实体瘤细胞系中侧群细胞的分析

侧群细胞分析是用于从肿瘤组织和肿瘤细胞系中分离和鉴定肿瘤干细胞的常用方法之一。该检测方法简便、快速且成本较低。该方法有助于更好地理解基因或其他细胞外和细胞内信号对肿瘤细胞干性特征的影响。

多种因素均可影响本分析中SP细胞的比例，因此在正式实验前必须探索合适的实验条件。将肿瘤细胞接种于六孔板中，在37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育。当细胞密度达到约90%时，吸除培养基，并用3毫升PBS洗涤细胞两次。

然后，向每孔加入 500 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，将培养板置于 37°C 培养 1 至 3 分钟。轻轻敲击培养板使细胞脱落，每孔加入 3 mL 含 2% FBS 的 PBS，并用移液器将细胞上下吹打 3 至 5 次以分散细胞团块。在显微镜下观察细胞悬液。

若存在细胞团块，需将悬液通过70微米细胞筛。将细胞转移至15毫升离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于3毫升含2% FBS的PBS中，上下吹打3至5次以混匀。

使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞，并用添加了2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液将细胞稀释至终浓度为每毫升1×10⁶个细胞。准备两个5毫升的聚苯乙烯圆底试管，每管加入1毫升细胞悬液。将其中一管标记为实验管，另一管标记为阻断对照管。

通过将阻断剂稀释至适当浓度来配制阻断液。将其加入阻断剂对照管中并充分混匀，然后在37°C下孵育30分钟。每10分钟振荡一次试管。

通过将Hoechst 33342稀释至适当浓度来制备溶液。分别将其加入测试管和阻断剂对照管中，充分混匀，然后在37°C下孵育60分钟。每10分钟振荡一次试管。

孵育结束后，将细胞在 200 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，然后小心吸除上清液。每管中加入 1 mL 冰冷的含 2% FBS 的 PBS 重悬细胞，用移液器吹打混匀。每管加入 1 µL 浓度为 1 mg/mL 的碘化丙啶（propidium iodide, PI），混匀。

在流式细胞仪软件中点击“参数”选项卡。首先，分别选择FSC、SSC、Hoechst Blue、Hoechst Red和PI的参数。其次，为PI参数选择对数刻度。

最后，分别为FSC、SSC、Hoechst Blue、Hoechst Red和PI参数选择面积和宽度标度。首先运行测试管中的细胞，然后在相同电压和门控条件下运行阻断剂对照管中的细胞。从每个样本中收集20,000至100,000个事件，以分析SP细胞的百分比。

该方法用于检测人乳腺癌MDA-MB-231细胞系中SP细胞的比例。FSC-A与PI-A的散点图显示了死亡细胞、细胞碎片以及主要的PI阴性细胞群，其中PI阴性细胞群被用于进一步分析。通过FSC-A与FSC-W散点图以及SSC-A与SSC-W散点图圈选单细胞群体，用于分析SP细胞的比例，在未处理细胞中约为0.9%，在利血平处理的细胞中约为0.09%。

对 MDA-MB-435 细胞测试了不同浓度的 Hoechst 33342 染色，确定每毫升 2 微克为侧群细胞（SP）分析的最佳浓度。浓度过低时，难以将侧群细胞与其他细胞群体区分开；而浓度过高则会导致侧群细胞消失。通过测试维拉帕米和利血平，以确定适用于 MDA-MB-435 细胞的合适抑制剂。

经维拉帕米处理后，约有0.4%的细胞排出染料，而经利血平处理后该比例降至约0.1%，表明利血平是该细胞系更合适的阻断剂。该方案还用于测定经STAT3激活剂colivelin处理的A549人肺腺癌细胞以及经FRA1抑制剂SKLB816处理的T47D人乳腺癌细胞中SP细胞的比例。该检测为信号通路对肿瘤干细胞特性的调控作用提供了线索，并有助于发现新的作用机制，最终可为肿瘤的靶向治疗提供指导。