Name: 毛里岛皮下白脂肪组织（ISWAT）移植模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 了解小鼠胰岛分离与腹股沟皮下白色脂肪组织移植技术，用于评估血糖监测和组织学分析。该方法为I型糖尿病治疗提供潜在临床应用价值。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了国家重点研发计划项目&amp;中国国家重点研发计划（2017YFC1103704）、广东省高水平医院建设专项资金（2019）、深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201412020）、深圳市高水平医学重点学科建设项目资助基金（2016031638）、深圳市科技计划项目（JCJY20160229204849975，GJHZ20170314171357556）、深圳市卫生和计划生育委员会科研项目（SZXJ2017021，SZXJ2018059）、广东省医学科研基金（A2019218）、中国博士后科学基金（2018M633218）

本方案中的所有操作均遵循深圳市第二人民医院伦理审查委员会的动物福利原则。胰岛移植受体和供体为8至10周龄的雄性C57BL/6小鼠，购自广东省医学动物中心。收获、分离、培养或接种收获细胞的操作均在无菌条件下进行。
1. 胰岛制备
<ol>
	<li>配制V型胶原酶工作液。称取V型胶原酶，用D-Hank's缓冲液溶解至终浓度为1 mg/mL，使用0.22 μm针筒式滤器和60 mL针筒过滤，冰上预冷。每位供体受者需要5 mL。</li>
	<li>通过颈椎脱位法处死一只10周龄雄性C57BL/6小鼠（23 ± 2 g），并用75%乙醇喷洒小鼠体表数秒。同时，用5 mL注射器吸取胶原酶溶液，并将注射器针头更换为弯头钝端灌注针头（32 G）。</li>
	<li>将供体小鼠仰卧置于解剖显微镜下的冰袋上，使用直头眼科剪在耻骨区域皮肤做一横向切口，并向头部方向完全切开皮肤。随后，从耻骨区至剑突行V形切口，完全打开腹腔。</li>
	<li>将肝脏重新定位，暴露胆囊及胆总管全长。随后用血管夹夹闭胆总管的十二指肠开口，并在胆囊上切开一个小口。 
	注意：最佳的针头放置位置对于防止液体反流至肝脏和胆囊至关重要。</li>
	<li>从胆囊开口处使用1.2步骤中的灌注针插管胆总管，然后向胰腺注入约2 mL胶原酶溶液。随后，使用两把无创显微镊子将灌注后的胰腺与肠道、胃和脾脏分离，并将其放入预冷的50 mL锥形管中置于冰上。 
	注意：对所有供体小鼠重复此过程。可将三只连续灌注的胰腺（间隔不超过40分钟）合并至一个50 mL锥形管中，每只胰腺预先加入3 mL胶原酶溶液。</li>
	<li>每胰腺加入 100 μL DNase I（10 mg/mL）至 50 mL 锥形管中，在 37 °C 水浴中振荡消化 3–5 分钟。 
	注意：在水浴消化前，需在10秒间隔内剧烈振荡试管40次以解离组织，消化过程中则适度振荡试管。</li>
	<li>加入终止液（2.5 mg/mL BSA-HBSS 溶液）至终体积为 50 mL，以阻断消化反应，并短暂离心试管至 750 x g 在 4 °C 下迅速停止。</li>
	<li>弃去上清液，用15–25 mL BSA-HBSS轻轻重悬沉淀，洗涤2次。按照步骤1.7所述相同转速条件，短暂离心1分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将三个锥形管中的沉淀合并至一个50 mL锥形管中。用总体积10 mL的Histopaque-1119重悬沉淀，混匀后，沿管壁缓慢依次加入5 mL Histopaque-1077和5 mL HBSS。</li>
	<li>在离心机中以 750 x g 4 °C 下离心 10 分钟，不启用刹车。</li>
	<li>使用一次性5 mL巴斯德吸管，将HBSS/Histopaque-1077界面的胰岛吸出至50 mL锥形管中，加入BSA-HBSS至终体积50 mL，短暂离心（750 × g） g 在 4 °C 下。</li>
	<li>弃去上清液，用30 mL BSA-HBSS洗涤胰岛。750 x g离心1分钟 g 在 4 °C 下。</li>
	<li>使用30 mL培养基（10% FBS-1% P/S-CMRL-1066）重悬各管中的胰岛，并转移至直径10 cm的避光培养皿中。在体视显微镜下，利用200 μL加样枪头根据胰岛形态（即球形、白色）从溶液中手工挑选胰岛，放入含10 mL培养基的未处理细胞培养皿中。 
	注意：如果初次纯化的胰岛纯度不理想，可在初次挑选后进行第二次手工挑选。</li>
	<li>通过光学显微镜下二苯硫腙染色检测手工挑选的胰岛纯度，并通过荧光显微镜下荧光素二乙酸酯（FDA）-碘化丙啶（PI）染色检测胰岛活力。</li>
	<li>将分离的胰岛在培养箱中用培养基（同步骤1.13）于37 °C、95%空气-5% CO₂条件下培养2 移植前</li>
</ol>
2. ISWAT 胰岛移植
<ol>
	<li>通过单次注射链脲佐菌素（STZ）在8周龄雄性C57BL/6小鼠（22 ± 2 g）中诱导糖尿病。在第-4天，禁食小鼠约4–6小时，然后使用0.1 M柠檬酸缓冲液（pH 4.4）配制2% STZ溶液。称重后重悬于缓冲液中，并以180 mg/kg剂量进行腹腔注射。 
	注意：STZ溶液需在使用前新鲜配制，并用铝箔包裹以避光。应立即使用，因其在15–20分钟内会失活。</li>
	<li>在第-1天和第0天上午约10点，穿刺STZ注射后的小鼠尾静脉采集少量血液，使用试纸和基础血糖监测仪测量非空腹血糖水平。若连续两天检测的血糖水平均不低于20 mmol/L，则将该小鼠用作胰岛移植受体。</li>
	<li>在第0天，称重并标记所有受体小鼠。通过腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥钠对每只受体小鼠进行麻醉。 
	注意：通过夹趾测试检查麻醉深度。若受体小鼠无缩足反射，则表明麻醉深度足够进行手术；否则追加10 mg/kg戊巴比妥钠。所用戊巴比妥钠以无菌生理盐水稀释至2%（m/v）浓度。</li>
	<li>从-20 °C冰箱中取出水凝胶，置于冰上使其缓慢融化。水凝胶在4–10 °C时呈液态，在较高温度下会固化。</li>
	<li>在体视显微镜下（如步骤1.13所述），将每只受体所需的约450–500个胰岛当量（IEQ）转移至无菌1.5 mL离心管中，加入200 µL培养基，并置于冰上直至准备移植。</li>
	<li>使用75%乙醇擦拭受体小鼠左侧腹股沟区域。将小鼠仰卧位固定于手术台上，用手术胶带固定四肢。使用电动剃毛器剃除手术区域周围毛发，并用碘伏擦拭消毒。</li>
	<li>使用眼科剪和无创微型镊在此区域做垂直皮肤切口，识别ISWAT中的下腹壁动静脉，并在血管上方创建一个小囊腔。</li>
	<li>将含胰岛的离心管在200 x g条件下离心30秒，尽可能吸除上清液。吸取20 µL完全融化的水凝胶加入含胰岛的管中。轻柔重悬胰岛，避免产生气泡。</li>
	<li>使用200 µL移液枪头将管中全部胰岛-水凝胶混合物注入受体小鼠的囊腔（步骤2.7）中。 
	注意：此过程需两名技术人员协作，一人用无创微型镊提起囊腔边缘，另一人将胰岛混合物注入囊腔。</li>
	<li>待胰岛-水凝胶混合物完全固化后，在移植部位加入20 µL头孢菌素（约5–10 mg），然后使用5-0外科缝线采用连续缝合法关闭肌肉层和皮肤。 
	注意：由于体温作用，水凝胶约需3分钟完成固化。</li>
	<li>将受体小鼠放入清洁笼中，并使用加热垫保温。持续监测直至小鼠完全恢复并开始自主活动。随后根据0.1 mg/kg剂量，腹腔注射0.03 mg/mL布托啡诺与无菌生理盐水混合液。</li>
	<li>对每只受体小鼠重复执行步骤2.3–2.11。</li>
	<li>在移植后第一个月内每周测量3–4次受体小鼠的非空腹血糖水平，之后每周测量1次（测量方法同步骤2.2）。</li>
	<li>随访结束时（移植后第100天），在麻醉状态下（操作同步骤2.3），按照步骤2.6所述无菌操作流程，切除携带移植物的ISWAT组织。根据苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色及胰岛素和胰高血糖素免疫荧光的组织学方案，用福尔马林和多聚甲醛固定组织。</li>
	<li>按照步骤2.10在受体小鼠上给予头孢菌素并缝合切口，然后按步骤2.11进行术后恢复处理。</li>
</ol>

<ol><li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDF+Diabetes+Atlas%3A+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823(2012).</li>
<li>Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapies+for+Type+1+Diabetes%3A+Current+Scenario+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine+Insights%3A+Endocrinology+and+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521(2019).</li>
<li>Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202(2018).</li>
<li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li>
<li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li>
<li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li>
<li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+islet+transplantation%3A+is+the+future+finally+now%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients%2C+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li>
<li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%3A+recent+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrome+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li>
<li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation%3F+Review+article%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li>
<li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li>
<li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li>
<li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation%3A+alternative+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li>
<li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160(2019).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374(2014).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096(2011).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

&#160; &#160;

胰岛移植是一种治疗1型糖尿病（T1DM）的有前景的疗法。该疗法的效果受多种因素影响，选择最佳的胰岛植入部位至关重要。理想的胰岛移植解剖部位应具备以下特征：便于进行简单的移植、活检和移植物取出操作；并发症较少；血糖控制成功率高；以及胰岛移植物的长期存活15,16。
我们团队此前描述了一种在小鼠模型中将胰岛移植至大网膜的实验方案17。与肾包膜下胰岛移植相比，大网膜移植后达到正常血糖水平所需时间较晚。因此，研究人员探索了其他可用于胰岛植入的部位。
已有研究报道，与肝脏移植相比，胰岛移植至腹股沟白色脂肪组织（ISWAT）所需胰岛数量更少即可逆转受体的高血糖状态，因此ISWAT可作为肝脏以外的替代移植位点14。此外，ISWAT位点易于进行胰岛移植操作，也便于移植物的观察和回收14...

根据国际糖尿病联合会（IDF）的统计数据，全球1型糖尿病（T1DM）的发病率和患病率正在迅速上升1。胰岛移植是治疗T1DM最有前景的方法之一4。自采用埃德蒙顿方案在临床胰岛移植方面取得重大突破以来2，目前T1DM受者在移植后5年仍保持功能的胰岛移植物存活率已达到约50%3。
过去，研究人员已探索了多种用于实验性胰岛移植的移植部位，包括肝脏、肾包膜、脾脏、肌肉内区域、皮下空间、骨髓以及大网膜囊5,6,7。上述部分部位已在临床环境中进行过测试8。尽管目前将胰岛移植至肝脏仍是临床应用中最广泛使用的方法9，但该部位仍存在若干亟待解决的重要问题。例如，如何减少移植胰岛因即时血液介导的炎症反应（IBMIR）和供氧不足所导致的早期丢失10,11，以及在必要时如何回收胰岛移植物，因为它们在肝脏中呈弥散性分布。肾包膜可能是啮齿类受体的理想移植部位，但人类肾包膜空间有限，限制了足量同种异体胰岛的移植；尽管如此，由于临床上使用的猪胰岛制备物纯度较高，该部位可能更适用于胰岛异种移植5,12。因此，寻找更合适的胰岛移植部位仍在持续研究中。
由于皮下空间易于获取，可作为胰岛移植的临床适用部位。然而，将胰岛移植至皮下空间的效率极低，因此需要相对大量的胰岛才能逆转高血糖13。最近，一个日本研究团队在小鼠模型中发现ISWAT是一种优于肝脏的新型皮下移植部位14。ISWAT含有腹壁上动脉和静脉，丰富的血液供应可能有助于胰岛移植物的血管重建。在本文中，我们提出一种简便的植入方法，利用基底膜基质水凝胶将同基因型小鼠胰岛固定于ISWAT中。该方案已被证实对胰岛移植有效。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m 注射器驱动滤器单元</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 帕斯特移液管</td><td>JingAn Biological, 中国</td><td>J00085</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Szboon, 中国</td><td>20170829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>5-0 外科缝合线</td><td>sh-Jinhuan, 中国</td><td>CR537</td><td></td></tr><tr><td>60 mL 注射器</td><td>Szboon, 中国</td><td>20170623</td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td>LIRCON, 中国</td><td>9180527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG(H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>稀释比例 (1:200)</td></tr><tr><td>抗小鼠胰高血糖素抗体</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>稀释比例 (1:100)</td></tr><tr><td>抗小鼠胰岛素抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3014s</td><td>稀释比例 (1:100)</td></tr><tr><td>钝头灌注针</td><td>Oloey, 中国</td><td>005</td><td>32G，黄色</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Meilune, 中国</td><td>MB4219</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>广东省医学实验动物中心</td><td></td><td>8~10 周龄</td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>BIOFIL, 中国</td><td>TCD000100</td><td>普通，未处理，直径 87.8 mm</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>头孢菌素</td><td>Lukang medical, 中国</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0422</td><td></td></tr><tr><td>Codos 宠物电推剪</td><td>Szcodos, 中国</td><td>CP-8000</td><td></td></tr><tr><td>V 型胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-Hank's 缓冲液</td><td>Coolaber, 中国</td><td>PM5140-10</td><td></td></tr><tr><td>二苯硫腙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>伊红染色液</td><td>Beyotime Biotech, 中国</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>荧光素二乙酸酯 (FDA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>加样枪头</td><td>Corning</td><td>CLS4884</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Coolaber, 中国</td><td>PM5150-10</td><td></td></tr><tr><td>苏木精染色液</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0522</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0536</td><td></td></tr><tr><td>水凝胶</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>碘伏</td><td>LIRCON, 中国</td><td>5190313</td><td></td></tr><tr><td>避光培养皿</td><td>DVS, 中国</td><td>AN-5058548</td><td>自制，玻璃皿喷涂黑色油漆</td></tr><tr><td>医用胶带</td><td>Cofoe, 中国</td><td>K12001</td><td></td></tr><tr><td>非侵入性微型镊子</td><td>RWD Life Science</td><td>F11033-11 和 F12016-15</td><td></td></tr><tr><td>One Touch ultraeasy Basic 血糖监测系统</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>33391713</td><td></td></tr><tr><td>眼科剪刀</td><td>RWD Life Science</td><td>S12012-12 和 S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>P/S (青霉素/链霉素)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>STZ (链脲佐菌素)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>试纸条</td><td>GenUltimate</td><td>100-50</td><td></td></tr><tr><td>TRITC 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)</td><td>proteintech</td><td>SA00007-2</td><td>稀释比例 (1:200)</td></tr><tr><td>血管夹</td><td>RWD Life Science</td><td>R31006-04</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胰岛的腹股沟皮下白色脂肪组织（iswat）移植模型

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

胰岛移植是治疗1型糖尿病的一种成熟疗法。在啮齿类动物模型中，肾包膜是最常用的胰岛移植部位。然而，紧密的肾包膜限制了在大型动物和人体中移植足够数量胰岛的能力。腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）是一种新型皮下空间，被发现是胰岛移植的潜在理想部位。该部位比其他皮下区域具有更丰富的血液供应。此外，ISWAT可容纳比肾包膜更大的胰岛质量，且移植操作简便。本文描述了在同基因型糖尿病小鼠受体中进行小鼠胰岛分离及ISWAT部位移植的操作流程。根据本方案，采用标准的胶原酶消化法分离小鼠胰岛，并使用基底膜基质水凝胶将纯化的胰岛固定于ISWAT部位。对受体小鼠的血糖水平监测超过100天。移植后第100天取出胰岛移植物进行组织学分析。本文所述的ISWAT部位胰岛移植方案简便且有效。

本方案介绍了两种操作：小鼠胰岛的制备以及将胰岛移植至ISWAT位点。在第一种操作中，通过V型胶原酶溶液灌注和消化后，使用Histopaque-1119和Histopaque-1077进行纯化，并辅以手工挑选步骤，所分离的小鼠胰岛纯度足以用于移植（如图1所示），且具有高活力的分离胰岛将被用于移植（如图2所示）。在第二种操作中，使用STZ化学试剂诱导糖尿病至关重要。STZ的最佳剂量取决于小鼠品系和年龄，糖尿病成功诱导的标准为连续两天在同一时间测得的非空腹血糖水平均超过16.7 mmol/L。糖尿病小鼠在未接受胰岛移植的情况下可存活数周。胰岛移植物在移植至ISWAT位点前应与水凝胶充分混合，移植后需等待数分钟以使移植物在IWSAT中固定（图3）。当移植至ISWAT位点后，胰岛移植物可在约一个月内逆转高血糖状态，受体小鼠的体重也逐渐增加（图4）。移植后第100天，取出胰岛移植物进行组织学分析（<strong ...

本方案描述了一种小鼠胰岛分离及将其移植至腹股沟皮下白色脂肪组织的方法。将分离的同系小鼠胰岛利用基底膜水凝胶移植到小鼠受体体内。监测受体的血糖水平，并对胰岛移植物进行组织学分析。

小鼠胰岛的腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）移植模型

胰岛移植是治疗1型糖尿病的一种成熟疗法。肾包膜是最常用的移植部位……

胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病最有前景的方法之一。目前，人们仍在不断探索适合胰岛移植的解剖部位。将胰岛移植至腹股沟皮下白色脂肪组织是一种简单且有效的方法，可能具有临床应用价值。将该方法推广至临床，可能为Ⅰ型糖尿病患者带来治愈的希望。该方法可为临床胰岛移植提供参考，因为舌下部位已被证实并非胰岛移植的理想位点。操作过程中每一步骤都需严格遵循，尤其是胰腺消化等关键步骤。直观演示将有助于刚接触该技术的研究人员更好地掌握胰岛分离和转分化操作。进行胰岛收获时，首先用75%乙醇喷洒一只10周龄C57黑六小鼠的皮毛，并用新鲜配制的胶原酶溶液填充一支5毫升注射器。在注射器上安装一根32号弯头钝端灌注针，将小鼠仰卧位放置于冰袋上。使用直头眼科剪在动物耻骨区域的皮肤上做一横向切口，并将切口向前（头部方向）延伸。从耻骨区至剑突处行V形切口完全打开腹腔，移动肝脏以暴露胆囊及胆总管全长。然后用血管夹闭合胆总管在十二指肠的开口，并在胆囊上剪开一个小口。通过开口处用先前准备好的灌注针插管胆总管，并向胰腺注入约2毫升胶原酶溶液。当全部胶原酶注入完成后，使用两对无创显微镊子将灌注后的胰腺与肠道、胃和脾脏分离，并将胰腺放入置于冰上的50毫升锥形管中。当所有样本收集完毕后，向每管胰腺样本中加入100微升DNase I，剧烈振荡每根试管约40次，持续10秒，随后将组织置于37°C水浴中，温和振荡孵育3至5分钟。孵育结束后，加入终止液至终体积达 50 毫升，以终止消化反应。随后将离心管在 4 摄氏度下以 750 × g 短暂离心，然后迅速停止离心。弃去上清液后，在相同离心条件下，每次使用 15 至 25 毫升终止液洗涤沉淀物，共洗涤两次。第二次洗涤后，将每管三个沉淀合并至新的50毫升锥形管中。用总体积为10毫升的Histopaque 1119重悬胰腺细胞。随后，沿每管管壁小心加入5毫升Histopaque 1077，接着加入5毫升HBSS。通过离心分离细胞，并使用5毫升巴斯德吸管从HBSS-Histopaque 1077界面收集胰岛。将胰岛汇集至一个新的50毫升锥形管中，最终体积为50毫升停止液，进行脉冲离心后弃去上清液。将沉淀物重悬于30毫升新鲜停止液中，离心1分钟，然后将胰岛重悬于30毫升培养基中。将胰岛每管转移至一个10厘米避光培养皿中，并将培养皿置于体视显微镜下。使用200微升凝胶加样枪头，从溶液中手工挑选白色球形胰岛。将胰岛收获后立即放入含有10毫升培养基的未经处理的细胞培养皿中。通过光学显微镜下使用二嗪染色法检测手工挑选胰岛的纯度。并通过荧光显微镜下使用荧光素二乙酸酯-碘化丙啶染色法检测胰岛的活力。随后将分离的胰岛置于新鲜培养基中，在37摄氏度、95%空气和5%二氧化碳条件下培养，直至移植。在糖尿病诱导后的第三天和第四天开始，于每天上午10:00左右，穿刺每只注射链脲佐菌素的8周龄雄性C57黑六小鼠的尾静脉，采集每只受体动物的血液样本。使用基本的血糖监测仪器测定每只小鼠的非空腹血糖水平，然后将血液加入各自的检测试纸。当某只动物连续两天的血糖水平达到至少20毫摩尔每升时，称重并标记受体小鼠，并确认麻醉动物对足底反射无反应。将一份保存在负20摄氏度的水凝胶置于冰上解冻。将每个受体450至500个胰岛当量转移至预冷的无菌1.5毫升离心管中，每管含200 µL培养基，并置于冰上。用75%乙醇擦拭受体小鼠左侧腹股沟区域，并将小鼠置于仰卧位。用手术胶带固定四肢，并使用毛发剪去除手术区域周围的毛发。用碘伏擦拭手术区域，并在已消毒的皮肤上做垂直切口。在ISWAT内辨认腹下腹壁浅动静脉，并在血管上方创建一个小囊袋。通过离心沉淀胰岛细胞，并尽可能去除上清液。向每支试管中加入 20 µL 解冻的水凝胶，并轻轻重悬胰岛，注意避免产生气泡。当获得均匀悬浮液后，使用 200 µL 移液枪头小心地将一支试管中的全部胰岛-水凝胶混合物转移至移植袋中。待水凝胶完全固化后，向移植部位加入 20 µL 头孢菌素，并用 5-0 连续外科缝线缝合肌肉层和皮肤。然后将受体放入一个干净的笼子中，并置于加热垫上，持续监测直至完全恢复卧位。按照上述方法完成小鼠胰岛处理后，所分离的小鼠胰岛将具有足够的纯度用于移植。仅应使用存活率高的分离胰岛进行移植。将胰岛移植物与水凝胶充分混合后，可将其植入ISWAT部位。移植到ISWAT部位约一个月后，胰岛移植物可逆转高血糖，同时受体小鼠的体重逐渐增加。移植后第100天，移除移植物会导致上午10:00血糖水平立即升高。非空腹血糖水平。在此时间点进行的组织学分析显示，胰岛移植物仍保持完整。胰岛素和胰高血糖素免疫荧光染色结果表明，移植的胰岛在移植后100天仍具有功能。注意不要过于剧烈地振荡大量胰腺细胞，否则所获得胰岛的功能将受到影响。分离的胰岛可作为对照移植至肾包膜下，以与移植至腹股沟皮下白色脂肪组织部位的效果进行比较。该操作将推动除肝脏以外其他部位开展胰岛移植临床试验的启动。

inguinal-subcutaneous-white-adipose-tissue-iswat-transplantation

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

毛里岛皮下白脂肪组织（ISWAT）移植模型

已提出移植分离的胰岛可能成为治疗1型糖尿病的一种潜在方法。本文介绍一种从小鼠胰腺中分离胰岛并将其移植至肾包膜下空间的方法。...

小鼠胰岛分离与肾包膜下移植方法

本方案演示了小鼠胰岛的分离及其在脱细胞支架上的接种。将支架支持的胰岛移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中。胰岛在移植部位存活，并逆转了高血糖状态。...

支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

目前，白色脂肪组织（WAT）的主要原代培养模型存在关键缺陷，阻碍了药物开发和代谢研究的进展。本文介绍了一种通过将WAT夹在间充质细胞层之间来构建脂肪组织微生理系统的方法。该结构为WAT的原代培养提供了一个稳定且可调节的平台。...

一种用于人体脂肪的微生理平台：夹心式白色脂肪组织

本文介绍了一种移植方法，可将供体大鼠乳腺上皮细胞移植至受体动物的肩胛间白色脂肪垫中。该方法可用于研究宿主和/或供体对乳腺上皮发育的影响，且无需预先清除内源细胞，从而扩展了该技术的应用范围。...

大鼠乳腺上皮细胞移植至肩胛间白色脂肪垫

这种脂肪包裹的胰岛移植方法适用于检测腹膜腔内植入的胰岛。值得注意的是，该方法无需使用生物结合剂或缝合。...

利用附睾白色脂肪组织进行脂肪包裹的胰岛移植

利用微型PET/MR成像方法对小鼠产热性脂肪组织库进行功能成像与定量分析。...

使用[18F]FDG微正电子发射断层扫描/磁共振成像对小鼠棕色和米色脂肪组织进行可视化与定量分析

本方案介绍了在脂肪细胞中使用CRISPR SunTag-p65-HSF1（AdipoSPH）作为研究米色脂肪生物学的一种替代腺相关病毒（AAV）的策略。 在体 注射携带靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA 的 AAV...

利用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学与代谢

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

本文介绍了一种白色和棕色脂肪组织移植方案，该方案为逆转糖尿病和肥胖型BTBR小鼠的生育力低下、肥胖和高血糖，并改善其肾功能提供了有前景的策略。...

白色与棕色脂肪移植：纠正黑褐色布拉基尿（BTBR）肥胖小鼠生殖、代谢及肾脏功能缺陷的一种方法

通过将子宫组织自体移植至肠系膜动脉级联，对小鼠和大鼠进行子宫内膜异位症手术诱导的描述。...

通过子宫组织自体移植建立手术诱导型子宫内膜异位症小鼠模型

了解小鼠胰岛分离与腹股沟皮下白色脂肪组织移植技术，用于评估血糖监测和组织学分析。该方法为I型糖尿病治疗提供潜在临床应用价值。

小鼠胰岛的腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）移植模型

探索更多视频