Name: 膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学习使用低浓度荧光染料对丝状真菌进行活细胞成像的技术，以实时追踪细胞膜动态、内吞/外排作用及细胞壁形态发生。该方法适用于Trichoderma atroviride和Neurospora crassa等模式生物的研究。

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感谢蒂罗尔科学基金（TWF）向 AL 提供的 #256524 号资助，维也纳科学与技术基金（WWTF）向 SZ 提供的 #LS13-086 号资助，以及因斯布鲁克大学出版基金对开放获取出版的支持。作者还感谢因斯布鲁克大学动物学系提供 Leica TCS SP5 II 共聚焦激光扫描显微镜。

1. 真菌样品的制备
<ol>
	<li>真菌预培养
	<ol>
		<li>将目标菌株接种至适宜的固体琼脂培养基上，例如 Trichoderma atroviride 使用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），Neurospora crassa 使用Vogel最小培养基（VMM）。若使用转化菌株，需添加适当的筛选标记。</li>
		<li>在生物体最适温度下培养预培养物。例如，T. atroviride 在25 °C，N. crassa 在30 °C，并采用12 h/12 h光照/黑暗循环，直至菌丝体开始产孢但尚未到达培养皿边缘。在标准尺寸的培养皿（9.2 cm Ø）上，野生型 T. atroviride 通常需要4–6天，而野生型 N. crassa 平均在3–4天即可达到此阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>真菌菌落的培养
	<ol>
		<li>使用无菌手术刀，从预培养菌落边缘切取一块携带非产孢菌丝的小型3 mm × 3 mm琼脂块。</li>
		<li>将琼脂块置于新鲜固体培养基平板中央，以接种实验培养物。</li>
		<li>根据拟研究的发育阶段，进行实验培养。例如，野生型 T. atroviride 在PDA培养基上于25 °C避光培养20–22小时，可形成直径约2 cm的菌落；而野生型 N. crassa 在VMM培养基上于30 °C避光培养14–16小时后，菌落直径可达约4 cm。 
		注意：避光培养可防止色素形成，从而避免自发荧光。为消除实验培养物中的培养基背景荧光，可用1.5% w/v透明凝固剂（见材料表）替代琼脂，并用明确的最低限度培养基替代任何复合培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固体萌发菌培养物的培养
	<ol>
		<li>使用5 mL无菌生理盐水（0.9% w/v NaCl）从预培养平板上收集分生孢子，并将所得孢子悬液收集至15 mL螺口离心管中。</li>
		<li>通过剧烈涡旋充分混匀孢子悬液，随后将其过滤至一段预先装入1 mL移液器吸头（预先组装并高压灭菌）的1 cm × 5 cm无菌滤膜条（见材料表）中，滤入新的无菌离心管。</li>
		<li>使用细胞计数板测定孢子密度，并用生理盐水配制浓度为1 × 107 个细胞/mL的孢子悬液。 
		注意：孢子悬液可在4 °C保存最多两周。</li>
		<li>准备一个标准尺寸的培养皿（9.2 cm Ø），加入20 mL固体培养基，并在其表面放置15–20颗无菌玻璃珠（3 mm Ø）。</li>
		<li>将200 µL孢子悬液滴加至培养基表面，通过轻轻摇动使细胞均匀分布于整个培养皿。随后将玻璃珠收集至盛有70%乙醇的烧杯中以备重复使用。</li>
		<li>根据拟研究的发育阶段进行实验培养。例如，T. atroviride 野生型在PDA培养基上于25 °C避光培养5–6小时即可形成分生孢子萌发菌，而 N. crassa 野生型在VMM培养基上于30 °C避光培养3–4小时后即可形成分生孢子萌发菌。 
		注意：为消除实验培养物中的任何培养基背景荧光，可用1.5% w/v透明凝固剂替代琼脂，并用明确的最低限度培养基替代任何复合培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液体萌发菌培养物的培养
	<ol>
		<li>向8孔腔载玻片的每个孔中加入190 µL液体培养基。</li>
		<li>加入10 µL浓度为1 × 107 个细胞/mL的孢子悬液（按步骤1.4.1–1.4.3制备），并通过轻柔吹打数次混匀。最终每孔细胞总数为1 × 105 个。</li>
		<li>根据拟研究的发育阶段进行实验培养。例如，T. atroviride 野生型在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中于25 °C避光培养5–6小时可形成分生孢子萌发菌，而 N. crassa 野生型在液体VMM中于30 °C避光培养3–4小时后即可形成分生孢子萌发菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 染料工作液的配制
<ol>
	<li>为确保每种染料完全溶解，按适当用量（见表1中的精确质量）将染料加入1 mL 100%二甲基亚砜（DMSO）中，配制成2 mM的储备液，并通过涡旋充分混匀。 
	注意：务必从带有隔膜密封的瓶中取用DMSO；其应为澄清透明的液体。DMSO接触空气后会变为棕色——可能是由于痕量杂质被氧化所致——可能对细胞生长或染料染色产生不利影响。</li>
	<li>使用0.2 µm注射器滤膜将储备液过滤除菌，收集至新的无菌1.5 mL离心管中。为减少染料褪色，用铝箔包裹离心管。 
	备注：染料储备液可分装成小份保存，以避免反复冻融，并可在4 °C下保存数月。</li>
	<li>在新的无菌1.5 mL离心管中，将2 µL染料储备液溶于198 µL无菌蒸馏水中，配制成20 µM的染料工作液。为减少染料褪色，用铝箔包裹离心管。 
	备注：染料工作液应在实验当天新鲜配制。</li>
	<li>在样品封片过程中（见第3节），染料工作液通常按1:10比例稀释，最终染料浓度为2 µM，DMSO终浓度为0.1%（w/v）。 
	备注：通过简单调整染料工作液与封片液的体积比，选择不同的稀释倍数，可方便地调节所需的最终染料浓度。 
	注意：为防止染料或DMSO毒性带来的非预期效应，稀释倍数不应低于1:4，以确保染料终浓度不超过5 µM、DMSO终浓度不超过0.4%（w/v）。过高的染料浓度会迅速导致系统饱和，影响信号定量的可靠性；而DMSO浓度超过0.5%（w/v）（≥ 62.5 mM）则可能干扰细胞发育38。</li>
</ol>
3. 显微镜观察的样品制备
<ol>
	<li>采用倒置琼脂块法固定真菌菌落（步骤1.2）或固体菌丝萌发培养物（步骤1.3）的样品。
	<ol>
		<li>准备一片洁净的24 mm × 60 mm玻璃盖玻片（#1，厚度为0.13–0.16 mm），并在其中心加入18 µL液体基本培养基（VMM或M9）或生理盐溶液。</li>
		<li>向18 µL液体中加入2 µL的20 µM染料工作液，通过反复吹吸数次充分混匀，注意避免产生气泡。 
		注意：当处理多个样品时，建议预先配制染料与液体的混合母液，以确保整个实验中染料浓度一致。</li>
		<li>使用洁净的解剖刀从菌落或固体萌发培养物边缘切取一块15 mm × 15 mm的样品，并将其垂直放置在盖玻片上的液滴旁。</li>
		<li>用解剖刀支撑琼脂块上缘，同时用手指固定其背面，缓慢将带有菌丝或萌发体的一侧降至液体表面。此时样品已准备好转移至显微镜载物台。 
		警告：此操作必须缓慢且极其小心，以尽量减少对细胞的机械应力，并防止样品与盖玻片之间夹入气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定步骤1.4中获得的液体萌发培养物。 
	注意：最便捷的方式是将含有液体萌发培养物的多孔载玻片直接转移至显微镜载物台上进行后续操作。
	<ol>
		<li>将22 µL染料工作液加入200 µL液体培养基中，使最终染料浓度为2 µM，DMSO浓度为0.1% w/v。 
		注意：液体萌发培养物的一大优势在于，可在实验任意时间点（包括成像过程中）添加荧光染料或其他化学物质（如抑制剂）。此时需特别注意缓慢加入液体，以免扰动细胞。系统振动和布朗运动本身可能已引起一定程度的细胞移动。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 活细胞显微镜观察
<ol>
	<li>调整基本的图像采集设置。以下图像采集设置可用于捕获单个菌丝中的染色动态，适用于接下来的两种检测方法：
	<ol>
		<li>使用设备最大输出功率的20%中的5–10%作为激光功率。</li>
		<li>使用数值孔径 ≥ 1.2 的60x–63x甘油或水浸Plan Apo物镜。</li>
		<li>通过将图像尺寸设置为1024 x 256像素，并使用2–3倍的光学变焦，将图像采集区域限制在菌丝轮廓范围内。</li>
		<li>采用400 Hz的双向扫描模式，针孔大小调整为1个艾里单位（Airy unit）。</li>
		<li>将最灵敏检测器的增益设为100%。</li>
		<li>进行延时成像时，以每15秒采集一帧的速度开始图像采集，以在避免染料漂白或光毒性的同时获得合理的时序分辨率。</li>
		<li>进行三维成像时，将空间上下限设定为菌丝边界，并以1 µm的间隔设置光学切片，以获得合理的空间分辨率。 
		注意：由于菌丝生长迅速，通常需在Z轴的高空间分辨率与X/Y轴的高时间分辨率之间权衡取舍。只有非常新型的共聚焦激光扫描显微镜才能同时满足这两方面的需求。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内吞作用摄取检测
	<ol>
		<li>参考图1和Table 1，确定显微镜系统上适用于FM 1-43和/或FM 4-64的最佳激发/发射参数，并相应调整。 
		注意：在推荐的2 µM浓度下，FM染料在正常健康细胞的质膜中的掺入是瞬时的。从初始质膜染色到染料出现在管状液泡中的整个过程，通常在室温下30–45分钟内完成。提高FM染料浓度可增加信噪比（S/N-ratio），从而更快获得高对比度图像。然而，这也会加快标记过程，使得细胞器染色的时间顺序更难区分。</li>
		<li>使用上述推荐的基本图像采集设置开始图像记录，并评估结果。</li>
		<li>根据实验所关注的质膜或内吞动态的具体需求，优化图像采集的空间和时间分辨率。</li>
		<li>例如，为捕捉X/Y方向的极快动态，可减小整体图像尺寸，仅采集一个焦平面，并将扫描速率提高至每秒1帧（1 fps）。若需提高Z轴分辨率，则可降低X/Y方向的分辨率，减小图像尺寸，并将光学切片间距减小至0.5 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞壁动态检测
	<ol>
		<li>参考图4和Table 1，确定显微镜系统上所用细胞壁染料的最佳激发/发射参数，并相应调整。 
		注意：由于CFW和SPF的发射光谱较宽，它们不太适合与其他荧光染料（尤其是GFP）同时共聚焦成像。即使在顺序成像中，这些染料也存在一定的限制，因此必须针对具体实验条件进行单独优化。</li>
		<li>使用上述推荐的基本图像采集设置开始图像记录，并评估结果。 
		注意：在推荐的2 µM浓度下，染料掺入细胞壁的过程不一定瞬时完成，但速度合理。例如，隔膜形成的整个过程在室温下平均约需5–7分钟20。提高细胞壁染料浓度可增加信噪比，从而更快获得高对比度图像。然而，这也会因诱导细胞壁损伤修复而迅速引入伪影。</li>
		<li>根据第4.2.3节所述，针对实验所关注的细胞壁形态发生过程，优化图像采集的空间和时间分辨率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益，也无任何需要披露的内容。

本文延续了21世纪初开创性研究的工作，该研究确立了多种荧光染料作为丝状真菌活体细胞器标记物的应用2,4,43，并尝试比以往更详细地探讨FM染料及部分细胞壁染料的光物理性质和细胞生物学特性，尤其关注在染料浓度超过一定阈值时可能引发的非预期细胞效应，例如膜饱和或细胞壁损伤。过去在细胞水平上被认为无毒的染料浓度，如今在分子水平上已被视为具有毒性。尽管这些效应可能非常微弱，且不会直接表现为细胞器或细胞行为的明显改变，但为了准确研究分子的天然功能，必须尽可能减少染料应用除可视化以外的任何潜在干扰。幸运的是，现代探测器（如硅雪崩光电二极管探测器（Si-APDs）44 或Airyscan面阵探测器45）灵敏度和量子效率的提升，使得染料用量可进一步降低。本文另一关键目标是示范这些染料与其他荧光探针（尤其是生物学中最常用的荧光蛋白GFP）共标记成像的特性，以帮助设计成像实验，用于关联分析荧光融合蛋白的亚细胞定位动态与真菌细胞壁、质膜以及内吞与外排途径等之间的关系。
在自然且无应激的条件下成像，是获取可靠数据的关键。关于培养基和样品制备的一些实际考虑，旨在为寻找最佳条件提供一个起点，以实现对健康、无应激细胞进行无伪影、长时间的观察，并在给定样品条件下尽可能获得最高的信噪比。目前尚无通用方法可实现可靠且有意义的成像结果。该方法本身具有如下特性：样品的生物学变异、显微镜操作者的主观判断与预期，以及图像的后期处理，分别对数据采集和解释产生显著影响。因此，显微镜操作者的实践经验、其对所研究真菌细胞生物学的深入了解，以及熟练的样品制备技术，以在实验室环境中尽可能创造“自然”且不受干扰的条件，对于获取和评估真实反映所研究细胞现象的成像数据至关重要。一般而言，只有通过使用低浓度染料（≤2 µM），才能有效避免荧光染料带来的不良副作用，这些副作用范围广泛，从轻微且不易察觉的质膜或细胞壁重塑应激通路的激活，到直接导致细胞自溶的细胞毒性效应。
荧光染料的应用方法简单，但其特异性尚未得到充分表征。使用荧光染料的一个主要优势在于实验方案的制备过程简便。真菌的培养与取样、染料的添加以及载玻片上的制片等步骤（经过练习后）均易于操作。基本成像参数的调整，包括激发和发射波长、曝光时间、时间序列设置等，遵循显微镜的简单生物物理规则以及荧光染料在细胞内的生物学特性。表1旨在帮助研究人员选择最适合实验的染料或染料组合。此外，荧光染料价格合理，易于获取，且质量稳定可靠，因而可确保高度可重复的应用效果。
使用膜或细胞壁选择性荧光染料的两个主要限制在于，通常对其精确染色特性的了解有限，大多数情况下在细胞器和分子水平上缺乏特异性，以及其浓度依赖性的非预期副作用。FM 染料特异性地标记参与内吞和外排作用的脂双层结构。然而，在特定实验条件下，哪些亚细胞器相继被标记尚不明确，需通过比较不同 FM 染料变体并结合其他细胞器特异性标记物进行共标记分析才能确定。例如，FM 1-43 相较于 FM 4-64 更倾向于标记线粒体膜。细胞壁选择性染料对真菌细胞壁的三种主要多糖成分具有不同的特异性。CFW 被认为是非特异性地结合 β-葡聚糖和几丁质，SPF 被认为对 β-1,4-葡聚糖最具选择性，而 CR 则被认为高度特异性地识别 α-和 β-几丁质。目前尚无关于 PFS 与真菌细胞壁多糖结合特异性的公开信息。在特定真菌物种中，给定染料浓度下何种真菌细胞壁多糖成分被最有效标记的问题尚无明确答案，且必须谨慎考虑将其他生物或真菌物种中体外或体内获得的详细测量数据推广应用。遗憾的是，相关文献中此类信息极为稀少且分散35，42，46。目前尚无更新的研究在先前工作33基础上，提供关于这些染料在真菌中特异性染色性质的新见解。
成像对照对于准确评估染色模式和细胞反应至关重要。然而，最具挑战性的部分可能是充分了解真菌的细胞生物学特性，以便能够明确且可靠地将膜和细胞壁特异性荧光染料的亚细胞定位变化、细胞结构的改变或菌丝生长模式的变化，归因于实验处理的预期效应。为此，在开展任何新的活细胞成像实验时，设置良好的对照极为关键。这些对照包括未经处理的野生型样本，作为阴性成像对照，用以排除图像中背景自发荧光和探测器噪声的干扰，并在研究突变体时提供形态学比较基准。此外，阳性成像对照也必不可少，例如表达细胞质GFP或RFP，或其他已知荧光标记蛋白的菌株，可用于将激发光强度调节至所需最低水平，同时作为细胞活力的对照。一旦建立这些对照，荧光染料的使用便不仅限于可视化目的，其浓度依赖性的染色动力学以及浓度依赖性的副作用亦可被系统分析利用；例如，用于实时定量监测细胞壁生物合成过程，或在敏感性检测中识别突变体特异性表型47。
更优的未来应用依赖于对染料染色特性的详细功能分析。当前面临的主要挑战是进一步改进并实现定量图像分析的自动化，以推动对丝状真菌中膜和细胞壁特异性荧光染料亚细胞动态的功能评估。为此，首先需要开展大量定量的共定位研究，将这些染料与已知的细胞器及细胞壁多糖标记物进行共染，并结合在特定转运通路中存在缺陷或缺失特定结构组分的突变菌株进行分析。目前已有多种可用于与FM染料进行比较分析的内吞作用标记物48,49；鉴于真菌细胞壁染料的结合特异性迄今仍 poorly characterized（特征尚不明确），使用荧光标记的葡聚糖特异性抗体50可能是解决该问题的一种可行方案。

二十年前，膜选择性荧光染料FM 4-641的应用彻底改变了对丝状真菌菌丝形态发生及其分子细胞生物学基础的可视化研究方式。随后，人们认识到几丁质结合染料Calcofluor White作为真菌细胞壁动态的活体荧光标记物具有重要价值2。自此以来，这两种染料及其衍生变体已成为真菌细胞器动态活细胞成像分析中不可或缺的工具，并持续为深入了解丝状真菌的生活方式提供前所未有的视角。本文详细介绍了已确立及较少使用的荧光染料在追踪丝状真菌中质膜动态、内吞与外排作用以及细胞壁形态发生方面的应用。内吞作用追踪实验可用于解答与内吞作用通路研究相关的多种细胞生物学问题3。为此，通过延时显微镜记录添加FM染料后标记区室的定位、移动速度和时序进程，并在不同测试真菌菌株之间进行定量比较4。细胞壁染料可清晰界定细胞的外边界，从而实现对形态发生事件的追踪，包括极性菌丝顶端生长2、菌丝分枝5、菌丝融合6,7以及隔膜形成8。此外，这些染料有助于定量分析局部细胞壁沉积情况，并识别细胞壁生物合成过程中的缺陷9。由于对任何荧光标记物的生化与生物物理特性的深入了解是其成功应用于活体实验的基本前提，本文首先总结了本研究所涉及的六种染料的这些特性。
膜选择性染料 
FM（Fei Mao）苯乙烯类染料是一类小分子两亲性化合物，不能穿过生物膜的脂双层，但可逆地结合于脂双层的外层。这类染料在水溶液中几乎无荧光，但一旦插入质膜后即产生强烈的荧光，从而获得优异的信噪比（S/N）11。这些特性使其非常适用于观察质膜及细胞内细胞器的动态过程，包括内吞和外吐作用的追踪12。其中，绿色荧光的FM 1-43和红色荧光的FM 4-64是目前最广泛使用的两种荧光膜标记物。SynaptoGreen C4和SynaptoRed C2是来自其他供应商的通用替代分子，可分别替代FM 1-43和FM 4-64使用10。
苯乙烯染料包含三个关键结构区域：（1）疏水性尾部，可促进染料插入脂双层；（2）荧光团核心，决定染料的光谱特性，由通过一个至三个双键连接的两个芳香环构成；（3）带正电荷的亲水性头部，可防止染料完全插入并穿透膜（图1A）。
疏水尾链越长，染料的疏水性越高，因而与膜的结合亲和力越强，但其水溶性越低，且从膜上脱染的速率也越慢。因此，不同的FM染料变体产生不同的染色动力学和染色模式。在等摩尔浓度下应用时，具有较长C4尾链的FM 1-43因其更高的疏水性，能够比短C2尾链的FM 4-64更快地在质膜和细胞内细胞器上产生更强且更稳定的荧光信号（图2）。
重要的是，FM染料与细胞膜的结合/解离速率始终保持较高水平，单个染料分子的平均滞留时间为1–6秒13，这降低了对膜功能产生局部干扰的可能性，例如因改变膜流动性或迫使膜蛋白发生永久性相互作用而造成的干扰11。这可能是这些分子能够作为活体染料使用的关键原因。然而，FM染料浓度超过50 µM时对真菌和植物细胞具有毒性2,14，来自烟草BY-2原生质体的研究证据表明，当FM染料浓度超过20 µM时会导致质膜饱和14。因此，建议不要超过这一浓度限值，尤其是已有研究表明，仅使用2–5 µM的FM染料即可获得优异的成像效果15,16。
值得注意的是，FM 染料的光谱特性在很大程度上取决于特定的膜微环境（综述见14）。通常情况下，FM 染料在纯溶剂溶液中的激发和发射光谱（通常在产品说明书中提供）与其在细胞环境中的光谱存在显著差异，在大多数情况下，不能直接用于选择活细胞成像的参数设置。例如，FM 1-43 和 FM 4-64 在结合真菌膜后，其激发/发射最大值相较于甲醇溶液分别蓝移了 37/46 nm 和 43/64 nm（表 1）。
FM 4-64 和 FM 1-43 在追踪丝状真菌质膜、内吞/外排作用以及细胞器动态（包括 Spitzenkörper 和线粒体）方面的开创性基本原理，此前已在多种丝状真菌中得到全面记录2,4,17,18,19。适用于多种丝状真菌的两种 FM 染料推荐成像参数如图1B所示。然而，由于所用设备的技术限制，或特定的细胞与实验条件（如培养基、pH 或温度），可能需要对参数进行一定调整。幸运的是，FM 染料具有较宽的光谱范围，使用 514 nm 激发 FM 1-43 或使用 488 nm 激发 FM 4-64 均可获得良好的成像效果。因此，最佳成像参数需针对每种样品类型和具体应用单独确定。
FM 4-64 具有超过 135 nm 的显著斯托克斯位移，使其能够与发射绿光的荧光染料进行优异的同步共成像；这一特性常被用于评估绿色荧光蛋白（GFP）标记的融合蛋白相对于质膜和内吞途径的细胞内定位动态9,20。
细胞壁选择性染料 
Calcofluor White M2R（CFW），也以荧光增白剂28（Fluorescent Brightener 28）之名销售，可能是最广为人知的用于染色细菌、真菌、藻类、高等植物和昆虫细胞壁的荧光染料。该染料最初被用作造纸、纺织和洗涤剂工业中的光学增白剂，但其在真菌感染临床诊断中的应用价值很早就已被认识21,22。由于CFW不可逆地嵌入新生的几丁质链中，因此在细胞壁生物合成过程中会干扰正常的几丁质微原纤维组装，从而引发细胞壁应激23。这反过来会激活细胞壁损伤修复机制，导致葡聚糖和几丁质合成酶被激活，从而在局部增加细胞壁物质的沉积24,25。这种现象可发生于任何通过稳定结合细胞壁多糖而起作用的染料，具有浓度依赖性，并且在菌丝尖端最为明显，因为这些区域是菌丝体中生长最活跃、因而也最敏感的部分（图3）。最近已有研究对响应细胞壁损伤的分子机制进行了全面综述26。
染料过量与光毒性联合作用可导致菌丝区室迅速发生细胞裂解（影片1）。尽管如此，相较于野生型中“活体染色”浓度更为敏感的反应可用于鉴定基因功能缺失突变体在细胞壁生物合成中的缺陷9。对于棉酚荧光增白剂（CFW）和刚果红（CR）——后者是另一种纺织染料，亦称直接红28，被用作真菌和昆虫中α-和β-壳多糖特异性的细胞壁染色剂27,28——已确定强烈诱导壳多糖合成酶的阈值浓度分别为&#62; 60 µM CFW 和 &#62; 70 µM CR，而任一染料浓度&#60;15 µM 时则不会改变或抑制真菌生长29,30,31。Hickey 等人将 CFW 的该阈值浓度定为 25 µM2。因此，建议使用 ≤ 5 µM 的染料浓度，以排除与应激相关的假象，确保这些分子真正作为“活体荧光染料”使用2,32。这一原则同样适用于 Solophenyl Flavine 7GFE 500（SPF）和 Pontamine Fast Scarlet 4B（PFS），它们分别同义于直接黄86和直接红23，是另外两种有用的细胞壁染料，其在真菌中的应用首次报道距今已超过十年33。然而，尽管它们具有显著的光谱特性34,35，这两种染料自那以后的应用仍非常有限36,37。如先前对 1.5 µM CFW 所示2，2 µM SPF 足以在天然条件下以极高的时间分辨率解析细胞壁动态变化（影片2）。使用 2 µM CR 或 PFS 也可获得相同结果。
上述四种染料——CFW、SPF、PFS 和 CR——共同构成了一组细胞壁特异性荧光标记物，覆盖了现代荧光显微镜所使用的几乎整个可见光发射光谱范围（400–700 nm）（图4）。这四种染料在结合细胞壁多聚物后荧光强度均显著增强，这一特性使其具有优异的信噪比。因此，可在染料浓度和激发光强度均保持极低的条件下进行成像，从而将细胞壁染色作为一种“低剂量”活细胞成像技术来实施2。由于这些细胞壁染料无法穿透质膜，它们可同时用作活/死细胞染色剂。值得注意的是，由于 CFW 和 SPF 的发射光谱范围极宽，在与其他荧光染料共成像时需谨慎考虑其兼容性限制。

<table><tbody><tr><td>BRAND 细胞计数板</td><td>Merck</td><td>BR718005</td><td>Thoma 规格</td></tr><tr><td>Calcofluor White M2R</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td>细胞壁染料</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td>水浸物镜</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td>水浸物镜</td></tr><tr><td>刚果红</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>细胞壁染料</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>VWR</td><td>8,36,73,230</td><td>有机溶剂</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-E 配 C1 扫描单元</td><td>Nikon</td><td>custom configuration</td><td>倒置激光扫描共聚焦显微镜，用于获取示例数据 2 和 4</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U 配 Bio-Rad Radiance 2100 扫描单元</td><td>Nikon</td><td>custom configuration</td><td>倒置激光扫描共聚焦显微镜，用于获取示例数据 5</td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>S6814</td><td>膜染料</td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>S6689</td><td>膜染料</td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Rettberg</td><td>1340691030</td><td>3 mm 玻璃珠</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BB02400600A113MNT0</td><td>24 × 60 #1 玻璃盖玻片</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc</td><td>Leica</td><td>15506353</td><td>甘油浸没物镜</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta</td><td>Zeiss</td><td>custom configuration</td><td>倒置激光扫描共聚焦显微镜，用于获取示例数据 3</td></tr><tr><td>M9 最小培养基</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td>通用真菌培养基</td></tr><tr><td>8 孔显微载片</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td>ibiTreat #1.5 聚合物盖玻片</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck/Millipore</td><td>475855-1R</td><td>聚酯过滤材料</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>8,21,472</td><td>92 × 16 mm 培养皿（无卡扣）</td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td>透明凝胶剂</td></tr><tr><td>Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td>油浸物镜</td></tr><tr><td>Pontamine Fast Scarlet 4B</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>212490</td><td>细胞壁染料</td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）</td><td>BD Difco</td><td>213400</td><td>&lt;em&gt;T. atroviride&lt;/em&gt; 的真菌培养基</td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）</td><td>BD Difco</td><td>254920</td><td>&lt;em&gt;T. atroviride&lt;/em&gt; 的真菌培养基</td></tr><tr><td>反应管</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td>1.5 mL SafeSeal 管</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>B.Braun</td><td>5518016</td><td>Cutfix 无菌手术刀 #23</td></tr><tr><td>螺帽管</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,54,502</td><td>15 mL 聚丙烯管</td></tr><tr><td>Solophenyl Flavine 7GFE 500</td><td>CIBA</td><td>1485385V6</td><td>细胞壁染料</td></tr><tr><td>SynaptoGreen C4</td><td>Biotum</td><td>70020</td><td>膜染料</td></tr><tr><td>SynaptoRed C2</td><td>Biotum</td><td>70021</td><td>膜染料</td></tr><tr><td>注射器膜过滤器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>723-9945</td><td>0.45 &amp;micro;m SFCA 注射器滤器</td></tr><tr><td>TCS SP5 II</td><td>Leica</td><td>custom configuration</td><td>倒置激光扫描共聚焦显微镜，用于获取示例数据 1</td></tr><tr><td>Vogel 最小培养基（VMM）</td><td>FGSC</td><td>Fungal Genetics Stock Centre</td><td>&lt;em&gt;N. crassa&lt;/em&gt; 的真菌培养基</td></tr></tbody></table>

膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

利用膜和细胞壁特异性荧光染料对真菌细胞中的细胞器动态进行活细胞成像分析始于二十年前，此后持续极大地推动了我们对丝状真菌生活方式的理解。本文提供了两种膜染料FM 1-43和FM 4-64，以及四种细胞壁染色剂Calcofluor White M2R、Solophenyl Flavine 7GFE 500、Pontamine Fast Scarlet 4B和Congo Red的实际应用指南。重点在于这些染料的低剂量使用以确保无伪影染色、共成像特性及其定量评估方法。所介绍的方法适用于所有可通过所述方式制备的丝状真菌样品。这些基本染色方法可作为适应不同培养条件物种的改良起点。首先，回顾了染料的生物物理和生物化学特性，因为理解这些特性对于将其真正用作活体荧光染料至关重要。其次，提供了详细的分步操作方案，介绍多种真菌样品类型用于荧光活细胞成像的制备流程。最后，通过示例实验展示了以下四种研究策略：（1）鉴定遗传突变体中内吞作用时空组织的缺陷；（2）比较分析内吞途径中GFP标记靶蛋白的共定位特征及其异同；（3）识别遗传突变体中的形态发生性细胞壁缺陷；（4）实时监测细胞壁的生物合成过程。

活性荧光染料是现代真菌细胞生物学中活细胞成像分析的重要工具。本文详细介绍了已知及较少使用的荧光染料在丝状真菌中用于追踪质膜动态、内吞/外排作用以及细胞壁形态发生的应用方法。

荧光染料对膜和细胞壁的选择性在真菌细胞器动态的活细胞成像分析中的应用始于两个……

膜和细胞壁选择性荧光染料是分析细胞器动态和活真菌细胞的重要工具。我们的方案提供了应用这些染料作为真正活体染色剂所需的关键理论背景和实用操作指南。关键在于使用极低浓度的染料，以避免因染料饱和或染料毒性引起的细胞伪影，同时仍能获得良好的信噪比，从而实现高质量、长时间的活细胞成像。我们与医科大学核医学系的同事合作，近期利用这些染色技术开发了一种用于图像引导诊断烟曲霉感染的新型方法。实时监测膜和细胞壁结构的能力对于确定实验药物化合物的摄取动力学至关重要。开始该实验前，首先获取已制备好的预培养物。使用无菌解剖刀从预培养物菌落边缘切取一小块带有非产孢菌丝的琼脂块。将该琼脂块置于新鲜固体培养基平板的中央，以接种实验培养物。根据拟培养的发育阶段，对实验培养物进行培养孵育。样品制备较为精细，且图像采集参数的优化相对复杂。通过视觉演示结合口头讲解，可显著提高实验的可重复性。在装载样品时，准备一块洁净的 24 × 60 毫米玻璃盖玻片，并在其中心加入 18 µL 液体最小培养基或生理盐溶液。取2微升已配制的20微摩尔染料工作液，加入盖玻片中心的液滴中，通过反复吹打数次充分混匀，注意避免产生气泡。使用洁净的手术刀从菌落边缘切取一块15毫米×15毫米的样品，将其垂直放置在盖玻片上的培养基液滴旁。用手术刀支撑样品块的上边缘，同时用手指固定样品块的背面以保持其位置稳定。然后，缓慢将带有菌丝体的一侧放入液体中。将制备好的样品固定在显微镜载物台上。首先，根据文本方案中的说明，调整基本的图像采集参数，以捕获单个菌丝的动态行为。对于内吞作用摄取实验，请参考文字方案中的图1和表1，以确定显微镜系统上适用于FM 143或FM 464的最佳激发和发射参数，并相应调整系统中的这些设置。使用先前调整好的参数开始图像采集并评估结果。随后，根据实验所关注的质膜或内吞作用动态特征，优化图像采集参数，使其达到所需的空间和时间分辨率。对于细胞壁动态的研究，请参考文字方案中的图4和表1，以确定所用细胞壁染料的最佳激发和发射参数，并相应调整显微镜系统的设置。使用先前调整好的参数开始图像采集并评估结果。随后，优化图像采集参数，使其达到实验所关注的细胞壁形态发生过程所需的时空分辨率。除了可视化细胞过程外，活细胞成像还允许从记录的数据中提取定量信息。以FM 464摄取实验为例，真菌样品以菌落形式培养，并通过倒置琼脂块法进行装载。该实验鉴定出在棘孢木霉（Trichoderma atroviride）特异性蛋白SFP2的基因敲除突变体和基因过表达突变体中，内吞作用在时空组织上存在缺陷。此处展示了FM 464与靶向内吞区室的荧光融合蛋白共染色的示例。该共染色方法用于将两种增强型绿色荧光蛋白标记的跨膜蛋白SFP 2和GPR 1在短梗霉属绿色木霉（Trichoderma atroviride）中的亚细胞分布与内吞途径相关联。FM 464共染色在鉴定形态发生差异中的一个应用实例表明，该技术可进一步揭示荧光标记的BUD-6极性复合体蛋白的亚细胞定位动态与某些依赖运输过程（如隔膜形成和极性菌丝尖端生长）终点之间的关系。该研究还表征了野生型与突变型粗糙脉孢菌（neurospora crassa）在亚细胞结构和菌丝构型上的差异。代表性细胞壁染色结果显示，荧光增白剂（calcofluor white）、溶苯黄（solophenyl flavine）和刚果红（congo red）与细胞壁多聚物的不同相互作用特性，凸显了棘孢木霉（trichoderma atroviride）ΔSFP2突变株与野生型菌株之间的形态发生学差异。与野生型相比，突变株在较高染料浓度所引起的细胞壁胁迫下，其胁迫响应发生得更快且更为显著。此外，相同的图像可用于量化两种菌株在菌丝直径和隔膜间距方面的形态发生差异。细胞壁生物合成的代表性实时监测表明，极低浓度的棉酚白（calcofluor white）可防止染料分子在细胞壁中饱和，从而实现对细胞壁生物合成的定量实时监测。这揭示了新细胞壁物质的沉积并非均匀分布，而是会迅速响应菌丝细胞间附着后、在粗糙脉孢菌（neurospora crassa）发生皮层融合前，因细胞相对位移所导致的局部物理应力。越少越好。使用尽可能少的染料，以避免荧光标记物对细胞过程产生干扰。按照本方案，可进行光漂白后荧光恢复实验，以定量分析物质运输与生物合成动力学。在21世纪初，膜和细胞壁染色技术在丝状真菌中的开创性引入，真正彻底改变了我们观察真菌的方式。荧光增白剂Calcofluor white可引起眼部刺激，且被归类为致癌物。刚果红具有致癌性和致畸性，因此在操作这些染料时请佩戴眼部和皮肤防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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实时成像 黑腹果蝇 荧光染料标记的胶质细胞-神经肌肉接头

裂殖酵母的定量活细胞荧光显微镜分析

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用于真菌性叶部玉米病原菌侵染活细胞成像的离体玉米叶鞘

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膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

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