li>更换为新鲜的CM-10-R细胞培养基，继续在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。此时可评估1α-羟化酶和RALDH2的酶活性（见步骤4）。如有必要，重复步骤3.1–3.3进行第二次转导。</li>
	<li>加入脂多糖（100 ng/mL），继续培养细胞24小时。</li>
	<li>收集细胞（DC-CYP-ALDH细胞）用于实验。</li>
</ol>
4. 在 DC-CYP-ALDH 细胞中评估过表达的 1α-羟化酶和 RALDH2
<ol>
	<li>评估DC-CYP-ALDH细胞中过表达的1α-羟化酶
	<ol>
		<li>将1.0 × 106个DC-CYP-ALDH细胞接种至12孔板的每孔中，每孔加入2 mL CM-10-R细胞培养基。</li>
		<li>加入25(OH)D，使其终浓度为2.5 μM。将DC-CYP-ALDH细胞孵育24小时。</li>
		<li>收集上清液，并在-20 °C下保存。</li>
		<li>使用市售的放射免疫分析法（RIA）（参见材料表）检测上清液中1,25(OH)2D的浓度。</li>
		<li>通过流式细胞荧光分选技术（FACS）使用抗CYP27B1抗体检测DC-CYP-ALDH细胞中1α-羟化酶的表达。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估DC-CYP-ALDH细胞中过表达的RALDH2 
	注：使用市售的醛脱氢酶（ALDH）检测试剂盒（参见材料表）测定过表达RALDH2的表达与活性。
	<ol>
		<li>将1 mL DC-CYP-ALDH细胞或对照细胞（1 × 105个细胞/mL，溶于检测缓冲液中）分别加入两个5 mL离心管中（一个标记为&#34;对照&#34;，另一个标记为&#34;检测&#34;）。</li>
		<li>向每个对照管中加入10 µL二乙基氨基苯甲醛（DEAB）溶液（1.5 mM，溶于95%乙醇中），立即混匀。DEAB为RALDH2抑制剂。</li>
		<li>向对照管和检测管中各加入5 µL活化的RALDH荧光底物（300 µM），立即混匀。</li>
		<li>将离心管孵育45分钟。</li>
		<li>在2–8 °C下以400 × g离心5分钟，使细胞沉淀，吸除上清液。</li>
		<li>用200 µL检测缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞置于冰上，立即进行FACS分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing%2C+IL-10-producing+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li>
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Xiaolei Tang 博士和 David J. Baylink 博士是与本研究相关的一项待批准专利的发明人。

本文描述了使用DC-CYP-ALDH细胞增强外周淋巴组织中肠道归巢性调节性T细胞（Treg细胞）诱导的方法。我们的研究数据显示，DC-CYP-ALDH细胞在体外存在相应底物（即25[OH]D和视黄醇）的条件下，能够局部从头合成高浓度的1,25(OH)2D和视黄酸（RA）。由于维生素D缺乏和维生素A缺乏的患者分别通过补充维生素D和维生素A即可轻松达到足够的血液中25(OH)D和视黄醇浓度30,31，我们推断当血液中25(OH)D和视黄醇浓度处于正常水平时，DC-CYP-ALDH细胞可增强外周淋巴组织中肠道归巢性Treg细胞的诱导。为支持这一推论，我们的数据表明，在无维生素D和维生素A缺乏的正常健康动物中，DC-CYP-ALDH细胞能够促进同时表达调节性分子（即foxp3和IL-10）以及肠道归巢受体（即CCR9）的Treg细胞的生成。因此，该技术可用于进一步研究肠道归巢性Treg细胞在炎症性肠病（IBD）治疗中的应用。
本方案的一个关键步骤是制备...

炎症性肠病（IBD）是一种胃肠道（GUT）的慢性炎症性疾病。在美国，约有140万IBD患者。目前普遍认为，针对肠道菌群的免疫反应失调会引发疾病，并破坏黏膜上皮屏障1,2。因此，目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物主要通过抑制炎症介质的功能或阻断免疫细胞向肠道的归巢来发挥作用。然而，这些被靶向的炎症介质和免疫细胞同时也是免疫防御所必需的。因此，炎症介质抑制剂会削弱全身性免疫防御，而免疫细胞归巢阻断剂则会减弱肠道局部的免疫防御，两者均可能导致严重后果3,4。此外，免疫细胞归巢阻断剂还可能同时阻断调节性T（Treg）细胞向肠道的归巢，从而进一步加重IBD患者本已受损的肠道免疫耐受。进一步地，阻断Treg细胞向肠道归巢还可能导致Treg细胞在血液中积聚，进而引起全身性免疫抑制5。最后，这些抑制剂和阻断剂的作用具有短暂性，因此需要频繁给药。频繁使用这些抑制剂和阻断剂可能进一步加剧不良副作用。
最近，我们提出了一种新策略，该策略有可能减轻甚至消除当前用于炎症性肠病（IBD）治疗药物所伴随的副作用6。该策略可增强外周淋巴组织中归巢至肠道的调节性T细胞（Treg细胞）的诱导6。该策略的理论依据在于，归巢至肠道的Treg细胞会特异性地迁移至肠道，因此不会损害全身免疫防御功能。此外，由于Treg细胞可能具有形成免疫记忆的潜力7,8，归巢至肠道的Treg细胞有可能为IBD患者提供对慢性肠道炎症的稳定控制，从而减少治疗给药频率。此外，由于该策略通过体内增强归巢至肠道的Treg细胞的诱导，避免了体外生成的Treg细胞在高度促炎环境中过继转移后所面临的体内不稳定性问题9,10。在这方面，体外生成的Treg细胞是治疗自身免疫性疾病11,12,13和移植排斥反应14,15的潜在策略之一。最后，在该策略中，树突状细胞（DCs）被改造为局部从头合成两种分子并达到高浓度：活性维生素D（1,25-二羟基维生素D，即1,25[OH]2D）和活性维生素A（视黄酸，RA）。我们选择1,25(OH)2D和RA，是因为1,25(OH)2D可诱导调节性分子（如叉头框P3 [foxp3]和白细胞介素-10 [IL-10]）的表达16,17，而RA可促进T细胞表达肠道归巢受体18。由于1,25(OH)2D和RA均可诱导DC的耐受性状态28,29，我们推断，经改造的DC在体内可稳定维持耐受性状态，从而规避体外生成的耐受性DC（TolDCs）在体内不稳定的潜在问题19,20,21。在这方面，TolDCs也是体内增强Treg细胞功能的潜在策略之一19,20,21。为支持我们的推论，我们已证实，经改造的DC在体内递送后，可增强外周淋巴组织中归巢至肠道的Treg细胞的诱导6。
我们所提出策略的另一个优势在于，1,25(OH)2D 还具有其他可能使炎症性肠病（IBD）患者受益的功能。这些功能包括 1,25(OH)2D 能够促进抗菌物质的分泌22，以及抑制癌变过程23。而感染和癌症常与炎症性肠病相关24,25。
为了生成能够局部高浓度从头合成1,25(OH)2D和RA的树突状细胞（DCs），我们使用慢病毒载体对DCs进行基因改造，使其过表达两个基因。其中一个基因为细胞色素P450家族27亚家族B成员1（CYP27B1），其编码25-羟基维生素D 1α-羟化酶（1α-羟化酶），该酶在生理条件下催化1,25(OH)2D的合成。另一个基因为醛脱氢酶1家族成员A2（ALDH1a2），其编码视黄醛脱氢酶2（RALDH2），该酶在生理条件下催化RA的合成6。
由于在体内增强肠道归巢性调节性T细胞（Treg细胞）的诱导在炎症性肠病（IBD）治疗中可能具有重要意义，因此在以下方案中，我们将详细说明生成1α-羟化酶-RALDH2过表达树突状细胞（DC-CYP-ALDH细胞）的操作步骤，此类细胞可用于未来在体内对肠道归巢性Treg细胞的深入研究。

<table><tbody><tr><td>10 mL 注射器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号# 03-377-23</td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 20 mm 培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号# CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>12孔培养板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号# 07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>150 mm × 25 mm 培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号# CLS430559</td><td></td></tr><tr><td>25-羟基胆钙化醇（25[OH]D）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 H4014</td><td></td></tr><tr><td>293T细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号：21985023</td><td></td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>ALDEFLUOR试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>货号# 01700</td><td></td></tr><tr><td>抗CYP27B1</td><td>Abcam</td><td>货号 ab95047</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD 生物科学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 C1016</td><td></td></tr><tr><td>CM-10-D 细胞培养基</td><td></td><td></td><td>含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素/链霉素、0.055 mM 2-巯基乙醇（2-ME）、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基。</td></tr><tr><td>CM-10-R 细胞培养基</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 培养基（不含谷氨酰胺），含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素/链霉素、0.055 mM 2-巯基乙醇（2-ME）、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸和 2 mM L-谷氨酰胺。</td></tr><tr><td>CM-4-D 细胞培养基</td><td></td><td></td><td>含4%胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素/链霉素、0.055 mM 2-巯基乙醇（2-ME）、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基。</td></tr><tr><td>康宁瓶顶式真空滤器，0.22 mM，500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号# CLS430513</td><td></td></tr><tr><td>康宁瓶顶式真空滤器，0.45 mM，500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号# CLS430514</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 08-940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 11960044</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 16000044</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Gibco ACK 裂解缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 A1049201</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 G5516</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG</td><td>Abcam</td><td>货号 ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore</td><td>货号 391340</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-CYP-ALDH</td><td>定制</td><td>1.6 kb的小鼠CYP27B1和ALDH1a2 cDNA通过PCR扩增获得，分别使用含有CYP27B1 cDNA和ALDH1a2 cDNA的质粒（GeneCopoeia）作为模板。扩增得到的CYP27B1 cDNA片段包含5'端Kozak核糖体结合序列，被克隆至pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE慢病毒载体（Addgene）中，所得构建体命名为lenti-CYP-GFP。将扩增的ALDH1a2 cDNA片段克隆入lenti-CYP-GFP中以替换GFP序列，命名为lenti-CYP-ALDH。该双顺反子质粒在SFFV启动子控制下表达CYP27B1，在PGK启动子控制下表达ALDH1a2。</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号#25030081</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 L3755</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>货号 315-03</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-4</td><td>Peprotech</td><td>货号 214-14</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 S9888</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>货号 14-841-02</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号：11140076</td><td></td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>Addgene</td><td>质粒# 22036</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号#15140148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号：20012027</td><td></td></tr><tr><td>PMD2G</td><td>Addgene</td><td>质粒# 12259</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯管，15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>货号 AM12500</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯管，50 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 AM12502</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 P3369</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆IgG同型对照</td><td>Abcam</td><td>货号 ab171870</td><td></td></tr><tr><td>1,25(OH)₂D₃放射免疫分析法&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;三维测量</td><td>Heartland Assays</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，不含谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号# 21870076</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号：11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号# 75004521</td><td></td></tr><tr><td>无菌细胞筛，40 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号# 07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>无菌储存瓶，500 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 CLS431432</td><td></td></tr></tbody></table>

体内增强肠道归巢性调节性t细胞的诱导

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

炎症性肠病（IBD）是一种胃肠道（GUT）的慢性炎症性疾病。在美国，约有140万IBD患者。目前普遍认为，针对肠道菌群的异常免疫反应会引发该疾病，并破坏黏膜上皮屏障。我们最近的研究表明，趋向肠道的调节性T（Treg）细胞是治疗IBD的一种有前景的方法。因此，本文介绍了一种在体内增强趋向肠道Treg细胞诱导的实验方案。在该方案中，树突状细胞被改造为局部从头合成两种分子，即活性维生素D（1,25-二羟基维生素D或1,25[OH]2D）和活性维生素A（视黄酸或RA）。我们选择1,25(OH)2D和RA是基于先前的研究发现：1,25(OH)2D能够诱导调节性分子（例如叉头框P3和白细胞介素-10）的表达，而RA可刺激T细胞表达趋向肠道的归巢受体。为了生成此类工程化树突状细胞，我们使用慢病毒载体转导树突状细胞，使其过表达两个基因。其中一个基因为细胞色素P450家族27亚家族B成员1（CYP27B1），编码25-羟基维生素D 1α-羟化酶，该酶在生理条件下催化1,25(OH)2D的合成；另一个基因为醛脱氢酶1家族成员A2（ALDH1A2），编码视黄醛脱氢酶2，该酶在生理条件下催化RA的合成。该方案可用于未来在体内对趋向肠道Treg细胞的进一步研究。

DC-CYP-ALDH 细胞中 1α-羟化酶的表达量显著增加。 为确定由骨髓来源树突状细胞（BMDC）生成的 DC-CYP-ALDH 细胞是否表达显著更高水平的 1α-羟化酶，将 BMDC 用慢病毒 lenti-CYP-ALDH 进行转导，以产生骨髓来源的 DC-CYP-ALDH 细胞（BMDC-CYP-ALDH 细胞）。随后通过流式细胞术（FACS）检测 BMDC-CYP-ALDH 细胞中 1α-羟化酶的表达。我们的结果显示，与亲代 BMDC 相比，BMDC-CYP-ALDH 细胞中 1α-羟化酶的表达明显增强（图 1A）。我们还测定了 BMDC-CYP-ALDH 细胞中 1α-羟化酶的酶活性。为此，将 1.0 × 106 个 BMDC-CYP-ALDH 细胞加入含 2 mL CM-10-R 细胞培养基的 12 孔板中，随后向培养体系中加入 25(OH)D，使其终浓度为 2.5 μM。细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时，收集上清液，采用放射免疫...

本文介绍了一种体内增强肠道归巢调节性T细胞诱导的实验方案。在该方案中，树突状细胞被改造为能够局部从头合成高浓度的活性维生素D（1,25-二羟基维生素D或1,25[OH]2D）和活性维生素A（视黄酸或RA）。

体内增强肠道归巢性调节性T细胞的诱导

炎症性肠病（IBD）是一种胃肠道（GUT）的慢性炎症性疾病。在美国，约有1.4...

本方案描述了一种可能具有创新性的治疗策略，可轻松修改后用于人类临床应用。该技术可直接增强外周淋巴组织中肠道归巢调节性T细胞的诱导，并且即使在高度促炎环境中也能稳定实施。这些技术还可用于研究活性维生素D和维生素A在外周免疫系统中的作用。本视频演示将逐步介绍制备高质量工程化树突状细胞的方法，这是该技术成功的关键。首先，在150 mm × 25 mm培养皿中加入20 mL CM-10-D细胞培养基，并接种1 × 10⁷个293T细胞，于37°C、5% CO₂条件下培养24小时。次日，将1.62 mL新配制的2倍浓缩HBS溶液、9.5 µg包膜质粒、17.5 µg包装质粒以及27 µg LENTI-CYP-ALDH质粒加入一个50 mL锥形管中。用水将管内液体终体积补至3.0375毫升，随后逐滴加入202.5微升2摩尔氯化钙。DNA沉淀混合物于室温放置20分钟，期间偶尔混匀，然后在293T细胞培养物中每皿逐滴加入3.24毫升该溶液，同时轻轻旋转培养皿。将培养板放入培养箱中孵育24小时，随后用PBS轻轻洗涤每块培养板，并用CM-4-D培养基更换培养液。再培养 24 小时后，将上清液收集至无菌瓶中，于 4 至 8 摄氏度保存，并用新鲜的 CM-4-D 培养基喂养细胞，继续培养 24 小时。第 4 天再次收集上清液，并将第 3 天和第 4 天的上清液均经 0.45 微米滤膜过滤。随后，通过离心浓缩 VSV-G 假型病毒，离心时间为 24 小时。第二天，倾出上清液。将离心管置于无菌生物安全柜中的纸巾上静置数分钟以沥干，然后将沉淀重悬于每培养皿含5%甘油的33.3微升无菌PBS中。用于生成骨髓来源树突状细胞时，将从BALB/c小鼠分离的胫骨和股骨放入盛有新鲜培养基的100 × 20毫米培养皿中。使用解剖剪和镊子去除骨骼上的所有组织。当所有骨骼清理干净后，用剪刀剪去每根骨骼的两端，以暴露骨髓腔。使用配备30号针头的10毫升注射器，以10毫升新鲜培养基冲洗每根骨骼，将骨髓收集至15毫升离心管中。当所有骨髓收集完毕后，通过离心沉淀骨髓细胞，并将沉淀物重悬于2毫升红细胞裂解缓冲液中。室温下孵育4至5分钟，期间偶尔轻轻摇动，随后加入10毫升细胞培养基终止反应，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于10毫升CM-10-R培养基中进行计数，并调整细胞浓度至每毫升CM-10-R培养基含1×10⁶个细胞。接下来，向细胞中加入重组小鼠 GM-CSF，终浓度为每毫升 100 单位，以及 IL-4，终浓度为每毫升 10 单位。将 4 毫升细胞悬液分别接种至 6 孔培养板的各个孔中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养 48 小时。培养结束后，轻轻吸除未贴壁的细胞。在将细胞放回细胞培养箱继续培养48小时之前，向培养物中加入含有GM-CSF和IL-4的新鲜培养基。第二次培养结束时，收集非贴壁的骨髓来

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在 Vivo 增强的古特-霍姆调节 T 细胞诱导

竞争性归巢实验可直接在单个小鼠体内评估两种不同细胞群体的迁移特性。本文通过比较体外生成的肠道趋向性T细胞与非肠道趋向性T细胞的迁移能力，说明该实验方法。...

研究肠道趋向性T细胞迁移的竞争性归巢实验

小鼠骨髓移植是一种广泛使用的技术，用于研究调控人类移植物抗宿主病的免疫学机制。体内监测T细胞迁移模式的能力，使得能够对移植物抗宿主病过程中T细胞反应的发生与发展进行详细分析。...

移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

我们介绍一种从单一人血供体中分离获得调节性T细胞、记忆性T细胞和初始T细胞的方法。在遗传同质性的条件下，可将极化后的调节性T细胞与其他T细胞亚群在多种遗传学和功能学实验中进行比较，其中包括本文详细描述的抑制功能实验。...

从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内...

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

本文介绍了一种通过将同基因型CD4+CD45RBhigh...

通过将效应性CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

本文介绍一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）在小鼠模型中生成具有功能性的抗原（Ag）特异性调节性T细胞（Tregs）的方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。...

开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞

本方案描述了从初始CD4+ T细胞可重复地诱导生成人源诱导性调节性T细胞（iTregs）并进行表型分析的方法+ T细胞...

体外利用含TGF-β方案由初始CD4+ T细胞诱导人CD4+FOXP3+调节性T细胞（iTregs）的分化

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本文介绍了一种基于流式细胞术的体内杀伤实验方法，可用于研究细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对模型肿瘤抗原应答中的免疫优势现象。我们提供了该精巧实验方法在机制研究和药物疗效评估中应用的示例。...

定制体内细胞毒性实验以研究肿瘤特异性CD8+ T细胞应答中的免疫显性

本方案描述了一种针对肠道微生物群抗原特异性T细胞的过继转移结肠炎模型。从CBir1 TCR转基因小鼠中分离CD4+...

通过将CBir1 TCR转基因CD4+ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导肠道炎症

本方案描述了 体内 通过强制表达转录因子 PU.1、IRF8 和 BATF3，在肿瘤微环境中将小鼠癌细胞重编程为类似 1...

可操作的 体内 将肿瘤细胞重编程为类似1型传统树突状细胞的细胞

学习利用工程化树突状细胞在炎症环境中诱导肠道归巢调节性T细胞的方法。本方案通过活性维生素D和A调控免疫系统，为免疫治疗提供新策略。

体内增强肠道归巢性调节性T细胞的诱导

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