Name: 小鼠胚胎细胞的多路复用单细胞mRNA测序分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解基于液滴的多路复用小鼠胚胎单细胞mRNA测序方法，用于分析基因表达并降低实验成本。该技术可同时处理多个样本，有效减少批次效应，为发育生物学研究提供高质量数据支持。

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我们感谢来自Zev J. Gartner博士实验室的David M. Patterson和Christopher S. McGinnis提供了基于脂质的条形码试剂，并对实验步骤和数据分析提出了建议。本工作由美国国立卫生研究院（HL13347202）资助。

动物实验程序遵循匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定。
1. 小鼠胚胎心脏解剖及单细胞悬液制备
注意：此步骤可能需要数小时，具体时间取决于需解剖的胚胎数量。
<ol>
	<li>为获取 E18.5 胚胎心脏，通过 CO2 吸入法处死一只怀孕的 CD1 小鼠。使用剃刀去除腹部多余毛发，并用 70% 乙醇对皮肤进行消毒。</li>
	<li>使用灭菌剪刀剪开腹部皮肤，小心分离胚胎并迅速将其放入盛有冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）的容器中。</li>
	<li>在体视显微镜下，用镊子和剪刀在盛有冷 PBS 的 10 cm 培养皿中仔细分离每个胚胎的心脏。 
	注意：通过连同心肺组织一起解剖以保持四个心腔完整，切勿直接用手术器械夹取或牵拉心脏。</li>
	<li>将约 10 个心脏转移至另一盛有冷 PBS 的 10 cm 培养皿中，并进行显微解剖，分离出左心房、右心房、左心室和右心室。 
	注意：预计每份样本可获得超过 1 × 106 个细胞。建议每样本起始细胞数不少于 1 × 105 个。</li>
	<li>将四个心腔组织分别转移至 1.5 mL 离心管中，用剪刀剪碎组织。在 300 × g 条件下离心 3 分钟，收集组织沉淀。</li>
	<li>吸除上清液后，向每管中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液，在 37 °C 水浴中孵育 10 分钟。使用 P1000 移液器轻柔吹打 7–8 次。</li>
	<li>若胚胎发育阶段晚于 E11.5，需向每管中加入 1 mL 10 mg/mL 胶原酶 A/B 混合液，在 37 °C 孵育 10–20 分钟。轻柔吹打直至大部分细胞解离。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，加入 8 mL 汉克氏平衡盐溶液（HBSS）以稀释酶液。在 300 × g 条件下离心 5 分钟。将细胞重悬于 1 mL PBS 中，转移至 1.5 mL 离心管，并通过 40 µm 细胞滤器过滤。</li>
	<li>从每个样本中取 15 µL 细胞悬液，与等体积 0.04% 台盼蓝混合。将混合液加入细胞计数板，在细胞计数仪中进行计数。 
	注意：为获得高质量结果，建议细胞活力高于 95%。</li>
</ol>
2. 单细胞多重条形码标记
注意：此步骤至少需要 40 分钟，具体时间根据处理的样本数量而定。扩增前步骤（步骤 2.11 至 3.11）需在经过 RNase 去污染溶液处理的洁净工作台区域进行，扩增后步骤（步骤 3.11 之后）则需要另一个独立的洁净工作台区域。
<ol>
	<li>基于脂质的条形码标记流程（可选流程1）
	<ol>
		<li>根据细胞浓度，确保每个样本的细胞数少于 5 x 105 个。确保细胞悬液中无碎片和细胞团块。</li>
		<li>为每个样本配制 2 µM 的锚定/条形码储备液和 2 µM 的共锚定储备液（表1）。 
		注意：锚定物和共锚定物由 Zev J. Gartner 博士实验室惠赠。合成这些脂质修饰的寡核苷酸时，将DNA序列在固相载体上与脂肪酸偶联，并通过反相高效液相色谱法（HPLC）进行纯化18,19。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞两次，在 300 x g 条件下离心 5 分钟收集细胞，然后将细胞重悬于 180 µL PBS 中。</li>
		<li>加入 20 µL 锚定/条形码储备液，轻轻吹打混匀，冰上孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入 20 µL 共锚定储备液，轻轻吹打混匀，再于冰上孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入 1 mL 含 1% BSA 的冷 PBS，在 4 °C、300 x g 条件下离心 5 分钟。再用冰预冷的含 1% BSA 的 PBS 至少洗涤 2 次。</li>
		<li>将所有样本合并，经 40 µm 细胞滤网过滤，计数细胞，并将细胞悬液置于冰上保存，用于第3节实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于抗体的条形码标记流程（可选流程2）
	<ol>
		<li>将每个样本（来自步骤1.8）的 1 x 106–2 x 106 个细胞在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃上清，用 100 µL 染色缓冲液（材料表）重悬于 1.5 mL 低吸附离心管中。</li>
		<li>加入 10 µL Fc 封闭试剂，在 4 °C 孵育 10 分钟。</li>
		<li>将抗体（见 材料表）在 2–8 °C 条件下以 14,000 x g 离心 10 分钟进行预处理。</li>
		<li>将每种寡核苷酸偶联抗体各取 1 µg 加入 50 µL 细胞染色缓冲液中，配制成抗体染色液20。每管样本中加入一种抗体染色液，在 4 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次，每次在 4 °C、350 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>按所需比例将所有样本合并于 1 mL 染色缓冲液中，在 4 °C、350 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于 PBS 中，调整至适当浓度（最高可达 1,500 个细胞/µL），并通过 40 µm 细胞滤网过滤。立即进入下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 液滴生成与 mRNA 逆转录
注意：一个多重反应大约需要 90 分钟。
<ol>
	<li>将凝胶珠（见材料表）于室温平衡30分钟。从凝胶珠乳液（GEMs）试剂盒中取出试剂（见材料表），并按指示温度保存。</li>
	<li>将芯片B组装至芯片支架中（见材料表）。</li>
	<li>向第1行未使用的孔中加入75 µL的50%甘油溶液；第2行为40 µL；第3行为280 µL。芯片顶部回收孔中不得添加甘油。</li>
	<li>根据表1在冰上配制主混合液。根据细胞悬液体积计算器表格17，向主混合液中加入相应体积的细胞悬液和无核酸酶水，轻轻吹打混匀。将75 µL细胞混合液缓慢加入第1行样品孔底部中央，避免产生气泡。</li>
	<li>使用涡旋适配器将凝胶珠涡旋30秒，并缓慢将40 µL凝胶珠加入第2行凝胶珠孔底部中央，避免引入气泡。 
	注意：加入细胞与凝胶珠之间必须间隔30秒，以避免润湿失败。</li>
	<li>对于第3行的分隔油孔，沿孔壁加入280 µL分隔油。 
	注意：若分隔油加入量少于270 µL，将导致GEMs生成异常。</li>
	<li>将垫圈安装到芯片上，不要按压垫圈，并保持其水平，以避免润湿垫圈。</li>
	<li>将带垫圈的组装芯片放入Chromium控制器中，运行Chromium单细胞B程序（见材料表），程序完成后立即进入下一步。</li>
	<li>取出芯片并丢弃垫圈。将盖子向后折叠，以45°角暴露各孔，检查液面，确保无堵塞现象。</li>
	<li>从回收孔最低点缓慢吸取100 µL GEMs，检查GEMs的均匀性。将GEMs沿管壁加入新的聚合酶链式反应（PCR）管中，置于冰上。 
	注意：若观察到过量水相层，建议重新制备样品。重要的是，在GEMs仍位于移液枪头中时拍摄混合物照片。该照片可用于判断是否存在润湿失败、部分乳化GEMs或试剂堵塞情况。此照片还可作为向试剂公司申请更换试剂和芯片并获得赔偿的依据。</li>
	<li>将PCR管放入热循环仪中，进行逆转录反应（表2）。 
	注意：可在此处暂停，或继续下一步操作。PCR产物可在-20 °C保存最多一周。</li>
</ol>
4. cDNA 扩增
注意：此步骤大约需要 150 分钟。
<ol>
	<li>单细胞逆转录后纯化
	<ol>
		<li>从GEMs试剂盒中取出cDNA扩增试剂（参见材料表），并将其保存在指定温度下。</li>
		<li>在室温下向样品中加入125 µL回收剂，形成两相混合物。不应观察到不透明液体，避免吹打或涡旋混合物。</li>
		<li>等待60秒后，缓慢从管底移除125 µL回收剂。</li>
		<li>充分涡旋磁珠（参见材料表）30秒，并立即用于配制磁珠纯化混合液（表1）。试剂应按所列顺序依次加入。</li>
		<li>涡旋磁珠纯化混合液，取200 µL加入样品中。吹打混合10次，室温孵育10分钟。</li>
		<li>按表1所列顺序依次加入试剂，配制洗脱液，并按以下步骤洗脱cDNA：
		<ol>
			<li>将样品置于磁力架（高位置）（参见材料表），直至溶液澄清，然后移除上清液。</li>
			<li>向沉淀中加入200 µL 80%乙醇。静置30秒后，移除乙醇。</li>
			<li>重复步骤4.1.6.2两次。短暂离心后置于磁力架（低位置）。小心移除残留乙醇，并在空气中干燥少于2分钟。 
			注意：干燥时间不得超过2分钟，否则洗脱效率将下降。</li>
			<li>将样品从磁力架上取下，加入35.5 µL洗脱液，吹打混匀15次，室温孵育2分钟。</li>
			<li>将样品放回磁力架（高位置），直至溶液澄清。将35 µL样品转移至新的八联管中。 
			注意：该纯化步骤也用于步骤4.2.1.6、4.2.2.3、5.8、6.1.10和6.2.6。请注意每一步中磁珠的浓度，以及用于洗脱样品的EB缓冲液或超纯水的体积。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用自动化电泳仪21（参见材料表）测定洗脱cDNA的片段大小、浓度和完整性（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cDNA扩增
	<ol>
		<li>基于脂质条形码策略的cDNA扩增（可选步骤1）
		<ol>
			<li>在冰上配制扩增反应混合液（表1）。</li>
			<li>将扩增反应混合液加入35 µL cDNA样品（来自步骤4.1.6.7）中。吹打混匀，短暂离心。按照cDNA扩增程序（表2）在热循环仪中孵育混合物。</li>
			<li>充分涡旋后，向100 µL样品中加入120 µL选择试剂和100 µL超纯水，使选择试剂终浓度为0.6x（参见材料表）。吹打混合15次。</li>
			<li>室温孵育5分钟，然后将样品置于磁力架上直至溶液澄清。 
			注意：磁珠部分中的内源性cDNA保留在沉淀中，而多重条形码cDNA位于上清液中。</li>
			<li>将上清液转移至1.5 mL低吸附管中，用于步骤6.1的多重条形码cDNA文库构建。</li>
			<li>按照步骤4.1.6的方法纯化内源性cDNA，并用40 µL EB缓冲液进行洗脱。</li>
			<li>取1 µL纯化后的cDNA样品，在自动化电泳仪（参见材料表）上运行，用于分析/定量cDNA。</li>
			<li>取10 µL cDNA分装至新的PCR管中，用于内源性文库构建。 
			注意：可在此暂停，或继续下一步。如需后续构建额外文库，剩余样品可在-20 °C保存最多4周。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>基于抗体条形码策略的cDNA扩增（可选步骤2）
		<ol>
			<li>向50 µL扩增反应混合液（表1）中加入2 pmol HTO和ADT加成引物以及15 µL cDNA引物，按照cDNA扩增程序（表2）进行cDNA扩增。</li>
			<li>使用0.6x选择试剂分离内源性cDNA（磁珠部分）和多重条形码cDNA（上清液）。请记住保留上清液，用于步骤6.2的条形码文库构建。</li>
			<li>按照步骤4.1.6的方法纯化并洗脱内源性转录本cDNA，进行文库质量控制（QC），并将10 µL分装至新的PCR管中用于内源性文库构建。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 内源性转录本文库制备
注意：此步骤大约需要 120 分钟。
<ol>
	<li>将文库构建试剂盒中的基因表达文库构建试剂（参见材料表）分别保存在指定温度下。</li>
	<li>在冰上配制片段化混合液（表1），用移液器混匀后短暂离心。</li>
	<li>向10 µL纯化的cDNA样品（来自步骤4.2.1.8或4.2.2.3）中加入25 µL EB缓冲液，然后加入新配制的15 µL片段化混合液，在冰上用移液器吹打混合15次，短暂离心。</li>
	<li>将样品转移至预冷的PCR仪中，启动用于片段化、末端修复和A尾添加的PCR程序（表2）。</li>
	<li>涡旋振荡选择试剂以重悬磁珠，并依次使用0.6×和0.8×选择试剂，按照用户指南17,22进行双端片段大小筛选。使用50 µL EB缓冲液洗脱DNA。</li>
	<li>配制接头连接混合液（表1），充分吹打混匀后短暂离心。</li>
	<li>向50 µL样品中加入50 µL接头连接混合液，再次吹打混合15次，短暂离心。按照说明书在PCR仪中进行接头连接反应（表2）。</li>
	<li>使用0.8×选择试剂纯化连接产物，并用30 µL EB缓冲液洗脱纯化后的样品（参见步骤4.1.6）。</li>
	<li>配制样本加标签PCR混合液（表1），取60 µL加入纯化后的样品中。向样品中加入10 µL样本标签引物，上下吹打混匀5次，短暂离心，随后在PCR仪中按照样本标签程序进行孵育（表2）。 
	注意：可在此暂停，或继续下一步操作。若使用多个孔，请为每个孔选择特定的样本标签（参见材料表），记录每个孔所用的标签ID，并确保在多重测序运行中无标签重叠。</li>
	<li>依次使用0.6×和0.8×选择试剂进行双端片段大小筛选，获得35 µL纯化的内源性细胞文库DNA17。</li>
	<li>在测序前对内源性细胞文库进行质量控制（图2）。</li>
</ol>
6. 多重测序样本条形码cDNA文库的制备
注意：此步骤至少需要 120 分钟。
<ol>
	<li>基于脂质多重检测策略的样本条形码文库构建（可选步骤1）
	<ol>
		<li>向4.2.1.5步骤获得的样本条形码cDNA中加入520 µL选择性试剂和360 µL异丙醇，使选择性试剂终浓度为3.2倍。用移液器吹打混合10次，室温孵育5分钟。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上，静置至溶液澄清，弃去上清液。</li>
		<li>使用500 µL 80%乙醇在磁力架上洗涤磁珠两次，每次洗涤后静置30秒。</li>
		<li>短暂离心磁珠后置于磁力架上，用P10移液器吸除残留乙醇，磁珠室温静置2分钟。</li>
		<li>将离心管从磁力架上取下，加入50 µL EB缓冲液重悬磁珠，上下吹打充分混匀，室温孵育2分钟。</li>
		<li>将离心管放回磁力架，静置至溶液澄清，将上清液（样本条形码cDNA）转移至新的PCR管中。注意避免转移任何磁珠。</li>
		<li>测定样本条形码cDNA的浓度23。</li>
		<li>配制脂质条形码文库反应体系（表1），加入3.5 ng纯化的条形码cDNA（来自步骤6.1.6）及无核酸酶水，总体积为50 µL。</li>
		<li>将反应体系置于热循环仪中，按照基于脂质的条形码文库PCR程序进行扩增（表2）。</li>
		<li>使用1.6倍选择性试剂纯化PCR产物，并用25 µL EB缓冲液洗脱DNA（参见步骤4.1.6）。</li>
		<li>采用高灵敏度DNA分析方法测定文库浓度24，起始稀释比例为1:5（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于抗体多重检测策略的样本条形码文库构建（可选步骤2）
	<ol>
		<li>向4.2.2.3步骤获得的含样本条形码的上清液中加入额外1.4倍反应体积的选择性试剂，使选择性试剂终比例为2倍。</li>
		<li>按照步骤4.1.6的操作使用80%乙醇洗涤磁珠，并用超纯水洗脱条形码cDNA。</li>
		<li>再次使用2倍选择性试剂进行选择性纯化操作，并用超纯水洗脱。</li>
		<li>配制抗体条形码文库反应体系（表1），加入上一步纯化的条形码cDNA共45 µL。</li>
		<li>将反应体系置于热循环仪中，按照抗体条形码文库PCR程序进行扩增（表2）20。</li>
		<li>使用1.6倍选择性试剂纯化PCR产物，并用30 µL超纯水洗脱纯化后的样本（参见步骤4.1.6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 文库测序
注意：可使用多种下一代测序平台（如 HiSeq 4000 和 NovaSeq）对内源性转录本文库和多重条形码文库进行测序。
<ol>
	<li>选用合适的下一代测序平台，对内源性转录本文库和多重条形码文库进行测序。</li>
	<li>根据测序公司或测序平台专家的建议稀释文库。内源性转录本文库建议每个细胞至少测序 20,000 条读长，条形码文库建议至少 3,000 条读长。</li>
</ol>
8. 数据分析
注意：使用基于云的资源 BaseSpace 或在 UNIX 服务器上运行 bcl2fastq 软件包对测序数据进行解复用。
<ol>
	<li>内源性转录组数据分析
	<ol>
		<li>利用解复用软件生成的 fastq 数据，在商用数据分析流程（参见材料表）上运行 &#34;mkfastq&#34;，以进一步对每个 GEMs 条形码进行解复用。</li>
		<li>运行 &#34;count&#34; 进行序列比对、过滤、条形码计数和 UMI 计数。</li>
		<li>可选地，运行 &#34;aggr&#34; 将来自同一实验的多个测序通道数据进行合并。</li>
		<li>使用 &#34;cell browser&#34;（参见材料表）可视化数据、对细胞进行聚类、鉴定差异表达基因，并生成 tSNE 图或基因表达热图。</li>
		<li>可选地，使用一个维护良好的基于 R 的分析平台25（参见材料表）对数据进行标准化和缩放处理，鉴定差异表达基因，并生成 tSNE/UMAP 图和基因表达热图（图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多重条形码数据分析
	<ol>
		<li>基于脂质条形码策略的数据分析
		<ol>
			<li>使用商用数据分析流程或 deMULTIplex R 软件包（<a href="https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq" target="_blank">https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq</a>）将样本条形码 FASTQ 文件转换为样本条形码 UMI 计数矩阵。</li>
			<li>将条形码 UMI 计数矩阵与内源性转录组数据一并加载至基于 R 的分析平台（参见材料表），进行整合分析（图 3）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>基于抗体条形码策略的数据分析
		<ol>
			<li>在商用数据分析流程中使用 &#34;count&#34;，通过提供文库 CSV 文件和标签特征参考 CSV 文件，对条形码进行比对。</li>
			<li>将输出的统一特征-条形码矩阵（其中包含每个细胞条形码对应的基因表达计数和特征条形码计数）加载至基于 R 的分析平台，进行下游分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究中，我们展示了一种分析单细胞转录谱的实验方案。同时提供了两种可选方法，用于在单细胞RNA测序（scRNA-Seq）工作流程中对样本进行多重检测。这两种方法已在多个实验室中被证实可行，可有效支持低成本且无批次效应的单细胞实验18,26。
在进行实验方案时，应仔细遵循若干步骤。理想的单细胞悬液中活细胞比例应超过&#62;90%，且细胞密度也应处于特定范围内27。获得高质量的细胞至关重要，以尽量减少细胞聚集体、碎片和纤维的存在。细胞聚集体对样本多重分析具有负面影响，并可能堵塞液滴生成仪器17。通常情况下，使用30–40 µm的细胞筛网是去除大块聚集体和碎片同时保留细胞样本的理想选择，因为大多数细胞在解离后直径会缩小至30 µm以下。如果细胞直径大于30 µm，则建议改用单细胞核。在小鼠胚胎发育的早期阶段，所有类型的细胞大小均应小于30 µm；但在后期阶段，心脏中的心肌细胞...

在胚胎发育过程中，不同细胞群体中每个单细胞的转录谱存在差异。尽管单分子原位杂交可用于可视化少数基因的表达1，单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）则提供了一种无偏倚的方法，用于揭示单个细胞中全基因组范围的基因表达模式。自2009年首次发表以来2，近年来scRNA-Seq已被应用于研究多个发育阶段的多种组织3,4,5。此外，随着人类细胞图谱近期启动了聚焦发育的研究项目，预计在不久的将来将产生更多来自人类胚胎组织的单细胞数据。
心脏作为第一个发育的器官，在胚胎发育过程中起着至关重要的作用。心脏由多种细胞类型组成，每种细胞类型的发育均受到严格的时间和空间调控。近年来，早期发育阶段心脏细胞的起源和细胞谱系已被逐步阐明6，这些研究为理解先天性心脏病的发病机制以及开发更先进的技术以促进心肌细胞再生提供了极为重要的指导工具7。
近年来，单细胞RNA测序（scRNA-Seq）技术迅速发展8,9,10。随着新方法的不断出现，单细胞实验的设计与分析已变得更加可行11,12,13,14。本文所述方法是一种基于液滴系统的商业化操作流程（参见材料表）15,16。该方法的特点是利用微流控系统控制，在油水乳液微滴中捕获单个细胞及带有独特条形码的微珠。细胞进入微滴的速率极低，从而确保绝大多数乳液微滴中仅包含一个细胞17。该流程的巧妙设计在于将单细胞分离至乳液微滴的过程与条形码标记同步进行，从而能够在异质性细胞群体中利用RNA-Seq实现对单个细胞的并行分析。
引入多重化策略是传统单细胞工作流程的重要补充之一13,14。该补充在剔除细胞双联体、降低实验成本以及消除批次效应方面具有重要作用18,19。基于脂质的条形码标记策略和基于抗体的条形码标记策略（见材料表）是目前最常用的两种多重化方法。在这两种方法中，均使用特定的条形码对每个样本进行标记，随后将标记后的样本混合，进行单细胞捕获、文库构建和测序。之后，可通过分析条形码序列将混合的测序数据区分开来（图1）19。然而，这两种方法之间存在显著差异。基于脂质的条形码标记策略依赖于脂质修饰的寡核苷酸，目前尚未发现其对特定细胞类型存在偏好性；而基于抗体的条形码标记策略仅能检测表达相应抗原蛋白的细胞19,20。此外，脂质染色约需10分钟，而抗体染色则需40分钟（图1）。进一步地，脂质修饰寡核苷酸的成本低于抗体偶联寡核苷酸，但在撰写本文时尚未实现商业化供应。最后，基于脂质的策略可在一次实验中实现96个样本的多重化，而基于抗体的策略目前最多仅能实现12个样本的多重化。
单次实验中建议的多重检测细胞数量应低于 2.5 × 104，否则将导致较高的细胞双联体比例以及潜在的环境mRNA污染。通过多重检测策略，多个样本的单细胞捕获、cDNA生成和文库构建成本可降低至单个样本的水平，但测序成本保持不变。

<table><tbody><tr><td>10% Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x 芯片架</td><td>10x Genomics</td><td>120252 330019</td><td></td></tr><tr><td>10x Chromium Controller</td><td>10x Genomics</td><td>120223</td><td></td></tr><tr><td>10x 磁力分离器</td><td>10x Genomics</td><td>120250 230003</td><td></td></tr><tr><td>10x Vortex 适配器</td><td>10x Genomics</td><td>330002, 120251</td><td></td></tr><tr><td>10x Vortex 夹子</td><td>10x Genomics</td><td>120253 230002</td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation 系统</td><td>安捷伦</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 高灵敏度 DNA 检测试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>5067-4626</td><td>匹兹堡大学健康科学测序中心</td></tr><tr><td>条形码寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>单链DNA</td><td>25 nmol</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>CD1小鼠</td><td>查尔斯河</td><td>品系编号 022</td><td>有序的怀孕小鼠</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Appendorf</td><td>2231000214</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Chip B 单细胞试剂盒，48 次反应</td><td>10x Genomics</td><td>1000073</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Chromium i7 多重检测试剂盒，96 次反应</td><td>10x Genomics</td><td>120262</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns</td><td>10x Genomics</td><td>1000094</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chromium 单细胞 3' 文库试剂盒 v3</td><td>10x Genomics</td><td>1000095</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chromium 单细胞 3' v3 凝胶珠</td><td>10x Genomics</td><td>2000059</td><td>-80 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Sigma/Millipore</td><td>10103578001</td><td>将粉末在 4℃ 下保存 &amp;deg;C，-20 保存 &amp;deg;溶解后</td></tr><tr><td>胶原酶B</td><td>Sigma/Millipore</td><td>11088807001</td><td>将粉末在 4℃ 保存 &amp;deg;C，-20 保存 &amp;deg;C，待其溶解后</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>安捷伦</td><td>5067-5582</td><td>匹兹堡大学健康科学测序中心</td></tr><tr><td>DNA LoBind 管 微量离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431021</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 管 微量离心管，2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431048</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SILANE</td><td>10x Genomics</td><td>2000048</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C，用于磁珠纯化混合液（表1）</td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，纯品（200度，无水）</td><td>Sigma</td><td>E7023-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 高透明度聚丙烯离心管</td><td>Corning Cellgro</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 高透明度聚丙烯离心管</td><td>Corning Cellgro</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，美国</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Finnpipette F1 多通道移液器，10-100&amp;mu;l</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4661020N</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F1 多通道移液器，1-10&amp;mu;l</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4661000N</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi 细胞筛</td><td>Sigma</td><td>BAH136800040</td><td>孔隙率 40 &amp;mu;m，适用于1000 µL移液器吸头，每包50个</td></tr><tr><td>甘油（丙三醇），50%（v/v）</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，无钙，无镁</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>人源 TruStain FcX（Fc 受体阻断液）</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td>加入 5 &amp;micro;每100万个细胞加入1微升Human TruStain FcX &amp;micro;l 染色体积</td></tr><tr><td>异丙醇（IPA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0295239</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C，用于脂质标记的条形码文库混合物（表1）</td></tr><tr><td>脂质条形码引物（Multi-seq 引物）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>单链DNA</td><td>100 nmol</td></tr><tr><td>低TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，0.1 mM EDTA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>MasterCycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950W</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水（Ambion）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml 8联PCR管</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>不含钙的 1X 磷酸盐缓冲液（PBS） &amp;和镁</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>含10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）（Thermo Fisher 产品的替代品）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0036</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头4件装（0.1&amp;ndash;2.5&amp;mu;L，0.5-10&amp;mu;L, 10&amp;ndash;100&amp;mu;L, 100&amp;ndash;1,000&amp;mu;L 可调体积移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>选择性试剂（SPRIselect 试剂盒）</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318（60 ml）</td><td></td></tr><tr><td>模板转换寡核苷酸</td><td>10x Genomics</td><td>3000228</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C，用于主混合液（表1）</td></tr><tr><td>基于抗体的条形码策略也称为细胞哈希（Cell Hashing）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞浏览器为 Loup Cell Browser</td><td>10x Genomics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>步骤 8.1 中提供的商用分析流程为 Cell Ranger</td><td>10x Genomics</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>基于脂质的条形码策略也称为 MULTI-seq</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>维护良好的 R 平台是 Seurat V3</td><td>萨蒂贾实验室</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://satijalab.org/seurat/&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;https://satijalab.org/seurat/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TipOne RPT 0.1-10/20 μl XL 超低吸附滤芯吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1180-3710</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1000 μl XL 超低吸附滤芯吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1730</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 μl 超低吸附滤芯吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8710</td><td></td></tr><tr><td>TotalSeq-A0301 抗小鼠 Hashtag 1 抗体</td><td>BioLegend</td><td>155801</td><td>0.1 - 1.0 &amp;micro;g 抗体于 100 &amp;micro;每100万个细胞使用1升染色缓冲液</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0302 抗小鼠 Hashtag 2 抗体</td><td>BioLegend</td><td>155803</td><td>0.1 - 1.0 &amp;micro;g 抗体在 100 &amp;micro;每100万个细胞使用l的染色缓冲液</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0302 抗小鼠 Hashtag 3 抗体</td><td>BioLegend</td><td>155805</td><td>0.1 - 1.0 &amp;micro;g 抗体于 100 &amp;micro;每100万个细胞使用l的染色缓冲液</td></tr><tr><td>TrueSeq RPI 引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>单链DNA</td><td>100 nmol，用于脂质标记的条形码文库混合物（表1）</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>通用 I5</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>单链DNA</td><td>100 nmol</td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎细胞多重单细胞mrna测序分析

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

近年来，单细胞mRNA测序技术取得了显著进展，已成为发育生物学领域的重要工具。该技术已成功用于鉴定稀有细胞群体、发现新的标记基因，以及解析发育过程中的时空信息。在过去的两到三年中，单细胞测序方法也已从基于微流控技术的Fluidigm C1平台发展为基于液滴的技术。本文以心脏为例，演示如何利用基于液滴的单细胞RNA测序（scRNA-Seq）方法对小鼠胚胎组织细胞进行分析。此外，我们在工作流程中整合了两种策略，以实现在单次实验中对多个样本进行分析。通过其中一种整合方法，我们同时对来自八个心脏样本的超过9,000个细胞进行了测序分析。这些方法将为发育生物学领域提供一种经济高效的技术途径，可用于同时分析来自不同遗传背景、不同发育阶段或不同解剖位置的单细胞。

本研究以小鼠胚胎心脏为例，展示如何通过多重单细胞 mRNA 测序技术，同时处理来自器官不同部位的多个样本。分离 E18.5 CD1 小鼠心脏，并将其解剖为左心房（LA）、右心房（RA）、左心室（LV）和右心室（RV）。随后，使用基于脂质的条形码标记方法对心房和心室细胞分别进行独立标记，并在生成 GEM（凝胶珠微滴）和逆转录前混合。实验流程示意图见图 1。我们在文库构建前对 cDNA 浓度进行了定量分析（图 2A）。多重单细胞 RNA 测序（scRNA-Seq）与标准 scRNA-Seq 的一个关键区别在于，内源性 cDNA 文库和样本条形码 cDNA 文库在 cDNA 扩增与纯化后需分别获得（步骤 4.2.1 和 4.2.2.2）。在本实验中，这两个文库均进行了质量验证（图 2B,C）。文库构建与质控完成后，进行高通量测序及数据分析。
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本文介绍了一种多重化的单细胞mRNA测序方法，用于分析小鼠胚胎组织中的基因表达。基于微滴的单细胞mRNA测序（scRNA-Seq）方法结合多重化策略，可同时对来自多个样本的单细胞进行分析，显著降低了试剂成本，并最大限度地减少了实验批次效应。

小鼠胚胎细胞多重单细胞mRNA测序分析

单细胞mRNA测序在近几年取得了显著进展，已成为发育生物学领域的重要工具……

单细胞mRNA测序被广泛用于在单细胞水平上理解生物学过程。多重测序策略的出现进一步拓展了其应用，使得在单次实验中可对多个样本进行分析，显著降低了成本并避免了批次效应。本实验操作将由本实验室的博士后魏 Feng和技师Andrew Przysinda进行演示。计数后，将从胚胎第18.5天的心室中分离的细胞分成每份5 × 10⁵个细胞的等分试样，每份用新鲜PBS洗涤两次。每份样品将细胞沉淀重悬于180 µL PBS中，并向每管中加入20 µL锚定条形码储备液，轻轻混匀。冰上孵育5分钟后，再向每管中加入20 µL共锚定条形码储备液，轻轻混匀，继续冰上孵育5分钟。随后用1 mL含1%牛血清白蛋白的冷PBS洗涤细胞三次，每次洗涤后通过每管一个40 µm细胞滤筛将样品滤入新管中。计数后，将芯片 B 安装到芯片架中，然后向第一行未使用的孔中加入 75 微升 50% 甘油溶液，向第二行未使用的孔中加入 40 微升，向第三行未使用的孔中加入 280 微升。请注意，此处使用训练芯片以演示操作流程。将适量的细胞悬液和无核酸酶水通过轻柔吹打加入主混合液中。将75微升所得细胞溶液缓慢加入第一行样品孔底部中央，避免产生气泡。在加入凝胶珠前，先将凝胶珠涡旋振荡30秒，然后缓慢将40微升凝胶珠加入第二行凝胶珠孔底部中央，避免产生气泡。沿第三行分隔油孔的孔壁加入280微升分隔油。将垫圈安装到芯片上时，不要按压垫圈，并保持垫圈水平，以避免润湿垫圈。将带有垫圈的组装芯片载入 Chromium 控制器中，运行 Chromium Single Cell B 程序。注意：屏幕会显示“Chromium Training”（用于训练芯片），但在实际实验中，屏幕将显示“Chromium Single Cell B”。程序运行完成后，立即取出芯片并丢弃垫圈。将盖子向后折叠，以45度角露出孔板，检查液体水平，确保无堵塞。从回收孔的最低点缓慢吸取100 µL乳状凝胶微珠，并检查微珠的均匀性。将乳化后的微珠沿置于冰上的新PCR管管壁加入，然后将管子放入热循环仪中进行逆转录。为准备扩增cDNA，在室温下向样品中加入125微升回收试剂。不应观察到不透明液体，避免移液或涡旋。等待60秒后，从管底缓慢移除回收试剂，并向样品中加入200微升涡旋珠纯化混合液。用移液器将混合物吹打10次，然后在室温下孵育10分钟。接着，将样品置于磁力架的高位。待溶液澄清后，吸除上清液，并向沉淀中加入200微升80%乙醇。30 秒后，去除乙醇，并重复洗涤两次。最后一次洗涤后，短暂离心样品，将离心管置于磁力架的低位位置，使样品晾干，时间少于两分钟。样品干燥后，将离心管从磁力架上取下，加入 35.5 µL 新鲜配制的洗脱液。室温孵育两分钟后，将样品置于磁力架的高位，直至溶液澄清，随后将35微升样品转移至新的管条中。使用基于脂质的条形码策略进行cDNA扩增时，向35微升cDNA样品中加入扩增反应混合液，充分混匀后短暂离心。离心结束后，将样品放入热循环仪中，按照相应的cDNA扩增程序进行孵育。向100微升样品中加入120微升选择性试剂和100微升超纯水，用移液器将所得的0.6倍浓度选择性试剂吹打混合15次。室温孵育5分钟后，将样品置于磁力架上直至溶液变澄清。将上清液转移至1.5毫升低吸附离心管中，用于构建多重编码的条形码cDNA文库。请务必同时保存上清液和底物，因为上清液中含有带条形码的 cDNA，而底物中含有内源性 cDNA。用 80% 乙醇纯化内源性 cDNA，并用 40 µL 洗脱缓冲液洗脱 DNA，然后在构建内源性转录本文库之前进行内源性 cDNA 的质量控制检测。在文库构建之前，应对 cDNA 的浓度进行定量和质量评估。构建的文库（包括内源性 cDNA 文库和条形码文库）在测序前也应进行定量和质量评估。测序后，可分析每个单细胞中的条形码表达情况。例如，在本分析中，观察到八组单细胞，每组唯一表达一种条形码，代表来自八个不同样本的细胞。此外，部分细胞未表达任何条形码，因此被定义为阴性细胞，而另一些细胞则表达了两种不同的条形码，代表双细胞（doublets）。利用单细胞（singlet cells），可通过细胞类型注释、新及稀有细胞类型的鉴定、解剖区域比较分析以及基因本体通路分析（如细胞周期各阶段的分离）来评估细胞异质性和分子调控机制。如果条件允许，建议对乳液中的凝胶微珠进行成像，因为图像能够直观地显示至此步骤的实验是否成功。样本多重化技术为设计实验提供了极大的灵活性。在观看完本演示后，希望您将更有信心开展自己的实验研究。

multiplexed-single-cell-mrna-sequencing-analysis-mouse-embryonic

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

小鼠胚胎细胞的多路复用单细胞mRNA测序分析

本文介绍了一种优化的多重逆转录定量PCR（qRT-PCR）方案，结合微流控平台，作为检测microRNA（miRNA）表达水平的高通量筛选工具，具有成本低、耗时短的优点，尤其适用于样本量有限的情况。...

高通量 microRNA 表达谱分析：在 Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs 上进行纳升级优化多重 qRT-PCR

单细胞表达谱分析可对单个细胞进行详细的基因表达分析。我们描述了心肌细胞的分离方法，以及对所得裂解液进行全转录组微阵列分析或特定靶标qPCR检测的制备步骤。...

成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱分析

本方案介绍了一种进行定量、单细胞分析的方法 原位...

小鼠植入前胚胎谱系特化过程中蛋白质表达的定量分析

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从上胚层到原肠胚形成结束：突变小鼠全胚胎的单细胞RNA测序

本方案结合流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征出生后早期小鼠脑小脑中的小胶质细胞状态。该方法通过酶解消化、Percoll离心及免疫染色，揭示小胶质细胞的异质性，从而加深对其在小脑发育与疾病中作用的理解。...

流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

本方案提供了一条简化的计算流程，用于定量新生增强子转录本。通过整合染色质可及性、染色质特征和转录数据，该方法能够在复杂的基因内区域实现对增强子活性的准确检测和链特异性分析，同时适用于不具备深入生物信息学训练背景的研究人员。...

小鼠胚胎干细胞中基因间/基因内增强子RNA定量的计算分析流程

导致先天性心脏缺陷的突变需要在发育过程中对心脏结构进行体内研究，但在小鼠胚胎心脏中开展高分辨率的结构研究在技术上具有挑战性。本文介绍了一种可靠的免疫荧光与图像分析方法，用于评估发育中小鼠心脏中心肌细胞特异性结构。...

小鼠胚胎心脏中心肌细胞发育的免疫荧光分析

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus129 × Mus...

利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

了解基于液滴的多路复用小鼠胚胎单细胞mRNA测序方法，用于分析基因表达并降低实验成本。该技术可同时处理多个样本，有效减少批次效应，为发育生物学研究提供高质量数据支持。

小鼠胚胎细胞多重单细胞mRNA测序分析

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