多维共培养系统模拟肺鳞状细胞癌进展

我们的培养系统能够捕捉肺鳞状细胞癌细胞在肿瘤-基质相互作用下的表型可塑性，以及这些相互作用如何在肺鳞状细胞癌进展过程中调控肿瘤形态。本系统的主要优势在于能够在三维环境中模拟肺鳞状细胞的生物学特性，同时保持恶性细胞的可塑性。这种三维共培养体系为研究肿瘤-基质细胞间的相互作用提供了独特平台，并可进一步改造用于监测肺鳞状细胞癌细胞及癌症相关成纤维细胞对药物治疗的反应。

首先，在4°C冰箱中过夜解冻基底膜基质小瓶。将2毫升塑料移液管和枪头于-20°C下预冷过夜。次日，将用于解离TUM622细胞的试剂——HEPES缓冲液、胰蛋白酶/EDTA以及胰蛋白酶中和缓冲液——置于37°C水浴中预热。

将解冻的基底膜基质从冰箱中取出，将小瓶置于冰上。将组织培养板放在置于冰上的金属冷却板上进行降温。将离心管放在置于冰上的金属冷却架上。

根据待制备的孔数及每孔中的细胞浓度，计算所需的细胞数量。将TUM622细胞悬液转移至预冷的离心管中，在4°C条件下，使用水平转子离心机以300 × g离心5分钟。使用连接无滤芯吸头的移液器小心吸除上清液，保留约200 µL培养基于管中。

轻轻敲击管壁以松动并分散沉淀物，然后将其放回冷却架上。使用预冷的2毫升移液枪，在冰上通过上下吹打数次轻柔混匀基质。移液时应保持均匀且适中的速度，避免在此过程中向基质中引入气泡。

将1.1毫升基质转移至每个离心管中。使用预冷的枪头，将每管中的基质上下吹打约10次，以制成均匀的细胞悬液。将310微升细胞基质悬液转移至预冷的24孔板的每个孔中。

将移液器垂直于培养板表面（90度角）放置，并将悬液加入孔的中央。悬液会扩散并覆盖整个孔。为了便于后续的免疫荧光分析，将60 µL细胞基质悬液转移至双孔玻片的孔中央。

这使得基质形成体积更小的圆顶状结构。将培养板和腔室载玻片放回组织培养孵育箱中，孵育30分钟，使基质凝固。之后，在光学显微镜下观察培养板和载玻片，确保单个细胞在基质中均匀分布。

向培养板的每孔中加入1毫升预热的3D培养完全培养基，向腔室载玻片的每孔中加入1.5毫升3D培养基，然后将它们放回培养箱。按照前述方法制备TUM622和CAFs的细胞悬液后，取10微升细胞悬液与10微升台盼蓝混合，以计数CAF细胞密度。将10微升混合液分别加入血细胞计数板的两个计数室中，进行细胞密度的计数与计算。

为了将TUM622细胞与CAFs共同包埋于基底膜基质中，首先根据细胞密度信息计算铺板所需的细胞数量。CAFs的接种比例为TUM622细胞的2:1。将计算好的TUM622细胞以及CAF细胞悬液转移至同一离心管中。

离心并吸除所有培养基。用基底膜基质重悬，并将310 µL混合液接种至24孔板的每个孔中。进行免疫荧光染色时，将60 µL TUM622和CAF混合物转移至腔室载玻片，操作步骤同前。

为了在基底膜基质中将TUM622细胞与上层接种的CAFs进行共培养，首先按照前述方法建立TUM622单层培养；将两倍数量的CAF悬液转移至离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟。吸除上清液后，用培养基重悬CAFs，并将重悬于培养基中的CAF细胞数量的两倍加入到每个含有包埋TUM622细胞的孔中。典型的TUM622细胞在二维培养中呈圆形，具有较大的细胞核，而CAFs则呈扁平且细长的形态。

在三维培养中接种单个TUM622细胞，嵌入基质后可形成具有腺泡样形态的类器官。在培养第5至第7天之间，腺泡样结构中开始出现管腔，并在此后保持中空状态。每个腺泡由围绕中空管腔的单层细胞构成，表现出类似于体内肺上皮细胞的正常顶-基底极性。

这些腺泡样结构呈增生性，并持续生长至第24天，此时细胞外基质完全降解。在TUM622与CAF的共培养体系中，无论是覆盖培养还是共包埋培养，CAF的存在均显著增加了所形成球状体的数量和尺寸。有趣的是，当TUM622腺泡与CAF近距离接触时，会诱导腺泡发生侵袭性行为并向CAF迁移，形成泪滴状结构。

为确保类腺泡结构的稳健形成，在整个细胞包埋过程中必须保持基底膜基质处于液态。TUM622类器官可用于多种下游分析，包括但不限于免疫荧光、免疫组织化学、流式细胞术、RNA和蛋白质提取，也可改造用于药物筛选。利用该系统作为研究平台，可探究肿瘤细胞内在因素以及肿瘤微环境中的细胞外在变化如何影响肿瘤上皮结构和癌变过程。