通过基因表达分析的改良方法从谷物种子获取高质量的转录数据

这种微阵列杂交方法可用于比较来自生物体和已知基因组的大量样本。与高吞吐量排序方法相比，该方法生成的数据量更易于处理，而且可以更经济地进行分析。证明这个程序的将是克里斯蒂安·塞勒博士，一位博士后科学家，在加斯特莱本的IPK的Rosis研究小组工作。

在使用基因表达杂交试剂盒进行微阵列杂交之前，请根据制造商的规格准备 10X 阻尼剂，并在 200 微升体积中对由此产生的阻断剂进行等分。然后，将阻塞代理存储在零下 20 摄氏度，直到使用。在微阵列杂交的当天，将10倍阻隔剂的10倍等分解冻，将杂交炉预热至65摄氏度，将热块预热至60摄氏度。

按照制造商描述的每个样品准备碎片混合，并在涡流上轻轻混合样品。涡旋后，在微离心中短暂旋转样品，然后在60摄氏度的热块中孵育30分钟。在孵化结束时，立即冷却冰上每个管子一分钟，然后用25微升的2X基因表达杂交缓冲液停止碎裂，每管每分钟高转。

与温和的移液混合，注意不引入任何气泡，并在环境室温下离心管。在旋转结束时，立即将所有管子放在冰上，并尽快将每个样品装入微阵列幻灯片中。接下来，缓慢地将每个杂交混合物的44微升分配到每个垫片孔的中心，注意避免冒泡，并将44微升杂交缓冲液添加到任何未使用的油井中。

立即将微阵列滑轨放在垫片滑轨顶部的正确方向，注意不要溢出任何液体，并紧密关闭混合组件。旋转组件以确认缺少固定气泡，并将杂交室组件放入混合烤箱旋转器中。将旋转速度设置为每分钟 10 圈，然后在 65 摄氏度下开始杂交，时间整整 17 小时。

当样品混合时，在适当的洗涤缓冲液中准备三个洗涤盘组件，如表中所述。经过整整 17 个小时的杂交，在实验室长椅上拆解一个混合室，用无绒纸衬里，将一个微阵列三明治转移到一个包含洗涤缓冲器的盘中，其中微阵列条形码朝上倾斜位置，而不会淹没缓冲器中的整个幻灯片。使用钳子，将两个玻璃滑梯分开，让垫片滑动轻轻地滴入盘子底部，同时牢牢抓住微阵列幻灯片。

缓慢地将微阵列滑轨侧身抬起，立即转移到二盘的微阵列机架中，以最小的接触空气。当所有八个滑轨均匀地放置在机架上时，请将机架架架连接到磁力搅拌器上，然后将整个盘式两个设置装置转移到磁力搅拌器上。轻轻搅拌设置整整一分钟。

在搅拌样品时，将三盘从37摄氏度的培养箱转移到第二个磁力搅拌器上。然后轻轻加入37摄氏度的洗涤缓冲液二盘，不形成气泡。在搅拌孵育结束时，轻轻缓慢地将滑架转移到三盘，然后拆下机架支架。

搅拌整整一分钟后，慢慢地轻轻地从盘子中取下滑架，并使用无绒纸仔细干燥每张幻灯片的两侧，在干燥时将每个幻灯片放入滑箱中。在允许幻灯片干燥 15 分钟后，将每个微阵列幻灯片转移到条形码朝上且将组装的幻灯片架加载到扫描旋转木马中，并根据条形码编号进行顺序排序。然后，立即扫描幻灯片。

在此图中，显示了测试RNA提取质量的运行的代表性结果。在低淀粉含量样品的典型分析中，如大麦叶，叶绿体中额外的核糖体RNA带是很明显的。高淀粉含量样品，如大麦种子，表现出18和28S核糖体RNA。

请注意，由于叶黄体核糖核酸RNA，不能计算绿色植物组织（如叶样本）的自动RNA完整性数值。在这项具有代表性的分析中，对定制大麦微阵列芯片进行了RNA制备和杂交。网格显示了来自芯片每个角落的派生信号示例，包括用于校准的读出点的背景和峰值。

直方图指示可检测点的偏差，具有各自的信号强度。正如所观察到的，成功的杂交技术提供了一条宽阔的高斯形曲线，只有轻微的异常值。此处显示的是检测到信号的质量控制报告。

混合幻灯片的值列为第 2 列，可接受的值范围列在第 4 列中。这种方法可用于解决任何为任何生物体设置的实验，其中有关于基因组的大量信息。在我们的实验室中使用这种技术，我们可以比较和分析生长压力感应后发生的水稻和大麦的转录变化。