正交胰腺肿瘤的产生与肿瘤渗透T细胞细胞毒性的外体特征

此方法可用于分析新的治疗剂或策略，影响或增强胰腺癌期间的细胞毒性T细胞反应。该技术允许肿瘤在体外快速消化和刺激，同时可以分析T细胞反应的多个参数，这些参数可以很容易地适应其他应用。首先，使用钳子，将肿瘤转移到培养皿上。

将五毫升消化介质储存在50毫升的冰管中，以防止酶活性开始。拿这个溶液的一小块，覆盖培养皿上的肿瘤。使用无菌手术刀和钳子将肿瘤切成小块，长度大约不到三毫米。

将肿瘤片刮入管中，轻轻反转管，直到所有碎片浸入消化介质中。将管子转移到震动装置上20分钟，温度为37摄氏度，以消化。确保所有肿瘤都被淹没，不要粘在管子的边缘。

消化步骤后立即将管子放在冰上以减缓酶活性。加入EDTA，达到20毫摩尔的最终浓度，并短暂地涡旋样品混合，以进一步减缓酶活性。打开管子，用新鲜的RPMI介质冲洗管盖上的任何肿瘤消化。

然后准备一个70微米过滤器，放在50毫升的开冰管上。用介质预湿过滤器。重新吸收消化的细胞，使用25毫升或更大的条纹清洗管的两侧。

条纹的更宽开口允许厚厚的消化容易通过。使用25毫升条纹将所有消化器转移到过滤器上。使用一毫升注射器柱塞在过滤器顶部上下捣碎肿瘤。

使用 RPMI 持续清洗通过过滤器的细胞。确保用足够的力清洗，以推动细胞通过。继续清洗，直到所有细胞都通过过滤器。

在300倍G和4摄氏度下将管离心5分钟。小心地重新暂停细胞颗粒，并完成RPMI，并直接通过另一个过滤器，以去除任何细胞外基质，或无法充分重新泵制的大细胞团。如果不需要刺激，立即染色分离的细胞进行流动细胞学分析，或在10%DMSO和FBS的冷冻介质中重新释放它们，并储存在零下80摄氏度。

要执行刺激，请先计算细胞数。在全介质中稀释细胞，达到每100微升的2倍至6倍。U型井板每个井的100微升细胞。

添加 100 微升的完整介质，包含 2 倍的 PMA 和 Ionomycin 制剂。将盘子放在37摄氏度的培养箱中，但将200万二氧化碳放置一小时。然后，在20微升的10倍制备布雷费尔丁 A 和莫宁辛，和完整的介质，以实现最终浓度 1.06 微摩尔，和 2.0 微摩尔，分别。

将盘子放回孵化器再放四个小时。将1000个TB32048细胞注射到胰腺后，正畸肿瘤大约需要30天才能发展。消化和刺激收获的正畸肿瘤后，进行荧光减一，以确定用于浇注的背景荧光。

而布雷费尔丁 A 莫宁只控制，以确定细胞因子的基础生产。对于与布雷费尔丁 A 和莫宁的干扰素伽马孵育， 在脾脏和肿瘤样本中， 干扰素伽马在 FMO 控制上没有增加。然而，添加PMA和离子素，增加了细胞内干扰素伽马在血与肿瘤衍生CD4阳性和CD8阳性T细胞中可检测到的百分比。

作为阳性对照的Splenic CD4阳性和CD8阳性T细胞具有比肿瘤渗透T细胞子集更高的干扰素伽马生成。指示免疫抑制发生在肿瘤内。对TNF alpha使用相同的策略，对细胞内TNFα，一个高百分比的splenic CD4阳性T细胞是阳性的。

与肿瘤渗透CD4阳性T细胞相比。渗透和肿瘤渗透CD8阳性T细胞，产生类似水平的TNFα。确保肿瘤被充分切碎，并且所有碎片都浸入消化介质中。

捣碎肿瘤时，一定要温和，彻底清洗细胞。肿瘤消化方案可以与流量辅助细胞分选相结合，以净化单个免疫细胞子集，用于额外的功能或基因表达分析。我们使用这种方法来描述B细胞在胰腺癌期间如何塑造免疫反应，在B细胞敲除和B细胞耗尽小鼠中产生正向肿瘤。