Name: 矫形肝移植大鼠模型中动脉重联后并发症减少 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 了解改良大鼠原位肝移植模型，通过肝动脉重联技术减少并发症并提高受体存活率。该模型模拟人类肝移植，为移植生物学研究提供可靠的临床相关平台。

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本研究由多伦多大学健康网络（UHN）多器官移植项目基金以及多伦多综合医院和多伦多西区医院基金会的支持资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

小型动物肝移植模型对于理解移植免疫机制以及发现新的治疗策略具有重要意义32。理想的小型动物肝移植模型应复制人类手术的所有步骤，包括动脉吻合。解读大鼠原位肝移植（OLT）模型的结果可能存在困难，因为大多数现有模型未包含肝动脉（HA）吻合步骤，从而导致并发症和病死率升高42。某些重建手术曾采用肾动脉进行吻合，但该方法需切除肾脏27。本方案避免了器官切除，因其超出了人类肝移植手术的实际操作范围。
通过操作大鼠腹主动脉也可进行动脉重建31。然而，这些方法需要对腹主动脉进行广泛的解剖和夹闭。如果夹闭时间过长，受体大鼠将因远端缺血而出现不良结局43。在人类中，肝移植（LT）手术技术包括结扎并切断受体的胃十二指肠动脉（GDA）。然而，啮齿类动物的生理和解剖特征使得采用该技术进行移植在生理上更具挑战性，并可能导致并发症（例如胰腺和胆管坏死35以及胆汁泄漏44）。本方案中的动脉再连接旨在规避这一挑战，维持胆管血流，并改善受体的预后。
既往已有文献描述采用套管支架技术重建大鼠肝动脉（HA）的方法27。该技术中，以支架作为引导，将供体腹腔干动脉与受体肝总动脉进行吻合重建。随后游离受体肝总动脉，并结扎受体胃十二指肠动脉（GDA）27。由此可能导致受体胆总管下段及胰腺头部的血液供应受损。据认为，该区域的侧支循环通常无法为胆管提供充足的血流。例如，本方案首先使用微血管夹暂时夹闭受体GDA，随后切断受体胆管（BD）。当GDA被夹闭时，切断的胆管不发生出血；而在移除GDA夹闭后，可观察到胆管断端出现明显出血。本方案通过维持受体切断胆管的良好血流，保障了受体肝组织的生理功能，提供了充分的肝脏血液灌注，并预防肝移植术后缺氧性肝损伤。
在供体侧，制备移植物时，通过从腹腔干、左胃动脉和脾动脉创建一个补片，可轻松将肝动脉支架插入腹腔干。支架可通过该宽阔的开口插入，操作难度明显低于单独插入腹腔干。研究发现，24 G 是用作肝动脉支架的理想尺寸。支架长度应为 1.0–1.5 mm，因其作用相当于一个开放的通道，便于将受体的肝固有动脉顺利拉入供体的肝总动脉。只要仔细注意10-0 Ethilon缝线的放置位置，流经此连接处的血液将不会直接接触支架，且受体的肝固有动脉会从内侧将其覆盖，从而降低并发症风险。重要的是，供体肝动脉始终不使用血管夹，以避免发生血管痉挛。动脉重建的成功通过保持供体胃十二指肠动脉（GDA）开放来评估。重建完成后，若吻合成功，则供体GDA可呈现良好的血流。
在本方案中，与其它方法类似，肝上下腔静脉（SHVC）的重新连接是最慢的步骤，最终决定了无肝期的持续时间。随着无肝期时间的延长，缺血性损伤和肝功能障碍的风险也随之增加45。大鼠OLT模型的另一个关键因素是移植物、支架和套管的尺寸。如果移植物过小，可能发生扭转或翻转，从而阻塞血管连接。支架和套管的尺寸可能需要根据大鼠的年龄、性别、体重和品系进行调整。本研究中所使用的套管尺寸如先前所述28，并采用了一种根据大鼠体型进行控制的统一套管尺寸。在随访期间（截至目前：中位随访时间为术后133天，最短为术后115天，最长为术后161天），未观察到任何痛苦或并发症迹象（例如肝淤血、水肿、腹水或脾肿大）。未来有必要进一步研究不同品系大鼠在考虑年龄和性别的前提下，门静脉（PV）和肝上下腔静脉（IHVC）适宜尺寸的选择。
这种改良的大鼠OLT方案采用3D打印的套管用于门静脉（PV）和下腔静脉（IHVC），如先前所述39,40。现有连接PV和IHVC的方法包括显微缝合技术32、套管技术46以及显微缝合-临时夹板技术47。本研究选择3D打印套管技术，因其可根据大鼠品系标准化套管尺寸，且制备和使用简便。相同尺寸的套管可一次性大量打印。套管外表面设有两个凹槽，便于结扎固定并防止滑脱。套管设计中还包含一个尾部结构，以便于操作。总体认为，采用3D打印套管可通过缩短无肝期，提高OLT手术的成功率和可重复性。此外，该技术也被证实可缩短外科手术的学习曲线。
综上所述，通过引入动脉吻合步骤，所述方案建立了一个更接近人类肝移植的模型。该方案可适用于研究肝移植中的多种免疫学和外科学问题，并可作为测试与移植相关的新型治疗干预措施的模型。

肝病的全球负担持续增加，2005年至2013年间，与肝病相关的死亡人数上升了30%1,2。对于终末期肝病患者而言，肝移植往往是唯一的治疗手段。肝脏是全球第二常见的实体器官移植类型，2015年至2016年间，全球实施的肝移植手术数量增长了7.25%1,2。尽管肝移植较为普遍，但移植后的生存率已趋于停滞3,4,5。据报道，患者术后15年生存率为53%，而20年生存率可能低至21%3,5。尽管目前已有令人期待的新型免疫生物学研究方向，有望带来新的治疗方法并改善临床预后，但迄今仍缺乏一种可靠的小动物模型用于相关研究的验证。
大鼠OLT模型已广泛用于肝移植相关研究，包括排斥反应6,7,8,9,10、免疫耐受11、移植相关的缺血-再灌注损伤12、免疫抑制13以及胆道系统损伤14,15,16,17。然而，该模型目前形式的一个缺点是术后发病率和死亡率较高18,19。这一严重缺陷与人类临床手术情况不符，且限制了从该模型中得出具有临床相关性的结论的能力20。
此外，这种高发病率很大程度上可归因于肝动脉（HA）吻合的缺失或不完善18。尽管肝动脉吻合是人类肝移植中的关键步骤，但在大鼠OLT模型中，技术上的困难往往导致HA吻合难以实现。其结果是胆管（BD）吻合不稳定，导致胆汁泄漏和胆管坏死的发生率较高21。除了胆道并发症发生率较高外22，缺乏动脉供血还会改变移植后供体肝脏的生理状态23，导致供肝出现缺氧24，以及在炎症肝叶中观察到肝损伤19,25,26。在未进行动脉吻合的大鼠OLT中，还容易促进肝纤维化的发生27。下述大鼠OLT方案通过在先前已发表的大鼠OLT方法中引入一个简单的HA重建步骤，解决了上述问题，从而实现了肝实质的保护并提高了存活率28。
肝移植手术分为三个阶段：（1）从供体中取出肝脏移植物，（2）准备供体肝脏移植物，（3）用肝脏移植物替换受体的肝脏。该手术涉及五个解剖结构的操作：肝上段下腔静脉（SHVC）、门静脉（PV）、肝下段下腔静脉（IHVC）、肝动脉（HA）和胆管（BD）。
大鼠OLT最初由Lee等人引入，采用显微缝合技术吻合SHVC、PV和IHVC，并使用套管牵引法处理BD29。该模型随后于1979年通过双套管技术得到改进30。此后，多种替代技术被提出，其中大多数技术聚焦于静脉吻合，采用双套管技术并进行了若干改良31。尽管既往已有报道在大鼠OLT模型中采用显微缝合、套管法及管腔内袖套等技术进行HA吻合26,31,32,33,34，但这些技术通常需要高度熟练的显微外科操作技能，显著改变大鼠生理状态，且常受到血栓形成和/或胆道并发症的限制27,35。
此外，手术方式的选择还可能影响无肝期（从门静脉阻断到通过重建的门静脉对移植物进行再灌注的时间），而无肝期对于大鼠肝移植的成功至关重要。具体而言，当无肝期为15-20分钟时，可观察到较高的存活率36，而30分钟则是成功移植的上限37,38。因此，本方法的目标是建立一种创伤更小、更易于推广的大鼠原位肝移植（OLT）手术模型，能够重建肝动脉，促进移植肝的有效灌注，维持受体胆管的血流，并保持受体的生理状态。
本文详细描述了该优化方案的全部步骤，包括供体肝脏腹腔干的处理，以及以下技术的应用：1）使用1.5 mm支架与受体肝固有动脉（HA）进行血管外套管吻合；2）连续缝合方式重建SHVC；3）采用两个3D打印塑料套管分别用于门静脉（PV）和肝下腔静脉（IHVC）的重建39,40；4）微血管套管吻合法重建肝动脉（HA）18,27,41；以及5）既往报道的胆道（BD）支架置入技术28。此外还包括两个补充步骤：经门静脉进行冷灌注，以及基于前期研究结果制定的抗生素使用方案17。该优化的原位肝移植（OLT）方案可显著减少围手术期并发症和病患率，更贴近临床人体肝移植手术的实际操作流程。

<table><tbody><tr><td>10-0 Ethilon</td><td>Ethicon</td><td>2830G</td><td>10-0 Ethilon 黑色 1×5&quot; BV100-4 圆锥形针</td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>B302995</td><td>鲁尔锁头，无菌，一次性使用</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>B309628</td><td>鲁尔锁头，无菌，一次性使用</td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>BD</td><td>B301031</td><td>鲁尔锁头，无菌，一次性使用</td></tr><tr><td>用于 IHVC 的 3D 打印套管</td><td></td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>用于 PV 的 3D 打印套管</td><td></td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>用于 IHVC 的 3D 打印支架</td><td></td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>用于 PV 的 3D 打印支架</td><td></td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>B309657</td><td>鲁尔锁头，无菌，一次性使用</td></tr><tr><td>4-0 Sofsilk</td><td>Coviden</td><td>GS-835</td><td>编织丝线，未染色，30&quot;，缝合线配 1 枚 26 mm 长 1/2 圆形圆锥头针</td></tr><tr><td>5-0 Monocryl</td><td>Ethicon</td><td>Y433H</td><td>未染色单丝线 1×27&quot; TF</td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD</td><td>B309646</td><td>鲁尔锁头，无菌，一次性使用</td></tr><tr><td>7-0 丝线</td><td>Teleflex Medical</td><td>103-S</td><td>黑色</td></tr><tr><td>8-0 Prolene</td><td>Ethicon</td><td>2775G</td><td>8-0 Prolene 蓝色 1×24&quot; BV130-5 EVP 双针</td></tr><tr><td>Barraquer 微型持针器（无锁扣）</td><td>Aesculap 外科器械</td><td>FD231R</td><td>弯曲型，120 mm，4 3/4&amp;Prime;</td></tr><tr><td>Barraquer 持针器，超细钳口 8.0 mm，弯曲型无锁扣</td><td>Rumex International Co.</td><td>8-025T</td><td>小型，钛材质</td></tr><tr><td>Barraquer 持针器，细钳口 12.0 mm，弯曲型无锁扣</td><td>Rumex International Co.</td><td>8-021T</td><td>小型，钛材质</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard BC 22 GA × 1.00 IN</td><td>BD Angiocath / Autoguard</td><td>382523</td><td>22 G × 1.00&quot; (0.9 mm × 25 mm) 无翼导管，37 mL/min</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 一次性针头：普通斜面 - 普通管壁</td><td>BD</td><td>B305106</td><td>PrecisionGlide 不锈钢针头，透明彩色编码聚丙烯针座，22 G</td></tr><tr><td>BD Precisionglide 注射器针头 21G</td><td>BD</td><td>305167</td><td>规格 21，长度 1.5 英寸，皮下注射针头</td></tr><tr><td>BD Precisionglide 注射器针头 30G</td><td>BD</td><td>305128</td><td>规格 30，长度 1 英寸，皮下注射针头</td></tr><tr><td>Purdue Products LP 生产的聚维酮碘溶液</td><td>Purdue Products Lp</td><td>67618-150-17</td><td>10% 聚维酮&amp;ndash;碘外用溶液 USP</td></tr><tr><td>布比卡因注射液 BP 0.5%</td><td>SteriMax Inc.</td><td>DIN:02443694</td><td>0.5% (100 mg/20 mL)</td></tr><tr><td>弯曲打结钳</td><td>Duckworth &amp;amp; Kent</td><td>2-501E</td><td>6 mm 打结平台，直杆，扁平手柄，长度 88 mm</td></tr><tr><td>直流温度控制器</td><td>FHC Inc.</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>DK 虹膜剪（弯曲型）</td><td>Duckworth &amp;amp; Kent</td><td>1-211B</td><td>钝头，剪切长度 4 mm，尖端至枢轴长度 11 mm，圆柄，总长 107 mm</td></tr><tr><td>乙醇，200 证明（100%），USP，Decon Labs</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td>用 d2H2O 稀释至 70%</td></tr><tr><td>精细可调金属牵开器</td><td>Fine Science Tools</td><td>17004-05</td><td>最大展开宽度：3.5 cm，深度 5 cm</td></tr><tr><td>Harvard Apparatus 异氟烷漏斗加液挥发器</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>34-1040SV</td><td></td></tr><tr><td>肝素 LEO（肝素钠）</td><td>LEO Pharma Inc.</td><td>DIN:00453811</td><td>10,000 i.u./10 mL</td></tr><tr><td>冰袋</td><td>Cryopak</td><td>FIP88016</td><td>4.00 英寸 × 7.00 英寸，厚度 1.50 英寸</td></tr><tr><td>异氟烷 美国药典（USP）99.9%</td><td>Piramal Healthcare Limited</td><td>DIN: 02231929</td><td>250 mL，吸入麻醉剂，NDC 66794-017-25</td></tr><tr><td>Khaw 经结膜可调节缝线控制钳</td><td>Duckworth &amp;amp; Kent</td><td>2-502N</td><td>5 mm 高度抛光打结平台，直杆，扁平手柄，长度 84 mm</td></tr><tr><td>乳酸林格注射液 USP，1000 mL</td><td>Baxter Co.</td><td>DIN: 00061085</td><td>JB2324</td></tr><tr><td>McPherson 打结钳</td><td>Duckworth &amp;amp; Kent</td><td>2-500E</td><td>6 mm 打结平台，直杆，扁平手柄，长度 90 mm</td></tr><tr><td>Metzenbaum 剪刀 - 14.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14024-14</td><td>直型，尖端锐利/钝头</td></tr><tr><td>微型 Kitzmiller 钳</td><td>Scanlan</td><td>3003-630</td><td>钳口长度 23 mm，总长 11 cm</td></tr><tr><td>显微镜-Leica M525 F20</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>无目录号</td></tr><tr><td>无纺纱布海绵</td><td>Fisherbrand</td><td>22-028-556</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar 带缝线切割器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td>15 mm 切割刃，2 mm 钳口表面 - 14 cm</td></tr><tr><td>OptixCare 眼科润滑膏，25 g</td><td>OptixCare</td><td>ES-KE8O-69U1</td><td>原名 Optixcare 外科眼科润滑剂</td></tr><tr><td>哌拉西林钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8396</td><td>青霉素类似物</td></tr><tr><td>Puritan 3&quot; 标准棉签带木柄</td><td>Puritan Medical Products Company LLC</td><td>803-WC</td><td>普通棉头涂药棒带木柄</td></tr><tr><td>圆柄直型持针器带锁扣</td><td>Fine Science Tools</td><td>12075-12</td><td>圆柄便于指尖调节 - 12.5 cm</td></tr><tr><td>Shea 剪刀 弯曲钝头</td><td>Fine Science Tools</td><td>14105-12</td><td>移植剪，轻巧精细设计 - 12 cm</td></tr><tr><td>不锈钢微型 Serrefines 弯曲型 - 4 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-06</td><td>钳口长度 4 mm，钳口宽度 0.75 mm，总长 16 mm，钳口压力 125 g</td></tr><tr><td>不锈钢微型 Serrefines 弯曲型 - 6 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-05</td><td>钳口长度 6 mm，钳口宽度 1 mm，总长 17 mm，钳口压力 100 g</td></tr><tr><td>不锈钢微型 Serrefines 直型 - 6 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-03</td><td>钳口长度 6 mm，钳口宽度 1 mm，总长 15 mm，钳口压力 100 g</td></tr><tr><td>手术平台</td><td></td><td></td><td>定制，磁性</td></tr><tr><td>SurgiVet Vaporstick 麻醉机</td><td>General Anesthetic Services, Inc</td><td>V7015</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump 局部治疗系统</td><td>Stryker</td><td></td><td>TP700 系列</td></tr><tr><td>真空-压力泵</td><td>Barnant Co.</td><td>400-1901</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀 带微锯齿 直型</td><td>Fine Science Tools</td><td>15070-08</td><td>切割刃：5 mm，尖端直径：0.1 mm - 8.5 cm</td></tr><tr><td>Vetergesic 布托啡诺</td><td>Ceva Animal Health Ltd</td><td>NAC No.:12380352</td><td>0.324 mg/mL 盐酸布托啡诺注射液，用于犬和猫</td></tr><tr><td>Vetroson V-10 双极电外科设备</td><td>Summit Hill Laboratories</td><td></td><td>无目录号</td></tr><tr><td>手术铺巾</td><td>PDC Healthcare</td><td>DRP1824</td><td>多用途无菌透明塑料，18&quot; × 24&quot;，每箱 40 片</td></tr></tbody></table>

异位肝移植大鼠模型中动脉重建后并发症减少

Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

大鼠原位肝移植（OLT）模型是研究急性和慢性排斥反应的有力工具。然而，由于缺乏动脉重建，该模型并不能完全模拟人类肝移植。本文描述了一种经过改良的移植手术方法，其中包含了肝动脉（HA）重建，显著改善了移植效果。通过平均12分14秒的无肝期，肝动脉重建可改善移植肝脏的灌注，并将受体的长期存活率从37.5%提高至88.2%。本方案采用3D打印的套管和固定装置连接门静脉与肝下腔静脉。该模型可用于研究肝移植的多个方面，包括免疫反应、感染以及手术技术相关问题。通过引入一种基于微血管技术的简单且实用的动脉重建方法，这一改良的大鼠OLT方案更贴近人类肝移植的实际过程，将成为一种具有重要价值且与临床密切相关的研究模型。

在采用先前所述方案建立非肝动脉吻合的大鼠肝移植模型时28术后21天和60天，我们的团队观察到的生存率分别为50%和37.5%。尽管已有部分研究团队报道过不进行肝动脉吻合的情况下较高的长期生存率28，这些早期结果凸显了缺乏动脉流入的缺陷。相比之下，优化的HA再连接方案将长期存活率从37.5%显著提高至88.2%（p = 0.015）（图6).
对未进行肝动脉（HA）再连接的移植动物代表性亚组进行组织学分析（术后第6天和第13天），结果显示存在缺氧性肝损伤，伴有小叶中央坏死（图7）。这些动物的肝脏出现广泛性坏死，同时丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平显著升高（图7）。相比之下，接受肝动脉再连接的移植大鼠未表现出肝损伤迹象，组织学分析显示肝脏实质结构正常，肝小叶结构完整，包括有序排列的肝细胞索、肝小叶（如中央静脉和包含肝静脉的门管区三联体）、动脉和胆管（图7）。
尽管在23次独立手术过程中，平均无肝期时间尚可接受（12分钟14秒[±78秒]），但随着操作经验的积累，非肝动脉再连接模型的存活率仍有可能进一步提高。然而需要注意的是，4只未进行肝动脉再连接的移植动物中，有3只（用于长期存活观察）因术后第56天、第96天和第111天出现严重痛苦而被实施安乐死。此外，肝脏的组织学分析显示，缺氧性肝损伤后出现反应性改变，包括明显的胆管增生、门脉周围纤维化和炎症，以及肝实质结构紊乱（补充图2）。这些缺氧性肝损伤的形态学特征进一步证实了肝动脉再连接对于实现有效肝脏灌注和正常功能的重要性。
<img alt="用于精确组装和分析的机械部件示意图，标注了尺寸。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：门静脉和肝下下腔静脉用3D打印袖套设计的示意图。 第一个结扎线收紧于靠近手柄（iii）的凹槽（ii）中，第二个结扎线收紧于距离手柄最远的凹槽（i）中。外径分别为（iv）门静脉（PV）2.38 mm，肝下下腔静脉（IHVC）2.15 mm；内径分别为（v）PV 1.74 mm，IHVC 1.38 mm；长度分别为（vi）PV 2.60 mm，IHVC 2.15 mm（所有3D打印材料的详细规格见补充材料）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="手术缝合技术序列，带镊子的标记部分，操作示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：移植物中肝动脉支架的插入。 （A）通过从脾动脉向左胃动脉方向剪开，扩大腹腔干（i）的开口端，从而暴露肝总动脉（HA）的分叉处。（ii）在取出供体大鼠肝脏前，预先将胆管（BD）支架结扎。（iii）门静脉（PV）套管和（iv）肝下下腔静脉（IHVC）套管通过将血管末端翻折覆盖在套管上后结扎固定。（B）（i）为插入肝动脉支架，需用镊子反复牵拉暴露的肝总动脉。（C）（i）将肝动脉支架牢固地置入肝总动脉，并用8-0聚丙烯线结扎固定。（D）（i）用（ii）乳酸林格液冲洗肝动脉支架（BD = 胆管，IHVC = 肝下下腔静脉，HA = 肝动脉）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="逐步放大展示外科肝吻合过程，重点关注组织与钳夹装置的相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：使用 3D 打印支架进行肝下腔静脉吻合。（A）(i) 门静脉（PV）采用与肝下腔静脉（IHVC）相同的吻合技术进行连接。供体血管 (ii) 在 (iii) IHVC 套管上方被夹闭。受体 IHVC 开口处 (iv) 被缝合至 3D 打印支架的两侧，以保持其充分张开。一条松散的 (v) 7-0 丝线环绕结扎于受体 IHVC 周围。（B）供体 IHVC 套管 (i) 插入受体 IHVC 内部，随后收紧松线。（C）移除血管夹，并用剪刀 (i) 拆除 3D 打印支架。（D）若吻合不够牢固，可额外使用一条 (i) 7-0 丝线环绕结扎，但通常一条结扎线已足够（PV = 门静脉，IHVC = 肝下腔静脉）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="肝动脉吻合过程；手术示意图及操作步骤 A-D，缝合技术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：肝动脉的微血管套管连接。 （A）(i) 胆管（BD）支架未与受体连接。(ii) 肝动脉（HA）支架置于移植物中，并与 (iv) 受体的肝固有动脉相连。(iii) 门静脉（PV）已连接。（B）使用 (i) 弯针的10-0 Ethilon缝线从肝动脉支架穿出，至受体肝动脉开口端的两侧。（C）将10-0 Ethilon缝线反向穿过肝动脉支架；因此，受体的肝固有动脉像套入袖管一样被拉过支架。（D）(i) 当受体的肝固有动脉被拉入支架并到达最初穿过肝动脉支架的部分时，使用10-0 Ethilon缝线打结固定。（E）此处展示的是（B）、（C）和（D）中所述肝动脉吻合的示意图（BD = 胆管，HA = 肝动脉，PV = 门静脉）。*通过从脾动脉切断至胃左动脉，扩大腹腔干的开口端。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="医疗手术中的外科缝合操作，展示带有标注点的详细步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：使用两个支架进行胆管连接。（A）(i) 在 (ii) 松绑于受体胆管开口处的支架辅助下，将移植物胆管支架插入受体胆管中。(iii) 在胆管连接前先吻合门静脉（PV），门静脉位于胆管后方。（B）移除受体胆管末端的支架，并将其作为扩大的开口，用于 (i) 插入与移植物绑在一起的胆管支架。（C）原本用于松绑固定受体支架的结线现用于结扎吻合口，且 (i) 另用一根7-0丝线牢固固定支架，防止支架滑脱或扭转。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="生存分析图；有/无肝动脉再连接，Kaplan-Meier 曲线，术后天数比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：移植后存活率百分比。 无肝动脉再连接（n = 8）与有肝动脉再连接（n = 17）的大鼠原位肝移植。移植后至少 60 天内密切观察动物是否出现肝功能衰竭和/或感染的迹象。术后未出现并发症的大鼠被视为存活者（*p = 0.015，由 Kaplan-Meier 估计法[长秩检验]计算得出）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肝移植术后肝组织病理学；ALT、AST水平；示意图显示肝动脉重建的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：肝脏组织病理学评估。 肝移植（LTx）后第6天和第13天动物肝脏的代表性苏木精-伊红染色切片：(A) 未进行肝动脉（HA）重建；(B) 进行肝动脉重建。(C) 正常肝实质结构，显示门脉三联体（门静脉、动脉和胆管）、肝小叶（包括中央静脉）以及腺泡。紧邻门脉三联体的肝细胞为1区肝细胞；位于肝小叶内中央静脉周围的肝细胞为3区肝细胞；介于1区和3区之间的肝细胞为2区肝细胞（ALT = 丙氨酸氨基转移酶，AST = 天冬氨酸氨基转移酶，CV = 中央静脉）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示医用手术尺寸的血管支架和套管，附标尺。" src="/files/ftp_upload/60628/60628suppfig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Supplementary Figure 1"> 
补充图1：支架和套管的尺寸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628suppfig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝移植术后组织学进展，显微镜检查，慢性排斥反应评估。" src="/files/ftp_upload/60628/60628suppfig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="补充图2"> 
补充图2：肝脏组织病理学评估显示肝实质结构破坏。 肝移植术后第54、96和111天未进行肝动脉重建动物的代表性苏木精-伊红染色切片。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628suppfig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充材料 1：Porta cuff 200g - 支架 2.0。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary1.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。</a>
补充材料 2：200 克下腔静脉套管 - 支架 2.0。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary2.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。</a>
补充材料 3：肝脏牵开器 200g。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary3.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。</a>
补充材料 4：背板 - 1.2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary4.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。</a>
补充材料 5：Cava 150g - 2.1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary5.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。</a>
补充材料 6：Porta 1.4.1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary6.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。</a>
补充材料 7：麦吉尔夹持臂。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary7.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。</a>
补充材料 8：微型支架臂 LAB。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary8.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。</a>
补充材料9：夹具和机械臂软部件1.3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary9.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。</a>
补充材料 10：夹持器底座 - 3.1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary10.stl" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键点击可下载）。</a>

本研究的目的是改进大鼠原位肝移植模型，以更好地模拟人类肝移植并提高受体存活率。本方法通过将供体肝脏的肝总动脉与受体肝脏的肝固有动脉相吻合，重建肝脏动脉血流。

大鼠原位肝移植（OLT）模型是研究急性和慢性排斥反应的有力工具。然而，它并不能完全代表……

大鼠原位肝移植模型是研究肝移植多个方面的有力工具，涵盖从感染相关的免疫反应到手术操作技术等各个方面。该技术的主要优势在于能够减少并发症，更真实地模拟临床肝移植，并提高受体的存活率。这种改良的大鼠原位肝移植方案在多个方面模拟了人类肝移植的过程，可作为具有可变性和临床相关性的研究模型。我们希望借助视频演示，使观看者能够掌握全部操作细节，缩短掌握该技术所需显微外科技能的学习曲线。对一只12至14周龄的麻醉大鼠，在其肝下腔静脉内注射300国际单位肝素钠后，在胆管分叉下方做一处5毫米的切口，并将胆管支架插入胆总管中。在切口上方1毫米处用一根7-0丝线结扎固定支架，并在分叉下方10毫米处放置另一根结扎线。在两根结扎线之间切断胆管，暴露肝固有动脉。在两根7-0丝线结扎之间切断胃十二指肠动脉，并暴露胃左动脉、脾动脉和腹腔干。然后在动脉结扎线之间切断胃左动脉、脾动脉和腹腔干。使用带有21.5号针头的20毫升注射器，缓慢向门静脉注入20毫升4摄氏度的乳酸林格液。为准备供体肝脏，切开腹腔干、脾动脉和胃左动脉的分叉处，形成一个较大的动脉套管袖状结构，并通过该袖口将长1.5毫米的24号动脉支架插入供体的肝总动脉中。然后用8-0聚丙烯缝线固定支架，并用乳酸林格液冲洗支架。暴露12至14周龄受体大鼠的门静脉后，在距肝叶分叉下方0.5厘米处切断受体胆管，并将胆管支架插入远端胆总管。暴露左、中、右肝动脉，并在肝动脉分叉的远端结扎血管。在结扎线以上靠近肝脏的位置切断动脉，并在肝上段下腔静脉后方放置一条长而细的纱布。将一个3D打印的肝内下腔静脉夹持器置于肝内下腔静脉后方，使用Tenno不可吸收单丝缝线将3D打印手柄的两端缝合固定。在3D打印夹持器下方、肝内下腔静脉与门静脉之间的区域，用7-0丝线 loosely 结扎，并在右肾静脉上方、3D打印下腔静脉夹持器下方不远处夹闭肝内下腔静脉。在幽门静脉上方和3D打印的门静脉支架下方夹闭门静脉。使用连接27号针头的3毫升注射器，经门静脉分叉处灌注2毫升37摄氏度的乳酸林格液，并用Kitzmiller夹夹闭肝上腔静脉的肝上方位置。随后，在尽可能靠近肝脏的位置夹闭处下方剪断，并在3D打印支架上方剪断门静脉和肝内腔静脉，以移除受体肝脏。进行供体肝脏移植时，需仔细将供体肝脏置于受体体腔内，确保能够形成上方的端侧吻合。将供体门静脉套管插入受体门静脉，并收紧7-0丝线结扎。移除肝上腔静脉上的无创夹，同时取下门静脉的微血管夹。 用温血重新灌注肝脏后，将供体肝内腔静脉套管插入受体肝内腔静脉，并用7-0丝线结扎固定血管。然后在移除受体腔静脉夹之前，先移除供体肝内腔静脉夹。进行动脉吻合时，剪除供体腹腔干超出支架部分的组织，并夹闭受体的肝固有动脉。剪断末端的结扎线以及血管周围任何多余的组织。使用乳酸林格液冲洗供体和受体血管断端的管腔。使用弯针，将10-0 Ethilon缝线从支架远端开口上方2.5毫米处穿过供体肝动脉左侧壁，并从支架末端穿出。从血管左侧开始，将受体肝固有动脉在血管开口下方0.5毫米处横向贯穿固定，穿至动脉右侧。将下一针从供体肝固有动脉右侧壁内侧穿至外侧，穿刺点距支架开口的距离与第一针相同，然后牵拉10-0不可吸收单股缝线的两端，使受体肝固有动脉向上滑动并进入肝动脉支架内。随后将10-0不可吸收单股缝线在供体肝固有动脉上方自体打结固定。冲洗受体和供体的胆管，并将供体胆管支架插入受体胆管中。随后收紧先前放置在受体胆管周围的结扎线。在此项代表性实验中，非肝动脉吻合的大鼠原位肝移植模型在术后21天和60天的存活率分别为50%和37.5%。相比之下，优化后的肝动脉重建手术显著提高了长期存活率。对移植后未进行肝动脉重建的动物中具有代表性的亚组进行组织学分析，发现在移植后第6天和第13天存在缺氧性肝损伤的迹象，表现为中央静脉周围肝小叶坏死。这些动物体内丙氨酸免疫转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平显著升高，与广泛的肝坏死相关。相比之下，进行肝动脉重建的移植大鼠未表现出肝损伤迹象，组织学分析显示肝脏实质结构正常，肝小叶、腺泡、动脉和胆管排列有序。此外，未进行肝动脉重建模型大鼠的肝脏组织学分析显示，缺氧性肝损伤后出现反应性改变，包括胆管增生、门管区周围纤维化和炎症，以及肝脏实质结构扭曲。该方案可适用于研究肝脏移植的多种免疫学和外科方面问题，并可作为测试与移植相关的新疗法干预措施的模型。

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