Name: 通过基因表达分析的改良方法从谷物种子获取高质量的转录数据 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学习微阵列杂交技术用于谷物转录组分析，从水稻和大麦种子中分离高质量RNA并进行cDNA标记。该方法为基因表达研究提供了经济高效的实验方案，适用于多种基因组已知的生物体。

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本工作得到了CGIAR全球水稻农业粮食系统研究计划（CRP RICE）、面向非洲和南亚的耐逆境水稻（STRASA）第三阶段项目以及德国哈勒（萨勒）作物植物研究跨学科中心（IZN）的支持。我们感谢Mandy Püffeld提供的出色技术协助，以及Isabel Maria Mora-Ramirez博士在小麦芯片方面提供的信息与经验分享。我们感谢德国IPK Gatersleben研究所RH杂种优势研究组的Rhonda Meyer博士对稿件提出的修改意见和审阅。

<ol><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+intact-tissue+sequencing+of+single-cell+transcriptional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li>
<li>Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Developing+Rice+Grain+Transcriptome+Using+the+Agilent+Microarray+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform.</a> Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).</li>
<li>Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzing+plant+science+research+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Catalyzing plant science research with RNA-seq.</a> Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).</li>
<li>Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+methods+for+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq methods for transcriptome analysis.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).</li>
<li>Radchuk, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+profiling+of+starch+biosynthesis+and+degradation+in+the+developing+barley+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain.</a> Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).</li>
<li>Sreenivasulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+seeds%3A+deciphering+the+molecular+mechanisms+of+seed+storage%2C+dormancy+and+onset+of+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination.</a> Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).</li>
<li>Sreenivasulu, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-development+programs%3A+a+systems+biology-based+comparison+between+dicots+and+monocots%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).</li>
<li>Butardo, V. M. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Genetics+Identifies+a+Novel+Regulatory+Domain+of+Amylose+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis.</a> Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).</li>
<li>de Guzman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+glycemic+potential+of+rice+by+unraveling+compositional+variations+in+mature+grain+and+starch+mobilization+patterns+during+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5854(2017).</li>
<li>Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+platforms+and+bioinformatics+tools+for+the+analysis+of+plant+transcriptome+in+response+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress.</a> Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).</li>
<li>Anacleto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+a+genome-wide+association+study+with+a+large-scale+transcriptome+analysis+to+predict+genetic+regions+influencing+the+glycaemic+index+and+texture+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2018).</li>
<li>Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+mapping+of+putative+regulator+genes+of+barley+grain+development+characterized+by+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling.</a> BMC Plant Biology. 9, 4(2009).</li>
<li>Druka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+gene+expression+from+seed+to+seed+through+barley+development%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+%26+Integrative+Genomics%22%5BJournal%5D)">An atlas of gene expression from seed to seed through barley development.</a> Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+Expression+Atlas+In+Reproductive+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rice Expression Atlas In Reproductive Development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+gene+expression+atlas+covering+the+entire+life+cycle+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.</a> The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).</li>
<li>Yamakawa, H., Hakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+rice+grain+filling-related+metabolism+under+high+temperature%3A+Joint+analysis+of+metabolome+and+transcriptome+demonstrated+inhibition+of+starch+accumulation+and+induction+of+amino+acid+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).</li>
<li>Shakoor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sorghum+bicolor+expression+atlas+reveals+dynamic+genotype-specific+expression+profiles+for+vegetative+tissues+of+grain%2C+sweet+and+bioenergy+sorghums%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums.</a> BMC Plant Biology. 14, 35(2014).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+reveals+key+differentially+expressed+genes+involved+in+wheat+grain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Journal%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development.</a> Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).</li>
<li>Kochevenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+QTL+hot+spots+for+malting+quality+in+two+elite+breeding+lines+with+distinct+tolerance+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 18 (1), 106(2018).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

所述方法可获得高产率和高质量的RNA提取物，且结果具有高度可重复性（图1）。根据我们的经验，建议每种基因型、发育阶段或实验条件设置三个生物学重复用于分析。为了能够检测到具有统计学意义的差异，必须考虑mRNA的总体丰度。但请注意，RNA提取步骤需要每份200 mg的组织样本，且需设置三个重复。因此，对于样本量有限的实验（如基因修饰植物材料），该方法可能不适用。
在微阵列杂交过程中，以下步骤最为关键：（1）将样品加载到垫片玻片上（步骤 4.7）以及（2）杂交后洗涤芯片（步骤 4.13 和 4.14）。样品加载时需格外小心，以避免产生气泡或液体溢出。将微阵列玻片放置到已加载样品的垫片玻片上时必须谨慎操作：应使DNA面（带有点样探针的一面）朝下，以利于杂交反应。在微阵列洗涤过程中，第二次洗涤步骤尤为关键：此处需非常缓慢地（10 秒）将玻片从洗涤缓冲液 2 中取出，以避免在玻片上形成缓冲液残留伪影，这些伪影可能干扰后续的数据采集与分析。
为了获得可用于下游生物信息学分析的杂交实验结果，应遵循一些重要标准。在完成上述实验方案后生成的质量控制（QC）报告，能够清楚地提示哪些方面需要改进，以及哪些数据处于可用状态（图3）。首先获得的信息是可视化网格图（图2）。在此图中可直接观察到所有荧光读取区域是否正确对齐。如果存在肉眼可见的偏移，将会影响所有其他数值（如背景值、信号强度等），该芯片的读数则不可使用。在总览图（所有异常值的空间分布）中，可以轻松识别出任何影响结果的污染（例如灰尘或毛发）。污染物可通过轻轻吹扫并重新扫描芯片的方式去除。如上所述，信号强度直方图应呈现为一个宽广的高斯分布曲线，仅有少量离群值（图2）。根据所分析的组织类型（图1），该曲线形态可能有所不同，可能出现双峰，或一个主峰伴随肩峰。这种情况不会影响数据质量。只有当峰值明显偏移，或边缘出现高强度信号时，才提示存在问题，例如&#34;绿色怪物&#34;（荧光强度过高），此类问题无法通过洗涤去除，应向芯片制造商报告。此外，&#34;中位信号空间分布图&#34;的数值应在某一共同值附近波动。该值通常在40至100之间，具体取决于所分析芯片的整体信号强度读数。另一项重要的质量控制是对外源添加对照（spike in）数据的评估：外源添加信号的对数图应呈现为一条线性且规则的直线。最后，&#34;评估指标&#34;表格提供了对所获结果的可靠评估。制造商在该表格中提供了可分类为“优秀”、“良好”和“需评估”的数值范围（图3）。根据我们的经验，部分指标并非始终适用于所有芯片。对于水稻定制芯片，&#34;非对照值&#34;常超出推荐范围，但对后续数据处理无显著影响。此外，&#34;NegControl&#34;的可接受范围可根据组织类型、生物体种类及芯片整体输出情况放宽至&#60;80。根据我们的经验，E1中位值变异系数（E1 med CV）的评估范围也可放宽至&#60;9，而非严格限定为&#60;8。遵循上述原则，即可对所有芯片读数数据进行合理评估。总体而言，应始终牢记：独立的生物学重复始终能提供最可靠的结果。
与其它方法相比，该技术的优势在于其代表了一种经济高效、高通量的转录谱分析方法。此外，其下游数据分析流程更简便且更为成熟。尽管具有优势，该技术仍存在某些局限性，例如可分析的基因数量。微阵列仅能对先前在芯片上点样了探针的基因进行分析。因此，该技术仅适用于已完成基因组测序并具有完整基因注释的植物物种。我们预计，基于微阵列的转录组学不仅在基因表达谱分析方面，而且在其他下游生物信息学分析流程（如基因调控网络分析和全转录组关联研究）中，仍将继续具有重要价值和应用意义。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/60602/obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified">Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling</a>. Two&#160;author&#160;names were&#160;updated.
The&#160;names were&#160;corrected from:
Christianne&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreeenivasulu
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Christiane&#160;Seiler 
Nese&#160;Sreenivasulu

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Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

转录组代表了在特定时间和特定环境及生长条件下，一个生物体基因组所表达的全部核糖核酸（RNA）转录本。每个细胞都有其独特的转录组，反映了该细胞当前的生理和代谢状态。典型的转录组研究通常使用来自相似组织或器官的一群细胞，但单细胞转录组学和空间分辨转录组学正变得越来越流行1。转录组分析始于在特定时间点和明确的生长条件下，从选定组织中提取总RNA。为此，我们推荐使用一种新开发的方法，用于从富含淀粉或糖分的样品（如谷类种子）中提取总RNA2。对不同样品间转录组的比较可鉴定出丰度存在差异的RNA分子，这些RNA分子被称为差异表达基因（DEGs）。来自特定标记基因的转录本丰度可用于评估发育状态，或确定生物体对环境变化的响应。在所研究的各个发育时间点之间转录本丰度无明显变化的基因，通常被用作参考基因或看家基因。
RNA通常通过多种方法进行检测和定量，例如Northern印迹法和定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR），但目前的高通量转录组学方法在很大程度上依赖于使用微阵列技术的核酸杂交以及RNA测序（RNA-Seq）。RNA-Seq目前非常流行，因为它在高通量转录组学应用中具有多项优势，其他综述已有详细阐述3,4。尽管微阵列芯片技术出现较早，但由于其技术更为成熟，且对生物信息学背景要求较低，目前仍被广泛使用。与RNA-Seq相比，微阵列实验产生的数据集更小，更易于分析。此外，其成本效益更高，尤其适用于处理大量样本的情况。在本实验室中，我们常规使用基于微阵列技术的转录组分析，以确定调控谷物生长、发育和代谢过程中分子网络与通路的核心调控枢纽的作用5,6,7,8,9。我们还常规利用该技术开展全基因组基因表达谱研究，以深入理解谷物对非生物胁迫的响应机制10，并开展转录组范围关联分析（TWAS）和连锁作图研究，以鉴定影响谷物品质与营养的相关基因11,12。其他研究团队也已利用微阵列技术构建了大麦13、水稻14,15,16、高粱17和小麦18的发育特异性基因表达图谱。
本文的目的是提供一种简要的文字概述和详细的视觉描述，介绍我们实验室目前使用安捷伦（Agilent）微阵列平台对谷类籽粒进行转录组分析所采用的方法。请注意，虽然存在其他微阵列平台，但本方法中不涉及这些平台。本实验方案首先详细描述了从发育中或萌发中的谷类种子中提取RNA的过程。根据我们的经验，获得高质量和高产量的转录组以用于后续转录组学分析，往往是使用谷类种子组织时的瓶颈。我们曾尝试多种市售的RNA提取试剂盒，但均未获得满意的结果。因此，我们开发了一种化学提取方法，先获得粗RNA提取物，再利用市售试剂盒进行柱纯化。采用该方法，我们常规且可重复地获得了高质量的RNA2（图1），可用于多种下游应用以生成转录组谱型。

<table><tbody><tr><td>&amp;szlig;-巯基乙醇</td><td>Roth</td><td>4227.3</td><td>使用前立即向20 mL RNA提取缓冲液中加入300 μl</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>安捷伦科技</td><td></td><td>测定RNA提取物的质量和数量</td></tr><tr><td>碎冰机制备器</td><td>不同品牌</td><td></td><td>在样品处理过程中将样品保持在冰上</td></tr><tr><td>杜瓦瓶</td><td>不同品牌</td><td></td><td>用作液氮容器</td></tr><tr><td>乙醇，纯</td><td>Roth</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>基因表达杂交试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>5188-5242</td><td>&lt;strong&gt;试剂盒组分：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 2X Hi-RPM 杂交缓冲液&lt;br/&gt; 25X片段化缓冲液&lt;br/&gt; 10X基因表达阻断剂</td></tr><tr><td>基因表达洗涤缓冲液试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>5188-5325</td><td>&lt;strong&gt;试剂盒组分：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 基因表达洗涤缓冲液1&lt;br/&gt; 基因表达洗涤缓冲液2&lt;br/&gt; Triton X-102</td></tr><tr><td>加热块</td><td>不同品牌</td><td></td><td>建议至少准备一个用于1.5 ml离心管的加热块和另一个用于2.0 ml离心管的加热块</td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>安捷伦</td><td>G2545A</td><td>用于微阵列杂交的不锈钢烘箱，由Sheldon Manufacturing生产，用于在微阵列中过夜杂交样本。</td></tr><tr><td>杂交垫圈载玻片试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>G2534-60014</td><td></td></tr><tr><td>iQAir 空气净化器</td><td></td><td></td><td>为确保实验在低臭氧区域进行</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>无绒纸，Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>KC34155</td><td></td></tr><tr><td>低输入量快速扩增标记试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>5190-2305</td><td>&lt;strong&gt;试剂盒组分：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; T7引物&lt;br/&gt; 5x 第一链缓冲液&lt;br/&gt; 0.1 M DTT&lt;br/&gt; 10 mM dNTP混合物&lt;br/&gt; AffinityScript RNase抑制剂混合物&lt;br/&gt; 5x 转录缓冲液&lt;br/&gt; NTP混合物&lt;br/&gt; T7 RNA聚合酶混合物&lt;br/&gt; 无核酸酶水&lt;br/&gt; Cy3-CTP</td></tr><tr><td>小型金属刮勺</td><td></td><td></td><td>确保小型金属刮勺能够放入微量离心管中，以便于样品的轻松刮取。</td></tr><tr><td>微阵列扫描仪</td><td>安捷伦科技</td><td></td><td>推荐使用 Agilent SureScan 或 Agilent C 微阵列扫描仪</td></tr><tr><td>微量离心管，无核酸酶</td><td>不同品牌</td><td></td><td>2.0 mL 和 1.5 mL 容量</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>建议至少配备一台常温离心机和一台低温离心机，转子需能够分别容纳24个1.5 ml和2.0 ml离心管</td></tr><tr><td>小型恒温培养箱</td><td>Labnet</td><td>I5110-230V</td><td>任何小型培养箱均可使用。</td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td></td><td></td><td>任何能够耐受使用液氮进行低温研磨的小型陶瓷或大理石研钵和研杵。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Peqlab / Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Biozym</td><td>351900302</td><td></td></tr><tr><td>单色RNA外参试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>5188-5282</td><td>&lt;strong&gt;试剂盒组分：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 单色RNA外参混合物&lt;br/&gt; 稀释缓冲液</td></tr><tr><td>臭氧屏障载玻片盖盒套件</td><td>安捷伦</td><td>G2505-60550</td><td>可选但强烈推荐</td></tr><tr><td>PCR管，0.2 mL，无RN酶</td><td>Stratagene</td><td>Z376426</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇混合液（25:24:1）</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，无核酸酶，带滤芯吸头</td><td>不同品牌</td><td></td><td>适用于 2、20、20、100、200 和 1000 μl 体积</td></tr><tr><td>移液器套装</td><td>不同品牌</td><td></td><td>适用于 2、20、20、100、200 和 1000 μl 体积</td></tr><tr><td>RNA提取缓冲液</td><td>10 mM Tri-HCl pH 8.0&lt;br/&gt; 150 mM LiCl&lt;br/&gt; 50 mM EDTA&lt;br/&gt; 1.5% EDTA&lt;br/&gt; 15 μL/mL &amp;beta;-巯基乙醇</td><td></td><td>我们常规使用 Roth 或 Sigma 的化学品；添加 &amp;beta;每日新鲜配制的β-巯基乙醇</td></tr><tr><td>RNase-free DNase 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>&lt;strong&gt;试剂盒组分：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; RNeasy mini 离心柱（粉色）&lt;br/&gt; 1.5 ml 收集管&lt;br/&gt; 2 ml 收集管&lt;br/&gt; RLT缓冲液&lt;br/&gt; RW缓冲液&lt;br/&gt; 缓冲液 RPE&lt;br/&gt; 无核酸酶水</td></tr><tr><td>RNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74904</td><td>&lt;strong&gt;试剂盒组分：&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; RNeasy mini 离心柱（粉色）&lt;br/&gt; QIAshredder 离心柱（紫色）&lt;br/&gt; 1.5 ml 收集管&lt;br/&gt; 2 ml 收集管&lt;br/&gt; RLT缓冲液&lt;br/&gt; 缓冲液 RLC&lt;br/&gt; 缓冲液 RW1&lt;br/&gt; 缓冲液 RPE&lt;br/&gt; 无核酸酶水</td></tr><tr><td>DNA 微阵列扫描仪用载玻片架</td><td>安捷伦</td><td>G2505-60525</td><td></td></tr><tr><td>可拆卸支架的载玻片染色皿</td><td>DWK Life Sciences 900200</td><td>Fisher Scientific 08-812</td><td>我们推荐 DWK Life Sciences Wheaton&amp;trade; 带可拆卸架的玻璃20片染色皿（含皿、盖和玻璃载片架）</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Roth</td><td>P029.1</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>不同品牌</td><td></td><td>可于 -80 保存样品 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>不同品牌</td><td></td><td>至少一个用于单管涡旋混合器，另一个用于可同时涡旋混合多管的设备</td></tr></tbody></table>

通过改良的基因表达谱分析方法从谷物种子中获取高质量转录组数据

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

基因表达的表征依赖于RNA的质量。在萌发、发育及成熟谷类种子中，高淀粉和高糖含量常常阻碍高质量RNA的提取。这些化合物会降低所提取总RNA的产量和质量。总RNA在数量和质量上的下降可能对后续转录组分析产生显著影响，导致无法准确反映待测样品中基因表达谱的空间和/或时间变化。在本方案中，我们描述了一种优化的总RNA提取方法，可获得足够数量和质量的RNA，用于谷类籽粒的全转录组分析。该方法适用于多种下游应用，可用于发育中、萌发中及成熟谷类种子的转录组谱型分析。文中展示了基于微阵列平台的转录组谱型分析方法。该方法专为具有已知基因组序列的谷类作物基因表达谱分析而设计。详细描述了从微阵列操作到最终质量控制的完整流程，包括cDNA合成、cRNA标记、微阵列杂交、芯片扫描、特征提取以及数据质量验证。通过该方法获得的数据可用于表征谷类在萌发过程、籽粒发育不同阶段，或不同生物和非生物胁迫条件下的转录组。本文展示的结果示例表明，所获得的高质量转录组数据适用于后续生物信息学分析，例如差异表达基因（DEGs）的鉴定、基因调控网络的表征，以及全转录组关联分析（TWAS）的开展。

本方法针对含有大量淀粉或糖类污染物的谷类种子样品提取进行了优化。该方法设计为每天提取24个种子样品的总RNA。整个流程建议在一天内连续完成，但方案中已标明若干可选的暂停节点。此外，读者也可使用其偏好的RNA提取试剂盒或手动化学提取方法。然而，根据我们以往的经验，市面上的植物RNA提取试剂盒由于种子中含有大量淀粉、蛋白质、糖类和/或脂质污染物，通常不适用于种子样品。在本方法中，首先通过化学法提取粗制RNA，随后使用商业RNA提取试剂盒进行柱纯化。该组合方式通常可获得更高纯度和得率的RNA。图1展示了采用本方法提取RNA后，通过BioAnalyzer检测RNA质量的结果。图中展示了大麦叶片（样品1和2，代表低淀粉含量样品）和大麦种子（样品3和4，代表高淀粉含量样品）的检测结果。所有样品的RNA完整性（RIN）值均为10。
图1展示了纯化RNA提取物的代表性凝胶图像，其质量通过Bioanalyzer进行检测。样品1和2为低淀粉含量样品（如大麦叶片）的典型结果，可见叶绿体来源的额外rRNA条带。样品3和4为高淀粉含量样品（如大麦种子）的代表性结果，显示18S和28S rRNA条带。需要注意的是，由于叶绿体rRNA的存在，绿色植物组织（如叶片样品）无法自动计算RIN值。然而，可通过观察是否出现降解产物（通常表现为低分子量弥散条带）来直观判断RNA的完整性和高质量。根据本文所述方案，高淀粉种子样品（如大麦种子）的RIN值通常可达10。
此外，本文还展示了一项代表性的时间过程实验数据，该实验使用两个优质大麦自交系（Sofiara 和 Victoriana）进行麦芽品质分析19。在麦芽制备过程中，淀粉被转化为糖类，因此样品代表了具有不同淀粉与糖含量比例的组织。由于工业麦芽制备过程类似于种子萌发过程，因此我们对两种麦芽品质不同的大麦品系进行了转录组分析。从吸胀后 2、24、48、72、120、144 和 196 小时的萌发种子中提取 RNA，每个时间点设三个生物学重复。RNA 的制备及杂交至定制的大麦微阵列芯片的操作步骤如上所述。图 2 显示了微阵列杂交的标准化网格读数，该数据来自质量控制（QC）报告（图 3）中的结果，以及检测信号的直方图。网格示例展示了芯片各角落产生的信号，包括用于校准的背景和 spike-in 读数点。直方图则反映了具有相应信号强度的可检测点的分布偏差。成功的杂交应呈现一个宽广的高斯分布曲线，仅存在少量离群值，如图所示；失败的杂交可能导致曲线显著偏向一侧（“绿色怪物”）。
最后，可接受值的代表性结果如图3第4列所示。为了评估实验的可靠性，进一步使用GeneSpring软件对结果进行分析。所收集的数据以主成分分析（PCA）形式呈现。PCA将所选点（基因）的值整合为向量。所使用的分析点数量可从数百个到整张芯片不等，具体取决于所用软件。每张芯片（样品）产生一个由分析点的整合信号强度得出的值（向量）。因此，图中（PCA）各样品的相对位置反映了它们之间的相似性：样品间距离越近，相似性越高。技术重复应比生物重复更接近，而同一样品的生物重复应比来自不同时间点、组织或条件的样品更紧密地聚集在一起。
<img alt="显示DNA分离结果的凝胶电泳图像，含有核苷酸大小标记的ladder。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：使用Bioanalyzer检测RNA质量后获得的电泳图谱结果汇总。 样品1和2为大麦叶片组织，可见来自叶绿体的额外核糖体条带。样品3和4为大麦种子组织，显示18S和28S rRNA条带。对于叶片等绿色组织，RIN值并非总能计算得出，但根据凝胶结果判断，RNA质量非常好。样品3和4的RIN值为10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光图样的显微镜图像；分析信号分布的直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：大麦微阵列杂交成功的质量控制报告。 芯片各角落的网格中均检测到信号，以“+”表示。直方图显示了经背景扣除并取对数后，按信号强度（荧光）分级的信号数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="评估指标表格；数据分析结果包括信号、斜率和检测限的数值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60602/60602fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：杂交与扫描后质量控制（QC）的汇总。 杂交玻片的数值列于第2列（数值），可接受数值范围显示在第4列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60602/60602fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>洗涤室组件</td>
			<td>内容与标签</td>
			<td>用途</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish 1</td>
			<td>保持空置，放置于实验台直至次日</td>
			<td>次日加入洗涤缓冲液1，用于拆解微阵列芯片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish 2</td>
			<td>加入一个微阵列芯片架和一根小型磁力搅拌子；标记为“Wash Buffer 1”，放置于实验台直至次日</td>
			<td>用于次日使用洗涤缓冲液1清洗微阵列芯片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish 3</td>
			<td>加入一根小型磁力搅拌子，标记为“Wash Buffer 2”，并置于37 °C小型培养箱中</td>
			<td>用于次日在37 °C小型培养箱内使用洗涤缓冲液2清洗微阵列芯片</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：清洗室组件的制备。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>培养皿</td>
			<td>洗涤缓冲液</td>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>拆解</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">室温</td>
			<td rowspan="2">尽可能快</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（步骤 4.13）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第一次洗涤</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1</td>
			<td rowspan="2">室温</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（步骤 4.14）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第二次洗涤</td>
			<td rowspan="2">3</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">37 °C</td>
			<td rowspan="2">1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（步骤 4.15）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：洗涤室组件的孵育温度和时间。

本文介绍了一种用于谷类作物转录组分析的方法。基于微阵列的基因表达谱分析首先从谷物籽粒中分离高质量的总RNA，随后进行cDNA的合成。在完成cRNA标记和微阵列杂交后，本文提供了有关信号检测和质量控制的建议。

基因表达的表征依赖于RNA的质量。在萌发、发育及成熟的谷类种子中，高质量RNA的提取较为困难。

这种微阵列杂交方法适用于对具有已知基因组的生物体的大量样本进行比较。与高通量测序方法相比，该方法产生的数据量更易于处理，并且分析成本更低。本实验操作将由德国加特尔斯莱本IPK研究所Rosis研究小组的博士后科学家Dr. Christiane Seiler进行演示。使用基因表达杂交试剂盒进行微阵列杂交前，根据生产商说明书配制10X封闭剂，并将制备好的封闭剂分装为200微升每份。随后将封闭剂于-20摄氏度保存至使用。在微阵列杂交当天，将一份200微升的10X封闭剂置于冰上解冻，并将杂交 oven 预热至65摄氏度，同时将加热块预热至60摄氏度。按照制造商的说明为每个样本配制片段化反应液，并在涡旋振荡器上轻轻混匀样本。涡旋混匀后，在微量离心机中短暂离心样本，随后在60摄氏度的加热块中准确孵育30分钟。孵育结束后，立即将每支离心管置于冰上冷却1分钟，然后加入25 µL 2倍基因表达杂交缓冲液（每管高速振荡混匀）以终止片段化反应。轻轻吹打混匀，注意避免产生气泡，并在室温下离心管中样品。离心结束后立即将所有管子置于冰上，并尽快将每个样品加载到微阵列玻片中。接下来，缓慢将每种杂交混合液各44 µL加入每个密封垫圈孔的中心，注意避免引入气泡；对于未使用的孔，加入44 µL杂交缓冲液。立即将微阵列芯片以正确的方向放置在垫圈玻片上，注意不要洒出任何液体，并紧密关闭杂交组件。旋转组件以确认无静止气泡存在，然后将杂交腔室组件放入杂交炉的旋转器中。将旋转速度设为每分钟10转，随后在65摄氏度下开始杂交，精确持续17小时。在样品杂交的同时，根据表格中的说明，在相应的洗涤缓冲液中准备好三个洗涤皿组件。杂交恰好进行17小时后，在铺有无绒纸的实验台面上拆卸一个杂交室，将一个微阵列夹心结构转移至盛有第一种洗涤缓冲液的培养皿中，微阵列条形码朝上，呈倾斜位置放置，不要将整个玻片完全浸入缓冲液中。用镊子将两张玻璃玻片分开，同时牢固握住微阵列玻片，使垫圈玻片轻轻滑落至培养皿底部。缓慢地将微阵列玻片侧向提起，立即转移至第二个培养皿中的微阵列架上，尽量减少暴露在空气中的时间。当全部八张玻片均匀放置在架上后，安装架固定器，并将整个第二个培养皿装置转移至磁力搅拌器上。轻轻搅拌，持续时间恰好为一分钟。在搅拌样品的同时，将培养皿三从37摄氏度的培养箱中取出，转移至第二个磁力搅拌器上。然后轻轻将37摄氏度的洗涤缓冲液二加入培养皿三中，避免产生气泡。搅拌孵育结束后，缓慢而轻柔地将载玻片架转移至培养皿三中，并取下架托。精确搅拌一分钟后，缓慢轻柔地将载玻片架从培养皿中取出，使用无绒纸仔细擦干每张载玻片的两侧，并在干燥后立即将每张载玻片放入载玻片盒中。待载玻片干燥15分钟后，将每张微阵列载玻片转移至载玻片架中，使条形码朝上，然后将组装好的载玻片架装入扫描仪转盘，并按条形码编号顺序排列。随后立即对载玻片进行扫描。本图展示了一次检测RNA提取质量的典型实验结果。在对低淀粉含量样品（如大麦叶片）进行常规分析时，可观察到来自叶绿体的额外核糖体RNA条带。而高淀粉含量样品（如大麦种子）则显示出18S和28S核糖体RNA。请注意，由于叶绿体核糖体RNA的存在，无法为绿色植物组织（如叶片样品）计算自动化的RNA完整性数值。在此代表性分析中，按照所示方法进行了RNA制备并杂交至定制的大麦微阵列芯片。网格图显示了来自芯片每个角落的衍生信号示例，包括用于校准的背景和 spike-in 读出点。直方图显示了具有相应信号强度的可检测点的偏差情况。如图所示，成功的杂交会产生一条宽广的高斯型曲线，且仅有少量离群值。此处展示的是检测信号的质量控制报告。杂交玻片的数值列在第二列中，可接受数值的范围显示在第四列中。该方法可用于任何实验体系，适用于基因组信息较为丰富的任何生物。在本实验室中应用该技术，使我们能够比较和分析水稻与大麦在生长胁迫诱导后发生的转录组变化。

obtaining-high-quality-transcriptome-data-from-cereal-seeds-modified

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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