膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

膜和细胞壁选择性荧光染料是分析细胞器动态和活真菌细胞的重要工具。我们的方案提供了应用这些染料作为真正活体染色剂所需的关键理论背景和实用操作指南。关键在于使用极低浓度的染料，以避免因染料饱和或染料毒性引起的细胞伪影，同时仍能获得良好的信噪比，从而实现高质量、长时间的活细胞成像。

我们与医科大学核医学系的同事合作，近期利用这些染色技术开发了一种用于图像引导诊断烟曲霉感染的新型方法。实时监测膜和细胞壁结构的能力对于确定实验药物化合物的摄取动力学至关重要。开始该实验前，首先获取已制备好的预培养物。

使用无菌解剖刀从预培养物菌落边缘切取一小块带有非产孢菌丝的琼脂块。将该琼脂块置于新鲜固体培养基平板的中央，以接种实验培养物。根据拟培养的发育阶段，对实验培养物进行培养孵育。

样品制备较为精细，且图像采集参数的优化相对复杂。通过视觉演示结合口头讲解，可显著提高实验的可重复性。在装载样品时，准备一块洁净的 24 × 60 毫米玻璃盖玻片，并在其中心加入 18 µL 液体最小培养基或生理盐溶液。

取2微升已配制的20微摩尔染料工作液，加入盖玻片中心的液滴中，通过反复吹打数次充分混匀，注意避免产生气泡。使用洁净的手术刀从菌落边缘切取一块15毫米×15毫米的样品，将其垂直放置在盖玻片上的培养基液滴旁。用手术刀支撑样品块的上边缘，同时用手指固定样品块的背面以保持其位置稳定。

然后，缓慢将带有菌丝体的一侧放入液体中。将制备好的样品固定在显微镜载物台上。首先，根据文本方案中的说明，调整基本的图像采集参数，以捕获单个菌丝的动态行为。

对于内吞作用摄取实验，请参考文字方案中的图1和表1，以确定显微镜系统上适用于FM 143或FM 464的最佳激发和发射参数，并相应调整系统中的这些设置。使用先前调整好的参数开始图像采集并评估结果。随后，根据实验所关注的质膜或内吞作用动态特征，优化图像采集参数，使其达到所需的空间和时间分辨率。

对于细胞壁动态的研究，请参考文字方案中的图4和表1，以确定所用细胞壁染料的最佳激发和发射参数，并相应调整显微镜系统的设置。使用先前调整好的参数开始图像采集并评估结果。随后，优化图像采集参数，使其达到实验所关注的细胞壁形态发生过程所需的时空分辨率。

除了可视化细胞过程外，活细胞成像还允许从记录的数据中提取定量信息。以FM 464摄取实验为例，真菌样品以菌落形式培养，并通过倒置琼脂块法进行装载。该实验鉴定出在棘孢木霉（Trichoderma atroviride）特异性蛋白SFP2的基因敲除突变体和基因过表达突变体中，内吞作用在时空组织上存在缺陷。

此处展示了FM 464与靶向内吞区室的荧光融合蛋白共染色的示例。该共染色方法用于将两种增强型绿色荧光蛋白标记的跨膜蛋白SFP 2和GPR 1在短梗霉属绿色木霉（Trichoderma atroviride）中的亚细胞分布与内吞途径相关联。FM 464共染色在鉴定形态发生差异中的一个应用实例表明，该技术可进一步揭示荧光标记的BUD-6极性复合体蛋白的亚细胞定位动态与某些依赖运输过程（如隔膜形成和极性菌丝尖端生长）终点之间的关系。

该研究还表征了野生型与突变型粗糙脉孢菌（neurospora crassa）在亚细胞结构和菌丝构型上的差异。代表性细胞壁染色结果显示，荧光增白剂（calcofluor white）、溶苯黄（solophenyl flavine）和刚果红（congo red）与细胞壁多聚物的不同相互作用特性，凸显了棘孢木霉（trichoderma atroviride）ΔSFP2突变株与野生型菌株之间的形态发生学差异。与野生型相比，突变株在较高染料浓度所引起的细胞壁胁迫下，其胁迫响应发生得更快且更为显著。

此外，相同的图像可用于量化两种菌株在菌丝直径和隔膜间距方面的形态发生差异。细胞壁生物合成的代表性实时监测表明，极低浓度的棉酚白（calcofluor white）可防止染料分子在细胞壁中饱和，从而实现对细胞壁生物合成的定量实时监测。这揭示了新细胞壁物质的沉积并非均匀分布，而是会迅速响应菌丝细胞间附着后、在粗糙脉孢菌（neurospora crassa）发生皮层融合前，因细胞相对位移所导致的局部物理应力。

越少越好。使用尽可能少的染料，以避免荧光标记物对细胞过程产生干扰。按照本方案，可进行光漂白后荧光恢复实验，以定量分析物质运输与生物合成动力学。

在21世纪初，膜和细胞壁染色技术在丝状真菌中的开创性引入，真正彻底改变了我们观察真菌的方式。荧光增白剂Calcofluor white可引起眼部刺激，且被归类为致癌物。刚果红具有致癌性和致畸性，因此在操作这些染料时请佩戴眼部和皮肤防护装备。