将激光捕获微切片和微流体qPCR相结合，分析单细胞的转录曲线:阿片类药物依赖的系统生物学方法

这是一种高度准确且具有成本效益的方法，用于理解单细胞水平的基因表达。这项技术的主要优点是，我们可以在一个批次中装 96 个样品。这种高数量的样本使我们能够识别具有解剖特异性的细胞亚酚型。

这种方法的管道可以应用于任何生物问题，任何系统，任何组织，以询问单个神经元或其他细胞类型对疾病或任何其他干扰，任何功能的单个细胞反应。然后进一步询问这些细胞反应是否有解剖结构。将大脑从组织收集盒中取出，放在低温箱夹上。

通过解冻将10微米部分安装到普通玻璃幻灯片上，收集10微米部分，其中包含杏仁核或其他首选大脑区域的中央核。立即将玻璃滑到放在干冰上的金属平底锅上。尽快将带大脑部分的幻灯片放入零下 80 摄氏度的冰柜中。

要执行乙醇和二甲苯脱水系列，首先将幻灯片浸入 75%乙醇中 30 秒。紧接着，将滑梯浸入95%乙醇中30秒。然后浸入100%乙醇30秒。

最后，将幻灯片直接浸入第二个容器中，100%乙醇，30秒。乙醇脱水系列后，将幻灯片浸入新鲜浇注的二甲苯中一分钟。紧接着，将幻灯片浸入第二个二甲苯容器中四分钟，然后干燥，如文本协议中所述。

使用荧光识别感兴趣的区域中的染色细胞类型及其核。如果执行单个单元格池样本，请选择一个单元格或多个单元格。使用激光捕获显微切除或 LCM 软件标记感兴趣的细胞。

将 LCM 盖放在感兴趣区域的切片上，然后将 LCM 盖胶粘剂熔化到所选单单元的区域上，如文本协议中所述。使用 LCM 软件工具选择要收集的单个单元格进行分析。选择细胞必须位于杏仁核中心核的解剖区域，该解剖区域基于大鼠大脑图集和白细胞。

细胞应至少来自相邻的染色核三微米。然后发射红外激光收集识别的单个细胞。将盖放在 QC 站中并查看它，以确保只选择了所需的电池。

如果误选了其他细胞，当盖留在QC站时，紫外线激光可以用来摧毁不需要的细胞。从收集细胞的组织部分拍摄照片，记录其解剖特异性。使用大鼠大脑图集作为参考，记录切片与小面包片的距离（如果适用）。

从 QC 站上卸下 LCM 盖并连接样品提取装置。然后移液器5.5微升的解液缓冲液到样品上。将萃取装置安装到 0.5 毫升微离心管上，并在 75 摄氏度的热板上放置 15 分钟。

低速旋转样品和裂解缓冲液 30 秒，将采集的样品放入零下 80 摄氏度的冰柜中。为了对动态阵列芯片的单细胞mRNA进行预扩增，首先在新96 x 96 PCR板的每个井中添加5个5X VILO微升。从零下80摄氏度取出LCM单细胞样品，让它们短暂解冻。

在低速离心后，将 5.5 微升的 lysed 单细胞样品添加到 PCR 板中，将每个样品添加到自己的井中。将带样品和 VILO 的 PCR 板放入热循环器中，在 65 摄氏度下加热 1 分半钟。然后在1300倍的g和4摄氏度下旋转一分钟，然后将盘子放在冰上。

将10X cDNA合成主混合物、T4基因32蛋白和DNA悬浮液缓冲液添加到每个井中。将样品板一的 PCR 板放入热循环器中，并在文本协议中详细运行。循环后，在96井PCR板的每一个井中加入9微升的Taq聚合酶溶液。

9微升由7.5微升的塔克聚合酶主混合和1.5微升的底塑池组成。现在，将PCR板放在热循环器中，并运行文本协议中详细介绍的预扩增程序。按照预扩增方案，在96井PCR板的每个井中加入6微升的外核酸酶溶液。

外核酶溶液由0.6微升10X外阴性酶-一反应缓冲液、1.2微升外核酸酶一和4.2微升DNA悬浮缓冲液组成。将 PCR 板放在热循环器中，然后运行文本协议中列出的程序。最后，在样品板一井的每个井中加入54微升TE缓冲液。

将 PCR 板旋转 1，300 次 g 五分钟。如果立即继续执行下一步，请储存在摄氏四度。在样品板二的新的96井PCR板中，加入5微升DNA结合染料和主混合溶液。

将样品板一中的三微升预放大样品加入样品板二中的相应孔中。旋转PCR板1，300倍g，然后将板放在冰上。在一个新的96井PCR板，这是检测板2，添加五微升的测定装载溶液到每一个井。

检测加载溶液包括3.75微升2X GE测定加载试剂和1.25微升DNA悬浮缓冲液。然后从检测板一向其相应的井中加入2.5微升10微摩尔qPCR底剂。将 PCR 板旋转 1，300 次 g 五分钟。

要加载和运行动态阵列芯片，首先使用控制线流体对芯片进行热化。然后将芯片放在 IFC 控制器 HX 中，然后运行主 136X 脚本。在96比96动态阵列芯片中，将样品板2中的6微升加入相应的样品孔中。

现在，在96由96比96动态阵列芯片中，从检测板2中加入6微升。使用针头在 96 by 96 动态阵列芯片的孔中弹出任何气泡。然后将芯片放入 IFC 控制器 HX 并运行负载混合 136X 脚本。

接下来，从 IFC 控制器 HX 上卸下芯片。将 96 by 96 动态阵列芯片放入微流体 RT-qPCR 平台，运行 GE 快速 96 到 96 PCR 协议。单细胞的选择在视觉和分子上均得到验证。从视觉上看，细胞形态在细胞采集之前被查看。

这里展示的幻灯片是包含杏仁核中央核的被社会细胞的幻灯片。随后的图像显示单个细胞的选择及其从组织中去除进行转录分析。在分子上，细胞类型特异性标记在各自的细胞类型中表现出更多的表达。

具体来说，在神经元中观察到NeuN的表达增加，在微胶质中的Maf和在星细胞中的Gfap中观察到Nen的表达增加。热图显示了40个测定基因中所有样本的表达。行是拉伸池样本，数字表示样本聚类，列是基因。

多变量分析方法表明，提取组中的星细胞是受影响最大的细胞类型。根据其他研究的这些数据，在阿片类戒断过程中，星核细胞可能在杏仁核中心核的炎症中发挥关键作用。关于这项技术，要记住的最重要的事情是使用适当的移液器来限制气泡的数量。

这些实验的转录结果可以使用蛋白质测量方法（如免疫荧光或同一组织上的西方印迹）进行验证。