同时分离原代星形胶质细胞和小胶质细胞用于原生动物寄生虫感染研究

本方案描述了一种并行提取出生后小鼠中两种最丰富的胶质细胞群体——星形胶质细胞和小胶质细胞的方法。我们的方法与以往报道的星形胶质细胞和小胶质细胞分离方案不同，重点在于在同一实验条件下同步获取并分离这两种细胞类型，从而优化实验动物的使用，并有助于在免疫学背景下更深入地研究这些细胞的相对作用。该方案可用于更深入地探究星形胶质细胞和小胶质细胞在中枢神经系统多种生理与病理过程中的作用，例如阿尔茨海默病、帕金森病，以及原虫寄生虫或病毒感染等疾病。

从同一次提取中获取并分离这两种细胞类型，有助于评估每种细胞亚群在感染或炎症等免疫环境中的相对作用。在去除脑组织和清洗神经组织时需格外小心，但我相信通过本方案和视频演示，操作者将不会遇到困难。该方案所需时间可能较长，具体取决于提取皮质的动物数量，因此请做好花费约四小时或更长时间的准备。

第一天，准备纯 HBSS 以及含 10% 热灭活 FBS 的 HBSS。配制添加物的 DMEM F12 培养基，并使用 0.22 微米滤器过滤。将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌，并在操作过程中使用 70% 乙醇。

将新生小鼠放入含有浸有异氟烷的棉球的密闭容器中，麻醉5分钟以达到深度麻醉状态。用70%乙醇喷洒幼鼠，然后用剪刀将其断头。用剪刀沿颅骨做矢状切口以打开颅骨并暴露脑组织。

使用微型刮铲取出脑组织，以保持脑的完整性。将脑组织置于直径6厘米的干燥培养皿中。用微型刮铲去除嗅球和小脑。

将脑皮层转移至另一个含有2毫升HBSS加10%FBS的培养皿中。用无菌剪刀将脑组织剪成小块，并使用P1000移液器将每份脑组织连同HBSS加10%FBS转移至不同的15毫升锥形管中。如有需要，可使用HBSS加10%FBS将最终体积补足至2毫升。

每管加入三毫升含10%FBS的HBSS缓冲液洗涤切割后的脑组织。倾倒后，小心移除上清液。再用含10%FBS的HBSS缓冲液重复洗涤三次。

然后用三毫升纯 HBSS 洗涤三次。倾倒后，小心移除上清液。接着加入三毫升胰蛋白酶，将离心管置于37°C水浴中孵育30分钟，每隔5分钟轻轻摇动离心管。

此步骤用于消化收集的组织。避免产生气泡。为灭活胰蛋白酶，用3 mL含10%胎牛血清（FBS）的HBSS洗涤组织，倾倒组织后，小心移除上清液。

重复此洗涤步骤三次。然后用三毫升纯HBSS缓冲液洗涤组织，并额外重复两次。倾倒组织后，小心移除上清液。

加入7毫升纯HBSS，通过连续使用移液管吹打使组织匀浆，先用10毫升血清移液管，然后用5毫升移液管，最后用P1000微量移液器。匀浆后，在4°C下以450 × g离心5分钟。弃去上清液，每管用4毫升含10% FBS的HBSS重悬沉淀。

将细胞转移至经商业预处理的T75培养瓶中，以获得最佳的细胞培养贴附效果。将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟，以促进细胞贴壁。随后向培养瓶中加入10毫升添加了补剂的DMEM/F12培养基，并在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续孵育两个夜晚。

第3天，从T75培养瓶中移除7 mL培养基，并加入7 mL新鲜的添加物补充的DMEM F12培养基。将培养瓶放回培养箱中。第5天，为去除碎片和非贴壁细胞，将T75培养瓶中的全部培养基更换为14 mL新鲜的添加物补充的DMEM F12培养基。

随后每隔 48 小时，移除 6 mL 上清液，并加入 7 mL 新鲜的添加物补充 DMEM/F12 培养基，持续至培养第 14 天。在第 14 天，移除 6 mL 上清液并加入 7 mL 新鲜的添加物补充 DMEM/F12 培养基后，用塑料封口膜 tightly 封闭 T75 培养瓶。将其置于摇床底部，在 200 RPM、37 摄氏度条件下过夜震荡，以机械方式使小胶质细胞从星形胶质细胞上解离。

第15天，从摇床中取出培养瓶，用其原有的培养基剧烈冲洗，以优化细胞解离并收获最大数量的微胶质细胞。随后收集上清液，并转移至50毫升锥形管中。接着，向每瓶中加入4毫升胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育5分钟，以使星形胶质细胞脱落。

然后加入5毫升添加物补充的DMEM/F12培养基以灭活胰蛋白酶。用各自培养基清洗培养瓶，并将内容物转移至50毫升锥形管中。将所有含有解离的小胶质细胞或星形胶质细胞的试管在4°C条件下以450 × g离心5分钟。

弃去上清液。将小胶质细胞沉淀重悬于1 mL添加补充物的DMEM/F12培养基中，星形胶质细胞重悬于10 mL添加补充物的DMEM/F12培养基中。随后在Neubauer计数板或自动细胞计数仪中进行细胞计数。

将细胞以含补充剂的DMEM/F12培养基接种于经预处理的平底细胞培养板中，密度按实验需求设定。于37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时，使细胞充分贴壁。第14天时，对胶质细胞培养物进行机械解离。

星形胶质细胞群体的纯度为89.5%，小胶质细胞群体的纯度为96.6%。取自C57BL6小鼠的星形胶质细胞和小胶质细胞被克氏锥虫（T.cruzi Y）感染。在感染后2小时、48小时和96小时，用甲醇固定培养板，并使用细胞核酸标记DAPI和抗GFAP抗体进行染色。使用表达荧光报告蛋白的基因修饰寄生虫或用特异性荧光抗体标记的寄生虫可改善免疫荧光显微镜观察效果，因为这些寄生虫更易于与细胞核区分开来。

此处展示了两个示例：组成型表达YFP的弓形虫RH株和用非商业化单克隆抗体2C2（靶向SSP4蛋白）染色的克氏锥虫Y株。重要的是要仔细洗涤细胞，以避免丢失任何细胞聚集体。

星形胶质细胞感染后，可评估其他参数，例如通过ELISA检测上清液中的细胞因子产生，通过Western blot检测蛋白质表达，以及通过实时定量PCR评估RNA转录水平。该技术有助于研究与胶质细胞功能相关的诸多问题，例如其代谢、免疫反应以及细胞生物学特性本身。所有原生动物寄生虫均能够感染人源细胞以及培养的小鼠细胞，因此在操作此类寄生虫时务必谨慎。