监测来自一滴外周血的T细胞上结合的PD-1阻断抗体

由于该方法使用患者的外周血来确定PD-1阻断抗体结合的细胞，因此可以鉴定出负责抗肿瘤效应和免疫相关不良事件的特定细胞亚群。该方法仅需极少量的血液样本，分析过程简便快捷，仅需一台流式细胞仪即可完成。

首先，将全血样本采集至含有EDTA的采血管中。在每个5 mL圆底聚苯乙烯流式细胞术管中加入1 mL含2%胎牛血清的PBS溶液，涡旋振荡10秒。

然后将20微升全血样本转移至已处理的5毫升圆底试管中。加入20微升含2% FBS的PBS溶液和10微升人源特异性FC受体阻断试剂。充分混匀，并在室温下孵育15分钟。

接下来，加入500微升红细胞裂解缓冲液。充分混匀后，在室温下孵育10分钟。加入4毫升含2% FBS的PBS溶液，于4°C、400 × g离心5分钟。

用移液法吸除上清液。重复洗涤和吸除操作。将细胞重悬于100微升含2% FBS的PBS中，并分至两个离心管中，每管50微升。

加入表面标志物抗体，充分混匀，室温避光孵育20分钟。随后用含2% FBS的PBS洗涤样本两次，方法同前。

用200微升含2% FBS的PBS重悬细胞。将试管插入流式细胞仪，按照推荐方案获取细胞。记录10,000个事件作为淋巴细胞门控，并将流式数据导出为FCS文件用于分析。

在分析软件中打开文件，点击同型对照文件，通过前向散射光与侧向散射光图（FSC vs SSC）观察细胞，并圈选淋巴细胞群。使用FSCH与FSCW、SSCH与SSCW区分单细胞，并将其显示在CD3与CD8或CD3与CD4的散点图上。分别圈选CD8 T细胞和CD4 T细胞。

选择门控细胞，并在PD-1与人IgG4图上显示。然后根据同型对照，选择Q3区域以鉴定与PD-1阻断抗体结合的CD8和CD4 T细胞。本研究中，通过门控策略和流式细胞术分析，检测到PD-1阻断抗体与患者外周血一滴血中获取的T细胞结合。

PD-1 与人 IgG4 的图显示了 PD-1 阻断抗体在 T 细胞上的结合状态。橙色点和黑色点分别表示抗 IgG4 抗体和同型对照染色。在给予 PD-1 阻断抗体之前，不存在人 IgG4 阳性的 CD8 或 CD4 T 细胞，并通过 PD-1 检测抗体确认了 PD-1 的表达。

在给予纳武利尤单抗或帕博利珠单抗后，可通过抗IgG4抗体在T细胞上检测到IgG4，而PD-1检测抗体EH12.1则无法识别T细胞上的任何PD-1。红色、蓝色和绿色门分别表示完全结合、部分结合和结合丧失。当患者停用纳武利尤单抗和帕博利珠单抗后，PD-1阻断抗体与CD8 T细胞结合的状态有所下降。

出现了部分结合，最终完全丧失结合。请务必同时将血样与红细胞裂解液充分混匀。此外，在表面标志物染色前混匀红细胞裂解液是本方法的关键步骤。

如果研究人员能够使用先进的流式细胞仪，可利用越来越多的标志物来评估与PD-1阻断抗体结合的T细胞。该策略可用于分析由PD-1阻断抗体引起的不良事件相关的T细胞表型。采集发生不良事件患者的样本对于评估该策略的有效性至关重要。