一种慢性延迟接种模型 铜绿假单胞菌 伤口感染

该方案具有重要意义，因为它描述了一种无需植入异物或进行免疫抑制的慢性铜绿假单胞菌伤口感染模型。在全层皮肤切除造伤后24小时延迟接种铜绿假单胞菌，可避免细菌被迅速清除或扩散，从而建立持续7至10天的感染状态。这一独特的模型将为研究细菌致病机制、宿主与病原体相互作用，以及开发针对慢性铜绿假单胞菌伤口感染的新疗法提供有力工具。

为我协助演示该操作的是来自博利基实验室的医学生 Dan Liu。在开始操作前，称量一只8至12周龄、已麻醉的小鼠以获得基础体重，并将小鼠置于俯卧位。确认小鼠对足底反射无反应后，在其两侧 flank 皮下分别注射250 µL预热的无菌0.9%氯化钠溶液。

使用电动剃须刀去除小鼠背部区域的毛发，并在暴露的皮肤上涂抹一层脱毛膏。20至60秒后，用浸有温水的纱布擦去毛发和多余的乳液。对于全层切除性伤口手术，首先使用25号针头在小鼠背部中线皮下注射0.6至1毫克/千克的缓释布托啡诺，然后用三组交替的无菌聚维酮碘和酒精棉签以环形方式擦拭手术部位。

在手术区域覆盖一层塑料保鲜膜，并向尾侧拉紧皮肤。待皮肤干燥后，使用无菌的直径六毫米皮肤活检打孔器，在左侧背部表皮进行初次切口，随后在右侧背部表皮进行第二次切口。用镊子从左侧标记伤口区域的中心将皮肤提起成帐篷状，然后使用剪刀切除表皮层和真皮层。

在右侧标记的伤口区域重复进行切口，以形成对称的切除性伤口后，用 50 µL 无菌生理盐水清洗两个伤口。待手术部位及周围皮肤干燥后，用透明薄膜敷料覆盖伤口及背部，并将小鼠置于清洁笼具中，放置于加热垫上，持续监测直至完全恢复卧姿。术后 24 小时，再次称量重新麻醉的小鼠体重，并在两侧腹股沟区域皮下注射 250 µL 预热的无菌 0.9% 氯化钠溶液。

接下来，将100微升发光铜绿假单胞菌菌株悬液加入一支配有27号针头的500微升结核菌素安全帽注射器中，然后通过透明薄膜敷料向每个伤口注入40微升菌液。确保菌悬液充分混匀，且透明敷料完好无损。务必仅用针头斜面朝上刺穿透明敷料一次。

然后将小鼠放回饲养笼中，置于加热板上并进行监测，同时在笼底的饲料颗粒之间夹入高热量营养补充膏。将剩余的接种物接种于LB琼脂平板上，培养后计数菌落，以确认实际给予的细菌数量。对于感染伤口的活体成像，转运小鼠至成像仪器及返回过程中需遵循生物安全二级防护规程，并将麻醉后的小鼠置于成像室内的俯卧位。

在成像软件中，根据实验需求设置曝光时间、像素合并（binning）、光圈值（f-stop）和视野范围。接下来，在伤口位置创建感兴趣区域，并测量以每秒光子数为单位的平均检测通量。为测量背景信号，在成像平台上的随机区域创建另一个感兴趣区域，并从检测信号中减去该区域每秒的背景光子数。

实验结束时，在生物安全柜中使用无菌剪刀和镊子切除创面组织，将每个创面置于含有1毫升无菌PBS的1.5毫升聚丙烯管中。用剪刀将创面组织剪碎，然后将组织碎片置于摇床中，在4°C、300转/分钟的条件下孵育2小时。孵育结束后，每管涡旋振荡10秒，随后用PBS对细菌洗出液进行系列稀释，并将稀释后的细菌洗出液接种至LB琼脂平板，以定量细菌负荷。

通过成像光学系统获得的代表性图像表明，该模型可产生可检测的发光信号。在本实验中，感染在接种后第3天达到高峰，并持续至接种后第7天，此结果基于生物发光信号和菌落计数两种方法确认。对从伤口分离的细菌进行培养，进一步证明每处伤口的定量菌落形成单位与检测到的发光信号呈相关性。

尽管注射后小鼠体重会立即出现快速下降，但通过生理盐水注射和补充营养可使其恢复至初始体重。经计算，导致50%伤口发生显著感染的接种剂量约为每毫升7.7 × 10²菌落形成单位。当剂量高于每毫升1 × 10⁴菌落形成单位时，感染率达到100%。

在创伤和接种操作后，可应用多种局部和全身治疗方法，以研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的潜在新疗法。所有涉及铜绿假单胞菌及感染小鼠的操作均应遵循研究人员所在机构的生物安全和动物使用委员会指南，在BSL-2安全防护条件下进行。