Name: 固体肿瘤的预测免疫建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 了解基于RNA的免疫分析方法，用于定量检测实体瘤组织中的免疫细胞群体。该方法结合传统文库制备与靶向捕获技术，为肿瘤免疫微环境研究提供高灵敏度检测手段，助力生物标志物发现与免疫治疗策略优化。

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作者希望感谢 TriStar Technology Group 提供代表性结果所用的生物样本，同时感谢 Cofactor Genomics 公司全体分子、分析、产品和商业团队在技术专长和相关支持方面的贡献。

<ol><li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li>
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<li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li>
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<li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4%2FCD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li>
<li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).</li>
</ol>

所有作者均受雇于 Cofactor Genomics, Inc.，该公司开发并生产本文所使用的 ImmunoPrism 试剂盒及生物信息学工具。ImmunoPrism 检测试剂盒仅用于科研用途，不适用于诊断性操作。

该实验方案需要20 ng完整RNA或40 ng高度降解的（FFPE）RNA。RNA样品应不含DNA、盐类（如Mg2+或硫氰酸胍盐）、二价阳离子螯合剂（如EDTA、EGTA、柠檬酸盐）或有机溶剂（如苯酚和乙醇）。不建议对DV200 &#60;20%的RNA样品继续操作。强烈推荐使用试剂盒内的对照RNA，因为这些对照可在从文库构建到数据分析的整个流程中评估实验性能。
本方案设计使用0.2 mL的PCR条形管进行操作。如需要，也可使用96孔PCR板中的孔进行实验。只需将96孔PCR板的孔替代方案中所有提及PCR管或条形管的部分即可。仅可使用透明孔的PCR板，因为在磁珠纯化和洗涤步骤中，必须通过肉眼确认磁珠完全重悬。
在整个实验过程中，除非另有说明，所有试剂均需保持冷冻或置于冰上。试剂未完全解冻前不得使用。使用前务必充分混匀所有试剂。
使用前将酶保存在 -20 °C，使用后应立即放回 -20 °C。仅使用分子级无核酸酶的水；不建议使用经 DEPC 处理的水。移液混匀时，应轻柔地反复吸打至少总体积的 50%，直至溶液充分混匀。所有含有酶的预混液均需通过移液器混匀。使用涡旋振荡器混匀酶溶液可能导致酶变性，影响其活性。在磁珠纯化过程中，应使用分子级乙醇新鲜配制的 80% 乙醇溶液。使用非新鲜配制的乙醇溶液可能导致得率降低。避免过度干燥磁珠，否则会降低洗脱效率（过度干燥的磁珠外观会出现裂纹）。
如步骤10所述，需向每个反应中加入独特的索引引物。根据这些索引的序列，在低水平多重测序中，某些索引组合为最优选择。测序后对数据进行去多重化（demultiplexing）时，必须提供这些索引的序列信息。索引序列及推荐的多重组合详见补充表3。在该步骤中需注意，推荐的PCR循环次数取决于所用RNA的质量，可能需要进行一定的优化以避免PCR过度扩增。对于ImmunoPrism完整对照RNA及其他高质量RNA，建议从10个PCR循环开始优化；对于ImmunoPrism FFPE对照RNA及其他高度降解/FFPE来源的RNA，建议从15个PCR循环开始优化。建议使用代表待分析样本类型的RNA制备测试文库，以优化PCR循环数。应采用能够稳定产生足够捕获前文库产量（&#62;200 ng）的最低PCR循环次数。若Bioanalyzer图谱中出现约1000 bp的次要峰，则提示存在过度扩增现象（图4）。应尽量减少过度扩增，但若存在较小的次要峰，不会影响检测结果。
为尽量减少样品损失并避免更换离心管，如果您的真空浓缩仪允许，第13步可在PCR管、条形管或96孔PCR板中进行，而无需使用1.5 mL微量离心管。许多真空浓缩仪可移除转子，从而便于条形管或板放入真空腔内。随后可使用含水干燥模式进行真空浓缩，无需离心。具体操作请参考您所用真空浓缩仪的使用说明书。若样品在条形管或96孔板中被完全干燥，则杂交步骤可在同一容器中直接进行。
在步骤17中，务必每隔10-12分钟涡旋一次，以提高磁珠捕获效率。混匀时应小心握住温育条带管的管盖，防止管子打开。
步骤18中所述的洗涤步骤对于避免非特异性污染至关重要，必须严格遵循。每次洗涤时务必彻底重悬磁珠，完全去除洗涤缓冲液；在使用洗涤缓冲液2进行洗涤时，需将样品转移至新的八联管中（步骤18.6.5）。确保链霉亲和素磁珠在整个孵育过程中始终保持完全重悬状态。液体溅至管盖不会对捕获效果产生负面影响。在室温洗涤过程中，可使用微孔板涡旋振荡器在整个两分钟孵育期间持续振荡样品，以利于磁珠重悬。切勿让链霉亲和素磁珠干燥。如有需要，可适当延长在缓冲液中的孵育时间，以防止磁珠干燥。若使用多个八联管，每次洗涤时应一次只处理一个八联管，其余八联管置于热循环仪中静置，这有助于避免磁珠过度干燥或操作仓促，从而导致重悬不充分或其他不理想的操作。对于初次使用者，不建议同时处理超过8个文库反应。
目前的免疫谱分析技术提供了一系列信息——从需要大量解读的数千个数据点（如RNA测序）到单个离散数据点（单重免疫组化）。本文所述方案介于两者之间，其研究范围较为集中，可实现高灵敏度，但仅捕获一部分临床上相关的转录组数据。由于采用的是总RNA提取方法，该方案无法提供有关免疫细胞与肿瘤微环境之间空间关系的信息，但可通过结合成像技术来补充这一信息。该方案生成的数据具有广泛的应用前景，因为关于癌症作为一种疾病的基本生物学特性以及正在开发的治疗方法，仍有许多待探索之处。如代表性结果所示，个体化免疫报告有助于理解患者免疫谱在疾病进展或治疗等事件发生时可能发生的改变。尽管本文展示的结果仅提供了部分示例性应用场景，但其他应用也同样切实可行，例如探究治疗手段的作用机制，以及识别与无进展生存期和总生存期等临床结局相关的潜在生物标志物。在将该方案用于生物标志物发现研究时，必须注重良好的实验设计，确保分析人群的同质性，纳入足够数量的样本以保证统计学效力，并充分考虑潜在的偏倚来源。由于该检测方法具有目标明确、流程简化的特性，一旦发现有效的生物标志物，未来有望实现其临床验证及后续应用。

在临床研究中，对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人类实体瘤组织样本中肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）及其他免疫相关分子进行定量分析已展现出重要价值1,2,3。流式细胞术和单细胞核糖核酸（RNA）测序等常用技术适用于新鲜组织和血液样本4，但由于无法从FFPE材料中制备出有活性的单细胞悬液，因而不适用于此类样本的分析。目前用于在FFPE组织中定量这些细胞的方法仍面临重大挑战。免疫组织化学（IHC）及其他类似的成像工作流程依赖特异性抗体检测细胞表面蛋白，而这些抗体在不同实验室间的标准化难度较大，难以实现可重复的定量分析5。nCounter系统等平台依赖单一基因的表达来定义关键免疫细胞6，限制了检测的灵敏度与特异性。尽管已有较为通用的RNA测序方法结合独立软件工具可供使用，但在实际应用前通常需要大量的优化与验证工作7,8,9,10,11,12。近年来，激光捕获显微切割（LCM）与RNA测序结合用于FFPE组织的技术已显示出潜力；然而，在旨在发现可靠生物标志物的转化研究中，仍亟需一种更高通量、即用型的解决方案13,14。在精准医学与免疫治疗时代，构建多维生物标志物的方法——例如预测性免疫建模（Predictive Immune Modeling）——能够高精度、高统计显著性地定义患者群体，包括治疗应答者、癌症亚型或生存结局，其重要性日益凸显15,16。
为满足这一需求，开发了一种免疫谱型分析方法，利用标准化的RNA测序试剂和基于云的信息学技术，实现对石蜡包埋（FFPE）实体瘤组织中免疫细胞的高灵敏度和特异性定量。该方案除了能够处理来自FFPE组织的降解RNA外，还可适用于来自有限组织样本的RNA，例如穿刺活检组织、细针抽吸物以及显微或宏观解剖分离的组织。每个样本的RNA数据将与一个名为“免疫健康表达模型”（immune Health Expression Models）的免疫细胞基因表达模型数据库进行比对，从而以占样本中总细胞数的百分比形式定量免疫细胞。简而言之，这些模型通过机器学习方法构建，从经纯化的免疫细胞群体（使用经典细胞表面标志物分离）获得的全转录组数据中识别出独特的多基因表达模式17,18。该技术所依赖的多维健康表达模型使本检测能够将每种免疫细胞在异质性细胞混合物中以占总细胞数的百分比形式进行定量，从而使研究人员能够开展样本间和样本内的免疫细胞比较分析，此类分析已被证明具有临床价值19,20。其他应用包括治疗前后免疫应答的定量分析，如代表性结果中所述。该检测可报告肿瘤及肿瘤微环境中多种免疫结构特征，包括八种免疫细胞类型的绝对百分比（基于基因表达模型得出）：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD56+ 自然杀伤细胞、CD19+ B细胞、CD14+ 单核细胞、调节性T细胞（Tregs）、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。此外，该检测还报告十个免疫逃逸相关基因的表达水平（以每百万转录本数，即TPM表示）：PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、TIM-3、BTLA、ICOS、CD47、IDO1 和 ARG1。
该试剂盒用于制备高质量文库，适用于Illumina测序平台，采用基于杂交捕获的文库构建方法，如图1所示。如果研究人员所在实验室没有Illumina测序平台，可将样本送至核心实验室进行测序。测序数据生成后将上传至Prism门户网站进行自动化分析，系统会返回每个样本的综合性、定量分析结果，即免疫报告（图2A）。用户也可在Prism门户网站中自定义样本分组，以生成生物标志物报告（图2B），突出显示在两组患者队列间具有统计学显著差异的生物标志物。重要的是，该试剂盒生成的数据仅用于科研目的，不得用于临床诊断。
<img alt="RNA测序工作流程；cDNA合成、PCR、杂交；流程图示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：工作流程概览。 在本实验方案中，首先将RNA转化为cDNA。连接测序接头后，通过PCR扩增并加上条形码，以构建捕获前文库。随后，生物素标记的探针与特定的cDNA靶标杂交，并利用链霉亲和素磁珠进行富集捕获。通过洗涤去除未结合的非靶标cDNA。最后通过PCR进一步富集，获得可用于测序的捕获后文库。*总RNA必须来源于人类样本；可以是完整RNA或降解RNA（如FFPE样本）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ImmunoPrism 分析、免疫细胞类型图表、预测准确性图、生物标志物分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：代表性免疫分析报告。 该工作流程生成两份报告：一份针对每个处理样本的个体免疫报告（A），以及一份针对特定患者队列的生物标志物报告（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
该方案从总RNA提取到构建完成可用于测序的文库，大约需要16小时的准备时间；然而，方案中已注明多个可选的暂停步骤。本检测利用转录组学丰富且动态的特性，突破传统单分析物生物标志物的局限，转向多维基因表达模型，从而借助标准化试剂和易于使用的软件工具，对组织样本进行全面的生物学表征。该技术使研究人员能够在自身实验室中应用现代技术，通过机器学习算法以及健康基因表达模型数据库，对珍贵的临床样本获得更准确、定量的免疫谱型，并发现具有完整统计分析的多维RNA生物标志物。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL PCR 8管排</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8管排</td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>MilliporeSigma</td><td>EX0276-1</td><td>实验当天用无核酸酶水配制80%乙醇</td></tr><tr><td>96孔热循环仪</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>固相可逆固定化（SPRI）磁珠</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63882</td><td>Agencourt AMPure XP &amp;ndash; PCR纯化磁珠</td></tr><tr><td>数字电泳芯片与试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Agilent 高灵敏度DNA芯片与试剂盒</td></tr><tr><td>数字电泳系统</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Agilent 2100 电泳生物分析仪</td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65306</td><td>Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠</td></tr><tr><td>ImmunoPrism试剂盒 &amp;ndash; 24反应</td><td>Cofactor Genomics</td><td>CFGK-302</td><td>Cofactor ImmunoPrism 免疫分析试剂盒 &amp;ndash; 24反应</td></tr><tr><td>人Cot-1 DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15279011</td><td>Invitrogen品牌</td></tr><tr><td>磁力分离架</td><td>Alpaqua/Invitrogen</td><td>A001322/12331D</td><td>96孔磁力环架</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>USA Scientific 1.5 mL低吸附微量离心管</td></tr><tr><td>NextSeq550</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>本方案可使用任意Illumina测序仪</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Prism提取试剂盒</td><td>Cofactor Genomics</td><td>CFGK-401</td><td>Cofactor Prism FFPE提取试剂盒 &amp;ndash; 24样本</td></tr><tr><td>纯化RNA</td><td>-</td><td>-</td><td>从人组织样本中纯化获得</td></tr><tr><td>荧光计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td>Qubit 4系统</td></tr><tr><td>荧光检测管</td><td>Axygen</td><td>PCR-05-C</td><td>0.5 mL薄壁PCR管配平盖</td></tr><tr><td>高灵敏度荧光检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HS检测试剂盒</td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>VacufugePlus</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅或加热金属块</td><td>VWR/USA Scientific</td><td>NA/2510-1102</td><td>VWR水浴锅/USA Scientific加热金属块</td></tr></tbody></table>

实体瘤的预测性免疫建模

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

免疫疗法在肿瘤患者治疗中展现出良好前景，但肿瘤微环境的复杂异质性使得治疗反应的预测具有挑战性。解析肿瘤组织内及周围免疫细胞相对群体的能力已被证明在理解治疗反应方面具有临床相关性，但传统技术如流式细胞术和免疫组织化学（IHC）存在局限性，包括所需组织量大、缺乏准确的细胞类型标志物以及诸多技术和操作上的障碍。一种检测方法（例如ImmunoPrism免疫分析检测）克服了这些挑战，能够兼容少量且高度降解的RNA，而这正是从临床存档的实体瘤组织中提取RNA的常见特征。该检测通过试剂盒和基于云的信息学平台实现，为Illumina测序平台提供端到端、定量、高通量的免疫谱分析解决方案。研究人员仅需使用两片福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片或20–40 ng总RNA（取决于样本质量）即可启动实验，该方案可生成一份免疫谱报告，定量分析八种免疫细胞类型和十个免疫逃逸基因，全面呈现肿瘤微环境的特征。所得数据无需额外的生物信息学分析即可直接使用。在具备适当样本队列的情况下，该方案还可用于在特定患者群体中识别具有统计学意义的生物标志物。

在整个实验流程中设有多个检测点，可供使用者评估所获得材料的质量与数量。在完成方案中描述的第12步后，将生成如图3所示的电泳图谱，该图谱代表了完整RNA样本（RIN = 7.8）在捕获前文库中的典型情况。
<img alt="电泳分析图，DNA分离，荧光单位与碱基对，峰值数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：完整RNA样本的典型捕获前文库Bioanalyzer图谱。 捕获前文库在250-400碱基对（bp）范围内呈现为一个宽峰。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
应注意避免过度扩增，如图4所示，该图是来自FFPE RNA样本（DV200 = 46）的捕获前文库的代表性电泳图谱，显示在约1,000 bp处出现第二个峰。如果该峰相对于主峰（如图所示，位于约250-400碱基对（bp））较小，则不会干扰后续步骤或分析。如果该第二峰相对于250-400 bp峰较大，可减少PCR循环次数重新制备捕获前文库，以降低过度扩增。 
<img alt="DNA片段分析的电泳图谱，显示峰强度与片段大小（bp标度）的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本的典型捕获前文库生物分析仪图谱。 在约1,000 bp处出现的第二个峰提示存在扩增过度现象。如果该峰相对于主峰（位于约250–400 bp处，如图所示）较小，则不会干扰后续步骤或分析结果。如果该峰相对于250–400 bp处的主峰较大，可通过减少PCR扩增循环数重新制备捕获前文库，以降低过度扩增的程度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
如步骤12.1.3所述，应评估接头二聚体的存在情况，以确定是否需要进行额外纯化。图中所示的电泳图谱 图5 代表不可接受的（图5A，DV200 = 33）且可接受（图5B，DV200 接头二聚体的水平，表现为约128 bp处的尖锐峰。
<img alt="显示吸收峰的光谱图对比；化学成分分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：捕获前文库的Bioanalyzer电泳图谱。 接头二聚体在约128 bp处表现为一个尖锐的峰。(A) 该电泳图中存在过量的接头二聚体。(B) 该图谱中接头二聚体水平处于可接受范围。两条图谱均显示出轻微过量扩增的迹象，但这不会影响ImmunoPrism检测的进行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
在测序前完成本方案后，需再次通过数字电泳对最终文库进行评估。由FFPE RNA构建的文库通常比由完整RNA构建的文库具有更小的平均片段分布。对于完整RNA样本，所得电泳图谱应类似于图6（RIN = 9.5）；对于降解或FFPE RNA样本，所得电泳图谱应类似于图7（DV200 = 36）。
<img alt="电泳图；毛细管电泳结果；DNA片段分析；峰强度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：完整RNA样本的最终文库Bioanalyzer检测典型图谱。 最终文库在大小约为250-400碱基对（bp）处呈现为一个宽峰。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电泳结果；峰分析图；DNA片段分离；FU与bp对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：FFPE RNA样本文库的典型最终Bioanalyzer检测图谱。 由FFPE RNA构建的文库通常比完整RNA构建的文库具有更小的平均片段大小分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
如所述，本方案产生的结果可通过两种主要方式加以应用，如图8所示。
<img alt="个体化及多维免疫谱分析；RNA测序；示意图；生物标志物发现。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：本方案的两个应用案例。 本免疫谱分析实验所产生的结果可用于两个关键的转化应用场景。（A）第一个应用案例从人实体瘤组织（包括FFPE存档样本）出发，为样本生成个体化的免疫谱。（B）当一组人源样本的数据生成后，可通过Prism Portal整合数据，生成多维生物标志物及相应的《生物标志物报告》。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了展示上述每种应用场景，本文包含了一项小型转化研究的代表性数据21。本研究所用样本来自7名被诊断并接受治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者，均为患者自身匹配的实体瘤组织，取自治疗前和治疗后的活检样本。首先，对各个样本进行分析以生成免疫谱，例如图9所示的示例报告。
<img alt="ImmunoPrism 报告图表与结果；免疫谱型分析；CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 9"> 
图9：NSCLC样本的个体化免疫报告示例。 Prism Portal 分析流程为每个处理的样本生成一份图形化报告，此处展示的是针对一个NSCLC实体瘤样本生成的代表性报告。(A) 报告正面以图形方式展示从FFPE组织中提取的RNA样本所含免疫细胞的组成情况。(B) 报告背面包含免疫细胞（以绝对百分比表示）和免疫逃逸基因表达水平（以每百万转录本数，即TPM表示）的表格，以及该检测的性能说明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
治疗前后的免疫谱可用于理解某种疗法（本研究中为化疗或放疗）对肿瘤微环境的改变情况。图10展示了一个示例，显示单例患者在化疗前后各免疫细胞类型百分比及总免疫细胞含量的变化。
<img alt="实验前后免疫细胞百分比变化；折线图；CD4+、CD8+ T细胞；免疫学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图10"> 
图10：治疗前后结果示例。 显示来自一名非小细胞肺癌（NSCLC）患者治疗前后样本所生成的个体免疫细胞及总免疫细胞含量数据。本示例中，该患者接受了化疗方案作为治疗。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
可根据临床结局或表型等标准将患者分组进行比较。例如，在图11中，非小细胞肺癌（NSCLC）研究中的样本根据治疗后疾病进展时间进行比较。一部分患者在>18个月后出现疾病复发，另一部分患者进展较快，在≤18个月内即出现进展。通过比较每个样本的中位数Δ值（治疗前与治疗后数值的差异），以识别潜在的疾病进展生物标志物。
<img alt="不同年龄组免疫细胞百分比柱状图；CD4、CD8 T细胞、B细胞、单核细胞" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图11"> 
图11：临床结局比较示例。 通过计算匹配的非小细胞肺癌治疗前与治疗后样本中免疫细胞百分比的定量变化，得出并报告为“delta”值。以黄色突出显示的部分表明生存状态之间的明显信号变化。蓝色条形表示中位 delta 值 &gt;疾病进展前18个月，橙色条形表示疾病进展前≤18个月的中位delta值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
最后，可使用类似的样本分组，专门分析治疗前样本，通过 Prism Portal 生成生物标志物报告，以识别预测性生物标志物。如图12所示，样本分组由与上述相同的临床表型（疾病进展）定义。在此示例中，两个免疫逃逸基因被鉴定为样本分组之间具有统计学显著差异的区分因子（CD47 和 OX40，见图12A下图）。本例中，由于单个基因生物标志物本身已具有稳健性且统计学意义明确，多维生物标志物并未带来显著的额外预测价值（即图中右上角柱状图标注的 ImmunoPrism，见图12B）。报告背面汇总了完整的数据表格，包括该检测中全部18种分析物的结果、统计分析以及简要的方法学概述。
<img alt="显示分析物性能数据图表的 ImmunoPrism 生物标志物报告，突出其预测准确性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图12"> 
图12：非小细胞肺癌样本的生物标志物报告示例。 生物标志物发现流程可生成单个生物标志物的可视化报告以及基于机器学习的多维生物标志物报告，并附有详细的统计信息。（A）在本研究中，该流程鉴定出两个具有统计学意义的单个生物标志物（CD47 和 OX40），可用于界定18个月时间阈值下的疾病进展。（B）报告背面包含方法细节及完整结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充表 1：试剂盒材料。 列出了 ImmunoPrism 试剂盒中包含的材料清单，以及制造商说明书中的对应货号。其他所需设备和材料详见材料表。请访问 <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> 获取安全数据表（SDS）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。</a>
补充表 2：PCR 仪程序。 本方案中引用的推荐 PCR 仪程序汇总如下，便于编程设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。</a>
补充表 3：测序索引指南。 列出了试剂盒中提供的索引引物；每个反应中加入一种独特的引物，用于测序后的数据拆分。同时也提供了推荐的低通量多重组合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。</a>

本文通过分子与信息学实验方案，描述了利用基于RNA的方法对实体瘤组织进行定量免疫谱分析，并借助临床队列开展肿瘤免疫学生物标志物发现的研究策略。

免疫疗法在肿瘤患者治疗中展现出前景，但肿瘤微环境的复杂异质性使得治疗效果的预测具有挑战性。

全面表征肿瘤微环境在肿瘤免疫学研究中至关重要。该检测是首个利用基于RNA的健康表达模型来测量实体瘤组织中免疫细胞的方法。该检测使研究人员能够对FFB实体瘤组织中的免疫微环境进行高灵敏度和高特异性的定量分析，并可将这些结果整合为一个多维度的生物标志物。所有癌症治疗方法，而不仅仅是免疫疗法，都会在实体瘤部位引发免疫反应。测量这种免疫反应对于理解疾病进展和治疗反应至关重要。本方案将传统的RNA文库制备技术与靶向捕获相结合。尽管耗时，遵循建议的洗涤步骤并监控质量控制关键点对成功至关重要。对于来自福尔马林固定石蜡包埋样本的高度降解RNA，应根据表格在冰上配制第一链合成反应体系。在微量离心机中短暂离心样品前，通过反复吹打数次充分混匀反应液。离心结束后，立即将样品放入预热的热循环仪中，按照表格中的程序三进行操作。对于高质量的完整RNA，按照表格中所述，在无核酸酶的PCR管中于冰上配制第一条链合成反应体系。开始此操作时，将200纳克目标条形码文库与2微克COT-1 DNA以及2微升阻断寡核苷酸在无核酸酶的PCR管中混合。然后使用真空浓缩仪，在30至45摄氏度条件下干燥管内样品。杂交完成后，从PCR仪中取出样本，并将PCR仪温度设置为65摄氏度，加热盖温度设为70摄氏度进行孵育。使用多通道移液器将17微升充分混匀的磁珠转移至样本中，并上下彻底吹打10次。为使DNA结合到磁珠上，将试管放入热循环仪中，按照程序10运行，每隔10至12分钟短暂取出一次试管条，轻轻涡旋振荡3秒，以保持磁珠充分悬浮。结合孵育结束后，立即从热循环仪中取出一条试管，向各管中加入100微升预热的洗涤缓冲液一。用移液器上下充分吹打10次，然后将试管置于磁力架上，使磁珠完全与洗涤液分离，随后吸除含有未结合DNA的上清液。从支架上取下离心管，加入150微升预热的严格洗涤缓冲液，充分混匀，彻底重悬磁珠，注意避免产生气泡。将离心管放回65摄氏度的热循环仪中孵育5分钟，然后将离心管再次置于磁力架上，使磁珠完全与上清液分离。弃去含有未结合DNA的上清液，按照上述方法用预热的严格洗涤缓冲液再洗涤磁珠一次，共进行两次严格洗涤。最后一次洗涤后，移除上清液，并向各管中加入150微升室温洗涤缓冲液一。用移液器吹打10至20次，充分重悬磁珠，将样品在密封盖下孵育2分钟，期间交替进行30秒涡旋振荡和30秒静置。孵育结束后，短暂离心，将管子置于磁力架上，待磁珠完全吸附至磁铁一侧后，移除上清液。将管子盖上管盖后短暂离心，并将样本放回磁力架上。使用10微升移液器去除残留的洗涤缓冲液，然后加入150微升室温洗涤缓冲液二。用移液器吹打10至20次，充分重悬磁珠，随后密封管盖，将样本孵育两分钟，期间交替进行30秒涡旋振荡和30秒静置。短暂离心后，将每根试管中的全部珠子转移至洁净的无核酸酶 PCR 管中，并将试管置于磁力架上。弃去含有未结合 DNA 的上清液后，再次短暂离心样品，并使用 10 微升移液器在珠子处于磁力架上的同时吸除残留的洗涤缓冲液。向各管中加入 150 微升洗涤缓冲液三，上下吹打 10 至 20 次，彻底重悬珠子。将离心管孵育2分钟，交替进行30秒轻柔涡旋和30秒静置，然后短暂离心。将离心管置于磁力架上，吸除上清液，并再次短暂离心磁珠样品。当磁珠仍处于磁力架上时，使用10微升移液器吸去磁珠表面残留的洗涤缓冲液，随后将离心管从磁力架上取下，每管用20微升无核酸酶水重悬磁珠。然后用移液器吹打珠子10次，以确保粘附在管壁上的珠子完全重悬。应评估接头二聚体的存在情况，以确定是否需要进一步纯化。例如，此电泳图显示接头二聚体水平可接受，表现为约128个碱基对处的尖锐峰，而此电泳图显示接头二聚体水平不可接受。治疗前后的免疫谱可用于理解特定疗法对肿瘤微环境的影响，如此处所示的代表性分析，其中展示了一名患者在化疗前后每种目标免疫细胞百分比的变化以及总免疫细胞含量的变化。在本分析中，根据治疗后疾病进展时间，比较了不同患者组间的样本。一部分患者在18个月后出现疾病复发，而另一部分患者则在18个月或更短时间内进展更快。随后可比较每个样本的中位数delta值，以鉴定疾病进展的潜在生物标志物。例如，在此鉴定出两个免疫逃逸基因作为样本分组的具有统计学显著性差异的区分指标。由于单个基因生物标志物具有稳健性且统计学显著性明确，多维生物标志物并未增加显著的预测价值。务必一次对一个条带进行加热洗涤，以防止样品冷却，并记得将磁珠转移至新的离心管中，以避免非靶向污染。本方案展示了利用基因表达模型来定量免疫细胞和肿瘤组织的方法。目前正开发新的模型，用于检测细胞状态，例如耗竭或活化。

predictive-immune-modeling-of-solid-tumors

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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本方案概述了用于免疫肿瘤学研究的人源化免疫系统（HIS）小鼠的构建方法。本文介绍了在此模型中移植人源肿瘤并用于测试人源免疫治疗药物的操作步骤和注意事项，重点在于表征人源免疫系统对肿瘤的应答反应。...

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