膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

膜和细胞壁选择性荧光染料是分析细胞器动力学和活真菌细胞的重要工具。我们的协议为将这些染料作为真正重要的污渍的应用提供了基本的理论背景和实践指南。关键是使用非常低的染料浓度，不会导致与饱和或染料毒性相关的细胞伪影，同时仍然为高质量、长期活细胞成像提供良好的信号噪声比。

最近，我们与医科大学核医学系的同事一起，利用这些染色技术，开发一种新型的阿伯吉病图像引导诊断方法。实时监测膜和细胞壁结构的能力对于确定实验药物化合物的吸收动力学至关重要。要开始此过程，首先获得事先培养。

使用灭菌手术刀切割一个小的阿加块，携带非孢子菌从培养前的殖民地边缘。将阿加块放在新鲜、坚固的中板的中心，为实验培养体接种。根据拟孵育的发育阶段培育实验培养。

样本准备有些微妙，图像采集设置的优化相当复杂。两个程序的视觉演示以及口头解释极大地方便了可复制性。要安装样品，请保持清洁的 24 到 60 毫米玻璃盖滑，并在中心添加 18 微升液体最小介质或生理盐溶液。

将两个微升的20微摩尔染料工作溶液加入盖滑中心的液体中，通过上下移液多次混合，同时避免气泡产生。使用干净的手术刀，从殖民地的外围切出15由15毫米的样品，并垂直地放在盖滑的介质滴旁边。使用手术刀支撑块的上边缘，用手指将方块的后侧保持到位。

然后，慢慢地将携带菌丝的一侧放在液体上。将准备好的样品安装到显微镜阶段。首先，调整基本图像采集设置，以捕获文本协议中概述的单个催眠的站立动态。

对于内分泌吸收测定，请参考图 1 和文本协议之一，以确定显微镜系统上提供 FM 143 或 FM 464 的最佳激励和发射设置，并相应地调整系统中的这些设置。使用以前调整的设置开始图像录制并评估结果。然后，将图像采集设置优化为捕获实验关注的等离子膜或内分泌动力学方面所需的空间和时间分辨率。

有关细胞壁动力学，请参考图四和表格之一的文本协议，以确定应用细胞壁染料的最佳激发和发射设置，并相应地调整显微镜系统的设置。使用以前调整的设置开始图像录制并评估结果。然后，将图像采集设置优化为捕获实验关注的细胞壁形态生成方面所需的空间和时间分辨率。

除了仅对细胞过程进行可视化外，活细胞成像还允许从记录的数据中提取定量信息。在 FM 464 吸收测定的示例中，真菌样品被培养为菌落，并采用倒置的阿加块方法进行安装。测定发现，在基因缺失和基因过度表达突变体中，在基因缺失和基因过度表达突变体中，在三叶虫2的时空组织中存在缺陷。

此处显示了 FM 464 共染色用于内分泌分泌的荧光融合蛋白的示例。这种共染色用于将两种带标记的增强绿色荧光蛋白（SFP 2 和 GPR 1）的亚细胞分布与三叶草的内分泌途径联系起来。FM 464共染色用于鉴定形态遗传差异的一个例子表明，这种共染色允许面粉标记的BUD-6极性复合蛋白的亚细胞定位动力学进一步关系，以结束一些与贩运相关的过程，如形成隔膜和偏振的催眠尖生长。

它还描述野生类型和神经孢子的突变菌株在亚细胞组织和催眠结构的差异。代表性细胞壁染色表明，钙氟白色、独苯甲酸和刚果红与细胞壁聚合物的不同相互作用特性突出了三角洲SFP 2突变体与三叶草的野生型菌株之间的形态遗传差异。与野生类型相比，染料浓度升高引起的细胞壁应力增加的速度更快，突变体更明显。

此外，相同的图像允许量化有关催眠直径和两个菌株之间的隔膜距离的形态遗传差异。对细胞壁生物合成的代表性实时监测表明，极低的钙氟白色浓度可防止细胞壁与染料分子饱和，并允许对细胞壁生物合成进行定量实时监测。这表明，新细胞壁材料的沉积并不均匀，但对神经性膜脱毛之前一个细胞相对位移细胞附着在细胞对细胞附着上造成的局部物理应力反应非常迅速。

少即是多。使用尽可能少的染料，防止荧光标记对细胞过程的干扰。按照这个程序，光漂白实验后可以进行面粉恢复，以量化运输和生物发生动力学。

在千年伊10月初，在丝状真菌中率先引入膜和细胞壁染色，确实彻底改变了我们研究真菌的方式。钙氟白色可引起眼睛刺激，是一种分类的癌细胞。刚果红是致癌和致畸的，所以在处理这些染料时请佩戴眼睛和皮肤保护。