Name: 原生动物寄生虫感染原发性星细胞和微胶质的伴随分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学习从新生小鼠皮层同时分离培养原代星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，用于研究原生动物寄生虫如Trypanosoma cruzi和Toxoplasma gondii感染中枢神经系统时的胶质细胞免疫反应。

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我们感谢圣保罗联邦大学（UNIFESP）的 Renato A. Mortara 博士教授提供抗 Ssp-4 的单克隆抗体 2C2。本研究得到了圣保罗州研究支持基金会（FAPESP，项目号 2017/25942-0，授予 K.R.B.）、国家科学技术发展委员会（CNPq，项目号 402100/2016-6，授予 K.R.B.）、国家疫苗科学与技术研究所（INCTV/CNPq）以及高等教育人员提升协调办公室（CAPES，资助代码 001）的资助。M.P.A. 获 CNPq 研究奖学金，A.L.O.P. 获 CAPES 研究奖学金，I.S.F 和 L.Z.M.F.B. 获 FAPESP 研究奖学金。

涉及小鼠的所有实验程序均依照巴西国家法律（11.794/2008）进行，并经圣保罗联邦大学（UNIFESP）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 胶质细胞的提取、培养与解离
注意：用于胶质细胞提取的小鼠数量取决于所需进行实验的细胞量。在本方案中，从六只新生C57BL/6小鼠共获得2.7 × 107个星形胶质细胞和4 × 106个小胶质细胞。所有操作均在II级生物安全柜中的无菌条件下进行。
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>准备纯Hank's平衡盐溶液（HBSS）以及含10%热灭活胎牛血清（FBS）的HBSS（参见材料表）。</li>
		<li>配制添加物的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12（含10% FBS + 0.08 mM青霉素 + 0.09 mM链霉素 + 12.5 mM HEPES + 30 mM碳酸氢钠，pH 7.2），并用0.22 µm滤器过滤（参见材料表）。 
		注：所有培养基应保存在4 °C，但在实验开始前需在37 °C预热20分钟。</li>
		<li>将所有手术器械（剪刀、刮匙和镊子）在高压灭菌器中灭菌，并在操作过程中使用70%乙醇。</li>
		<li>将新生小鼠（出生后不超过3天）放入含有浸有异氟烷棉球的密闭容器中，麻醉5分钟。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒幼鼠，然后用剪刀剪下头部。</li>
		<li>用剪刀沿颅骨从后向前做矢状切口以打开颅腔并暴露脑组织。用镊子将颅骨与脑组织分离。使用微型刮匙小心取出脑组织，以保持脑组织完整性。</li>
		<li>将脑组织置于一个干燥的培养皿（直径6 cm）中。用微型刮匙去除嗅球和小脑。将大脑皮层转移至另一含有HBSS + 10% FBS（2 mL/培养皿）的培养皿（直径6 cm）中。</li>
		<li>用无菌剪刀将脑组织剪成小块，并使用p1000移液器将每块脑组织连同HBSS + 10% FBS转移至不同的15 mL锥形管中。确保最终体积为2 mL/管；若不足，请用HBSS + 10% FBS补足。 
		注：本步骤可暂停。若暂停，装有中枢神经系统组织的锥形管必须置于冰上，最长不超过1小时。</li>
		<li>用3 mL HBSS + 10% FBS（每管）洗涤剪碎的脑组织，静置分层后小心吸除上清液。重复此步骤3次。 
		注：本步骤旨在去除碎片并回收提取的组织。</li>
		<li>用3 mL纯HBSS（每管）洗涤剪碎的脑组织，静置分层后小心吸除上清液。重复此步骤3次。 
		注：本步骤旨在去除前次洗涤中残留的血清，因为细胞将在下一步进行胰蛋白酶消化。</li>
		<li>每管加入3 mL胰蛋白酶，置于37 °C水浴中30分钟，每隔5分钟轻轻摇动一次。避免通过倒置或剧烈混合产生气泡。 
		注：本步骤旨在消化收集的组织。</li>
		<li>为灭活胰蛋白酶，每管用3 mL HBSS + 10% FBS洗涤组织，静置分层后小心吸除上清液。重复此步骤3次。</li>
		<li>每管用3 mL纯HBSS洗涤组织，并小心吸除上清液。重复此步骤2次。</li>
		<li>每管加入7 mL纯HBSS，通过连续使用不同移液管进行吹打以匀浆组织：先用10 mL移液管，再用5 mL移液管，最后用p1000移液器。</li>
		<li>匀浆完成后，在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，每管用4 mL HBSS + 10% FBS重悬沉淀。</li>
		<li>将细胞转移至预处理的T-75培养瓶中，以促进细胞贴壁（参见材料表）。 
		注：每只动物的组织应单独处理并接种于一个培养瓶中。</li>
		<li>将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟，使细胞贴壁。</li>
		<li>每瓶加入10 mL添加物的DMEM/F12，并在37 °C、5% CO2条件下继续培养。 
		注：每瓶最终体积为14 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>从T-75培养瓶中移除7 mL培养基，并加入7 mL新鲜的添加物DMEM/F12。 
		注：培养瓶中将含有大量细胞碎片，外观浑浊。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5天
	<ol>
		<li>将T-75培养瓶中的全部培养基移除，并加入14 mL新鲜的添加物DMEM/F12。 
		注：更换培养基以去除碎片和未贴壁细胞。</li>
		<li>此后每隔48小时，从培养瓶中移除6 mL上清液，并加入7 mL新鲜的添加物DMEM/F12，直至培养第14天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第14天
	<ol>
		<li>移除6 mL上清液并加入7 mL新鲜的添加物DMEM/F12后，将T-75培养瓶盖紧。</li>
		<li>将培养瓶置于37 °C、200 rpm的轨道摇床上过夜，以机械方式分离小胶质细胞与星形胶质细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第15天
	<ol>
		<li>从摇床上取下培养瓶，用力用其自身培养基冲洗，以优化细胞解离并最大程度收集小胶质细胞。然后收集上清液（含小胶质细胞）并转移至50 mL锥形管中。</li>
		<li>随后，每瓶加入4 mL胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟，以解离星形胶质细胞。</li>
		<li>每瓶加入5 mL添加物DMEM/F12以灭活胰蛋白酶。用其自身培养基冲洗培养瓶，并将内容物转移至50 mL锥形管中。</li>
		<li>将所有含有解离的小胶质细胞和星形胶质细胞的管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液。将小胶质细胞沉淀重悬于1 mL添加物DMEM/F12中，星形胶质细胞沉淀重悬于10 mL添加物DMEM/F12中。</li>
		<li>使用血球计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。将细胞以所需密度接种于适当的平底细胞培养板中（预处理以促进细胞贴附；参见材料表），并在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，使细胞贴壁。 
		注：保留每种细胞群体1.5 × 106个细胞，用于通过流式细胞术确认纯度。</li>
		<li>进行流式细胞术分析，以验证细胞群体的纯度。 
		注：我们认为小胶质细胞为CD11b+/CD45+/GFAP-，星形胶质细胞为CD11b-/CD45-/GFAP+。可考虑使用Iba1和TMEM119染色以全面表征小胶质细胞22。</li>
		<li>为每种细胞群体（星形胶质细胞和小胶质细胞）设置FMO（荧光减一）23和未染色样本作为流式细胞术的对照。</li>
		<li>为每种细胞群体，保留5 × 105个细胞用于每个染色和未染色样本。对于FMO，另保留两个含小胶质细胞的管，每管含2.5 × 105个细胞，以及另一个含5 × 105个星形胶质细胞的管。 
		注：由于小胶质细胞数量可能有限，未染色和FMO对照可使用较少细胞。</li>
		<li>将所有微量离心管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。弃去上清液，每管用500 µL FACS缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS）+ 0.5%牛血清白蛋白（BSA）+ 2 mM EDTA，pH 7.2）重悬沉淀。</li>
		<li>将所有微量离心管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。弃去上清液，每管用100 µL抗CD16/CD32（克隆93）（1:50稀释于FACS缓冲液中）重悬沉淀，在室温孵育10分钟。</li>
		<li>向所有微量离心管中每管加入500 µL FACS缓冲液，4 °C、450 x g离心5分钟。弃去上清液。将星形胶质细胞和小胶质细胞染色管以及星形胶质细胞FMO管用50 µL/管的表面标记物混合液（抗CD45（PE，克隆30-F11）和抗CD11b（eFluor 450，克隆M1/70），均以1:100稀释于FACS缓冲液中）重悬。</li>
		<li>对于未染色细胞，用相同体积的FACS缓冲液重悬。对于小胶质细胞FMO，将每个小胶质细胞管分别与抗CD45或抗CD11b孵育。所有样本在4 °C避光孵育20分钟。</li>
		<li>每管加入500 µL FACS缓冲液，4 °C、450 x g离心5分钟。弃去上清液，每管用100 µL固定缓冲液（参见材料表）重悬沉淀，在室温避光孵育20分钟。</li>
		<li>每管加入500 µL 1×破膜缓冲液（参见材料表），在4 °C避光孵育5分钟。</li>
		<li>将所有微量离心管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。弃去上清液。将星形胶质细胞和小胶质细胞染色管以及小胶质细胞FMO管用50 µL/管的细胞内抗体抗GFAP（APC，克隆GA5）（以1:100稀释于1×破膜缓冲液中）重悬。对于未染色细胞和星形胶质细胞FMO，用相同体积的FACS缓冲液重悬细胞。所有样本在4 °C避光孵育30分钟。</li>
		<li>通过每管加入500 µL 1×破膜缓冲液洗涤所有管。将所有微量离心管在4 °C条件下以450 x g离心5分钟。每管用200 µL FACS缓冲液重悬。在流式细胞仪上每样本采集1 × 105个事件。</li>
		<li>分析时，应先在CD11b × CD45散点图中设门，再分析GFAP直方图。 
		注：未染色和FMO对照有助于确定设门范围。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 感染及感染率的评估
<ol>
	<li>胶质细胞感染T. gondii
	<ol>
		<li>将3 × 104个小胶质细胞或星形胶质细胞接种于经预处理的96孔平底板中，加入含补充剂的DMEM/F12培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养24小时（参见材料表）。</li>
		<li>用表达黄色荧光蛋白（YFP）的T. gondii RH株速殖子感染各细胞群体，按感染复数（MOI）1:1（寄生虫:细胞）的比例，将速殖子稀释于每孔200 µL含补充剂的RPMI培养基（含3% FBS、0.16 mM青霉素、0.18 mM链霉素、12.5 mM HEPES和30 mM碳酸氢钠，pH 7.2）中，在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时（参见材料表）。</li>
		<li>随后弃去上清液，每孔加入100 µL用PBS稀释的1%多聚甲醛（PFA），于4 °C固定24小时。</li>
		<li>将PFA替换为每孔100 µL、pH 7.2的PBS。</li>
		<li>小心吸除上清液，每孔加入50 µL用pH 7.2 PBS稀释1:1,000的DAPI（5 mg/mL），室温避光孵育1分钟，对细胞核进行染色。</li>
		<li>将DAPI染色液替换为每孔100 µL、pH 7.2的PBS，随后进行荧光显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶质细胞感染T. cruzi
	<ol>
		<li>将3 × 104个小胶质细胞或星形胶质细胞接种于经预处理的96孔平底板中，加入含补充剂的DMEM/F12培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养24小时（参见材料表）。 
		注意：每个感染时间点应使用不同的培养板。</li>
		<li>用T. cruzi Y株的上鞭毛体以MOI为5:1（寄生虫:细胞）的比例感染胶质细胞，将上鞭毛体稀释于每孔200 µL含补充剂的RPMI培养基中，在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。 
		注意：此步骤对寄生虫侵入细胞至关重要。</li>
		<li>弃去全部上清液，每孔加入200 µL含补充剂的RPMI洗涤一次，以去除所有胞外寄生虫；再次弃去上清液后，每孔加入200 µL新鲜的含补充剂RPMI培养基。 
		注意：此步骤旨在去除未侵入贴壁细胞的寄生虫。</li>
		<li>将感染后的细胞分别孵育2小时、48小时和96小时，以评估T. cruzi在胶质细胞内的复制情况11。</li>
		<li>在每个时间点后，弃去上清液，每孔加入100 µL甲醇，室温固定15分钟，随后将甲醇替换为每孔100 µL、pH 7.2的PBS。</li>
		<li>固定后，按以下步骤进行免疫荧光染色：
		<ol>
			<li>为避免自发荧光，每孔加入100 µL用pH 8.0 PBS稀释的50 mM NH4Cl，室温孵育15分钟；每孔加入100 µL PBS洗涤并立即吸除（重复该步骤3次）。</li>
			<li>接着，每孔加入100 µL用PBS稀释的0.5% Triton，室温孵育15分钟以通透细胞；每孔加入100 µL PBS洗涤并立即吸除（重复该步骤3次）。</li>
			<li>然后，每孔加入100 µL封闭液（含5%脱脂奶粉和2% BSA的PBS [pH 7.2]溶液），室温孵育1小时；每孔加入100 µL PBS洗涤并立即吸除（重复该步骤3次）。</li>
			<li>为染色无鞭毛体，每孔加入30 µL用封闭液稀释1:200的非商业化单克隆抗体（mAb）2C2抗-Ssp-4蛋白，室温孵育1小时。</li>
			<li>每孔加入100 µL PBS洗涤并立即吸除（重复该步骤3次）；每孔加入30 µL用PBS稀释1:500的二抗（抗小鼠抗体），室温孵育1小时。 
			注意：非商业化单克隆抗体mAb 2C2抗-Ssp-4蛋白由圣保罗联邦大学微生物学、免疫学与寄生虫学系Renato A. Mortara教授惠赠。</li>
			<li>小心吸除上清液，每孔加入50 µL用pH 7.2 PBS稀释1:1,000的DAPI（5 mg/mL），室温避光孵育1分钟，对细胞核进行染色。</li>
			<li>将DAPI染色液替换为每孔100 µL、pH 7.2的PBS，随后进行荧光显微镜观察。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在过去的二十年中，研究分离的胶质细胞在不同生物学背景下的功能变得愈发重要。理解中枢神经系统（CNS）中除神经元以外的功能仍是细胞生物学中一个不断发展的领域，尤其是在感染或炎症条件下8,9,24。胶质细胞的重要性不仅体现在为神经元提供物理支持（如先前所知），还涉及多种生理过程，例如为神经元提供能量、神经代谢、免疫监视、突触修剪以及组织的塑造与调节等3,25,26,27,28,29。
由于星形胶质细胞和小胶质细...

中枢神经系统（CNS）主要由神经元和胶质细胞组成1,2,3。小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞。小胶质细胞作为常驻巨噬细胞，是中枢神经系统中具有免疫活性和吞噬功能的胶质细胞3,4，而星形胶质细胞则负责维持内环境稳定并发挥支持性功能5。
尽管胶质细胞传统上被认为主要负责神经元的支持和保护作用6,7，但近年来的文献已报道了这些细胞的多种新功能，包括其对感染的响应8,9,10,11。因此，目前迫切需要开发出分离这些胶质细胞的方法，以分别研究其各自的功能。
相较于原代培养，存在一些用于研究胶质细胞的替代模型，例如永生化细胞系和体内模型。然而，永生化细胞更容易发生遗传漂移和形态学改变，而体内研究则受限于操作条件。相反，原代培养易于操作，更接近体内细胞的特性，同时允许我们控制实验因素12，13。本文中，我们描述了从小鼠中分离、培养和解离星形胶质细胞与小胶质细胞原代细胞的同一实验方案的指导原则。此外，我们还提供了在这些培养体系中进行原虫感染实验的操作示例。
从新生小鼠（不超过3日龄）中提取的中枢神经系统细胞在差异培养基中培养14天，以促进星形胶质细胞和小胶质细胞的选择性生长。由于小胶质细胞位于贴壁的星形胶质细胞层之上，因此通过轨道摇床进行机械分离。随后，收集含有小胶质细胞的全部上清液，并加入胰蛋白酶以解离星形胶质细胞。分离得到的胶质细胞通过流式细胞术进行表型鉴定，并根据所需实验进行接种培养。
我们还提供了如何用原生动物寄生虫感染这些分离的小胶质细胞和星形胶质细胞的示例。T. gondii 是一种具有高度嗜神经性的原生动物，可导致弓形虫病14，而 T. cruzi 则是恰加斯病的致病原，该病可导致中枢神经系统（CNS）出现神经系统障碍15,16。此外，已有报道表明，在免疫功能低下患者中，T. gondii17,18 或 T. cruzi19,20,21 感染可能是导致死亡的潜在原因。因此，阐明中枢神经系统胶质细胞在控制原生动物感染中的免疫学作用具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>70% 乙醇</td><td>Din&amp;acirc;mica Qu&amp;iacute;mica Contempor&amp;acirc;nea</td><td>Cat: 2231</td><td>灭菌</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>Corning</td><td>Cat: 430720U</td><td>塑料材料</td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板</td><td>Greiner Cellstar</td><td>Cat: 655090</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>氯化铵 (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>Din&amp;acirc;mica Qu&amp;iacute;mica Contempor&amp;acirc;nea</td><td>Cat: C10337.01.AH</td><td>去除自发荧光</td></tr><tr><td>抗 GFAP 抗体</td><td>Abcam</td><td>Cat.: ab49874</td><td>免疫荧光抗体</td></tr><tr><td>瓶顶滤器 0.22 &amp;mu;m CA</td><td>Corning</td><td>Cat: 430513</td><td>培养基过滤</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: A7906</td><td>FACS 缓冲液配制</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td><td>BD Pharmigen</td><td>Cat.: 553310</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 12-0451-83</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Cat: 5810R</td><td>离心</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>离心</td></tr><tr><td>II 级生物安全柜</td><td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>无菌操作用生物安全柜</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>ThermoScientific</td><td>型号: 3110</td><td>原代细胞维持</td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Corning</td><td>Cat: 430766</td><td>塑料材料</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Corning</td><td>Cat: 352070</td><td>塑料材料</td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: C10281</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: D1306</td><td>免疫荧光抗体</td></tr><tr><td>数码显微镜相机</td><td>Nikon</td><td>Cat: DS-RI1</td><td>显微镜图像采集</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat: 12800-058</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: E9884</td><td>FACS 缓冲液配制</td></tr><tr><td>F12 营养混合物</td><td>Gibco</td><td>Cat: 21700-026</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>不可用</td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>LGC Biotechnology</td><td>Cat: 10-bio500-1</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>Flow Jo（软件）</td><td>Flow Jo</td><td>版本: Flow Jo_9.9.4</td><td>数据分析</td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>Nikon</td><td>Cat: C-HGFI</td><td>荧光光源</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 50-9892-82</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (FITC)</td><td>Kirkeegood&amp;amp;Perry Lab (KPL)</td><td>Cat.: 172-1806</td><td>免疫荧光抗体</td></tr><tr><td>HBSS - 亨克氏平衡盐溶液</td><td>Gibco</td><td>Cat: 14175079</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: H4034</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>IC 固定缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8222-49</td><td>流式细胞术细胞固定</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>型号: ECLIPSE TS100</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td>Cat: 21.2665</td><td>吸入性麻醉剂</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Synth</td><td>Cat: 01A1085.01.BJ</td><td>免疫荧光固定</td></tr><tr><td>微型刮勺</td><td>ABC stainless</td><td>不可用</td><td>手术材料</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>Cat: MCT-150-C</td><td>塑料材料</td></tr><tr><td>单克隆抗体 (mAb) 2C2 抗 Ssp-4</td><td>非商业化</td><td>非商业化</td><td>免疫荧光抗体</td></tr><tr><td>多通道移液器 (p200)</td><td>Corning</td><td>Cat: 751630124</td><td>移液试剂</td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>Nikon</td><td>版本 4.0</td><td>图像采集与分析</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Nestl&amp;eacute;</td><td>Cat: 9442405</td><td>免疫荧光封闭液</td></tr><tr><td>轨道摇床培养箱</td><td>ThermoScientific</td><td>型号: 481 Cat: 11</td><td>分离小胶质细胞与星形胶质细胞</td></tr><tr><td>多聚甲醛 (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P6148</td><td>免疫荧光固定</td></tr><tr><td>PBS</td><td>非商业化</td><td>非商业化</td><td>中性缓冲液</td></tr><tr><td>青霉素 G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P-7794</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>通透缓冲液 (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8333-56</td><td>流式细胞术细胞通透</td></tr><tr><td>培养皿 60 mm x 15 mm（一次性，无菌）</td><td>Prolab</td><td>Cat: 0303-8</td><td>塑料材料</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>pH 溶液校准</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>Cat: 31800-014</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>ABC stainless</td><td>Cat: LO9-W4</td><td>手术材料</td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Corning</td><td>Cat: 4101</td><td>塑料材料</td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Corning</td><td>Cat: 4051</td><td>塑料材料</td></tr><tr><td>单通道移液器 (p1000)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123602</td><td>移液试剂</td></tr><tr><td>单通道移液器 (p200)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123601</td><td>移液试剂</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S6297</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S9137</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: T9284</td><td>免疫荧光通透</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>Cat: 27250-018</td><td>消化酶</td></tr><tr><td>镊子</td><td>ABC stainless</td><td>Cat: L28-P4-172</td><td>手术材料</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Novatecnica</td><td>型号: 09020095</td><td>37 &amp;deg;C 下用胰蛋白酶消化组织</td></tr></tbody></table>

同时分离原代星形胶质细胞和小胶质细胞用于原生动物寄生虫感染研究

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

星形胶质细胞和小胶质细胞是最丰富的胶质细胞类型，负责中枢神经系统（CNS）的生理支持和稳态维持。越来越多的证据表明它们参与调控感染性疾病，这促使人们日益关注改进原代星形胶质细胞和小胶质细胞的分离方法，以评估这些细胞对影响中枢神经系统感染的反应。鉴于克氏锥虫（Trypanosoma cruzi，T. cruzi）和刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T. gondii）感染对中枢神经系统的重大影响，本文提供了一种从小鼠中提取、培养、解离并用原生动物寄生虫感染星形胶质细胞和小胶质细胞的方法。从新生小鼠大脑皮层提取的细胞在体外培养14天，并定期更换差异培养基。星形胶质细胞和小胶质细胞通过相同的提取流程经机械解离获得。细胞经流式细胞术进行表型鉴定后，使用原生动物寄生虫进行感染。通过荧光显微镜在不同时间点测定感染率，从而评估胶质细胞控制原生动物入侵和复制能力的差异。这些技术代表了研究星形胶质细胞和小胶质细胞对感染反应的简单、经济且高效的方法，为深入的神经免疫学分析开辟了新的研究途径。

第14天th 天，胶质细胞培养（图1A) 进行了机械解离。通过流式细胞术对分离的细胞群体进行 CD11b、CD45 和 GFAP 标志物分析。我们观察到星形胶质细胞群体纯度为 89.5%，小胶质细胞群体纯度为 96.6%（图1B)。分离后，将细胞接种于96孔平底培养板中，24小时后即可用于感染 T. cruzi 或 T. gondii 根据相应的感染方案。此处我们提供了一次时间序列感染实验 T. cruzi 作为评估这些胶质细胞感染率的一个示例。
星形胶质细胞和小胶质细胞（每孔 3 × 104 个细胞）以 MOI = 5:1（寄生虫:细胞）的比例接种 T. cruzi，感染时间为 2–96 小时（图 2）。通过免疫荧光法评估...

本实验方案的总体目标是指导如何从中枢神经系统中提取、培养和分离小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞，随后用原生动物寄生虫进行感染。

星形胶质细胞和小胶质细胞是最丰富的胶质细胞类型，它们负责中枢神经系统中的生理支持和稳态维持。

本方案描述了一种并行提取出生后小鼠中两种最丰富的胶质细胞群体——星形胶质细胞和小胶质细胞的方法。我们的方法与以往报道的星形胶质细胞和小胶质细胞分离方案不同，重点在于在同一实验条件下同步获取并分离这两种细胞类型，从而优化实验动物的使用，并有助于在免疫学背景下更深入地研究这些细胞的相对作用。该方案可用于更深入地探究星形胶质细胞和小胶质细胞在中枢神经系统多种生理与病理过程中的作用，例如阿尔茨海默病、帕金森病，以及原虫寄生虫或病毒感染等疾病。从同一次提取中获取并分离这两种细胞类型，有助于评估每种细胞亚群在感染或炎症等免疫环境中的相对作用。在去除脑组织和清洗神经组织时需格外小心，但我相信通过本方案和视频演示，操作者将不会遇到困难。该方案所需时间可能较长，具体取决于提取皮质的动物数量，因此请做好花费约四小时或更长时间的准备。第一天，准备纯 HBSS 以及含 10% 热灭活 FBS 的 HBSS。配制添加物的 DMEM F12 培养基，并使用 0.22 微米滤器过滤。将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌，并在操作过程中使用 70% 乙醇。将新生小鼠放入含有浸有异氟烷的棉球的密闭容器中，麻醉5分钟以达到深度麻醉状态。用70%乙醇喷洒幼鼠，然后用剪刀将其断头。用剪刀沿颅骨做矢状切口以打开颅骨并暴露脑组织。使用微型刮铲取出脑组织，以保持脑的完整性。将脑组织置于直径6厘米的干燥培养皿中。用微型刮铲去除嗅球和小脑。将脑皮层转移至另一个含有2毫升HBSS加10%FBS的培养皿中。用无菌剪刀将脑组织剪成小块，并使用P1000移液器将每份脑组织连同HBSS加10%FBS转移至不同的15毫升锥形管中。如有需要，可使用HBSS加10%FBS将最终体积补足至2毫升。每管加入三毫升含10%FBS的HBSS缓冲液洗涤切割后的脑组织。倾倒后，小心移除上清液。再用含10%FBS的HBSS缓冲液重复洗涤三次。然后用三毫升纯 HBSS 洗涤三次。倾倒后，小心移除上清液。接着加入三毫升胰蛋白酶，将离心管置于37°C水浴中孵育30分钟，每隔5分钟轻轻摇动离心管。此步骤用于消化收集的组织。避免产生气泡。为灭活胰蛋白酶，用3 mL含10%胎牛血清（FBS）的HBSS洗涤组织，倾倒组织后，小心移除上清液。重复此洗涤步骤三次。然后用三毫升纯HBSS缓冲液洗涤组织，并额外重复两次。倾倒组织后，小心移除上清液。加入7毫升纯HBSS，通过连续使用移液管吹打使组织匀浆，先用10毫升血清移液管，然后用5毫升移液管，最后用P1000微量移液器。匀浆后，在4°C下以450 × g离心5分钟。弃去上清液，每管用4毫升含10% FBS的HBSS重悬沉淀。将细胞转移至经商业预处理的T75培养瓶中，以获得最佳的细胞培养贴附效果。将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟，以促进细胞贴壁。随后向培养瓶中加入10毫升添加了补剂的DMEM/F12培养基，并在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续孵育两个夜晚。第3天，从T75培养瓶中移除7 mL培养基，并加入7 mL新鲜的添加物补充的DMEM F12培养基。将培养瓶放回培养箱中。第5天，为去除碎片和非贴壁细胞，将T75培养瓶中的全部培养基更换为14 mL新鲜的添加物补充的DMEM F12培养基。随后每隔 48 小时，移除 6 mL 上清液，并加入 7 mL 新鲜的添加物补充 DMEM/F12 培养基，持续至培养第 14 天。在第 14 天，移除 6 mL 上清液并加入 7 mL 新鲜的添加物补充 DMEM/F12 培养基后，用塑料封口膜 tightly 封闭 T75 培养瓶。将其置于摇床底部，在 200 RPM、37 摄氏度条件下过夜震荡，以机械方式使小胶质细胞从星形胶质细胞上解离。第15天，从摇床中取出培养瓶，用其原有的培养基剧烈冲洗，以优化细胞解离并收获最大数量的微胶质细胞。随后收集上清液，并转移至50毫升锥形管中。接着，向每瓶中加入4毫升胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育5分钟，以使星形胶质细胞脱落。然后加入5毫升添加物补充的DMEM/F12培养基以灭活胰蛋白酶。用各自培养基清洗培养瓶，并将内容物转移至50毫升锥形管中。将所有含有解离的小胶质细胞或星形胶质细胞的试管在4°C条件下以450 × g离心5分钟。弃去上清液。将小胶质细胞沉淀重悬于1 mL添加补充物的DMEM/F12培养基中，星形胶质细胞重悬于10 mL添加补充物的DMEM/F12培养基中。随后在Neubauer计数板或自动细胞计数仪中进行细胞计数。将细胞以含补充剂的DMEM/F12培养基接种于经预处理的平底细胞培养板中，密度按实验需求设定。于37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时，使细胞充分贴壁。第14天时，对胶质细胞培养物进行机械解离。星形胶质细胞群体的纯度为89.5%，小胶质细胞群体的纯度为96.6%。取自C57BL6小鼠的星形胶质细胞和小胶质细胞被克氏锥虫（T.cruzi Y）感染。在感染后2小时、48小时和96小时，用甲醇固定培养板，并使用细胞核酸标记DAPI和抗GFAP抗体进行染色。使用表达荧光报告蛋白的基因修饰寄生虫或用特异性荧光抗体标记的寄生虫可改善免疫荧光显微镜观察效果，因为这些寄生虫更易于与细胞核区分开来。此处展示了两个示例：组成型表达YFP的弓形虫RH株和用非商业化单克隆抗体2C2（靶向SSP4蛋白）染色的克氏锥虫Y株。重要的是要仔细洗涤细胞，以避免丢失任何细胞聚集体。星形胶质细胞感染后，可评估其他参数，例如通过ELISA检测上清液中的细胞因子产生，通过Western blot检测蛋白质表达，以及通过实时定量PCR评估RNA转录水平。该技术有助于研究与胶质细胞功能相关的诸多问题，例如其代谢、免疫反应以及细胞生物学特性本身。所有原生动物寄生虫均能够感染人源细胞以及培养的小鼠细胞，因此在操作此类寄生虫时务必谨慎。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

原生动物寄生虫感染原发性星细胞和微胶质的伴随分离

从大脑复杂的细胞异质性中分离原代小胶质细胞，对于研究其在生理和病理条件下的作用至关重要。本方案描述了一种机械分离与混合细胞培养技术，可获得高产量、高纯度且具有活性的原代小胶质细胞 体外...

从新生大鼠脑组织的混合胶质细胞培养物中分离原代小胶质细胞

本研究描述了一种新型神经元轴突与（星形）胶质细胞共培养平台的建立步骤。在此共培养系统中，可实现对单个轴突（及单个胶质细胞）之间直接相互作用的操控，从而能够对神经元与胶质细胞之间的相互信号传导机制进行分析。...

基于微流控培养平台（MCP）的神经元轴突与胶质细胞共培养系统中神经元-胶质细胞相互作用的成像分析

星形胶质细胞已被确认为多功能细胞，参与多种基本生物学过程，在正常脑发育、功能维持及中枢神经系统修复中发挥重要作用。本文介绍一种快速获取纯化小鼠星形胶质细胞培养物的实验流程，用于研究这类主要中枢神经系统细胞的生物学特性。...

小鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养

本文介绍了一种从感染约氏疟原虫ANKA株（Plasmodium berghei...

从感染Plasmodium berghei ANKA小鼠中分离和分析脑滞留白细胞

成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA...

从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

本文介绍了一种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的实验方案。该技术有助于深入理解神经系统疾病。通过结合密度梯度离心与磁珠分选方法，可获得产量充足且纯度较高的细胞样本。此外，我们还概述了小胶质细胞表征的具体步骤。...

通过密度梯度离心法对小鼠原代小胶质细胞进行表征与分离

本文介绍了一种从小鼠中枢神经系统体外分离多种胶质细胞群体的实验方案。该方法可分离出不同区域的小胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞以及星形胶质细胞，以便在多种培养体系中分别研究各类细胞的表型特征。...

从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞

脂肪来源的间充质基质细胞（AdMSCs）具有强大的免疫调节特性，可用于治疗与炎症相关的疾病。本文演示如何分离和培养小鼠AdMSCs及原代混合神经胶质细胞，刺激AdMSCs以使其上调抗炎基因和生长因子，评估AdMSCs的迁移能力，并将AdMSCs与原代混合朊病毒感染的神经胶质细胞进行共培养。...

脂肪来源的间充质基质细胞与原代混合神经胶质细胞共培养以减轻朊病毒诱导的炎症

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

本方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，可用于后续的RNA分析和细胞培养等应用。方案包括详细的细胞解离方法及操作步骤，旨在提高分离细胞的质量和得率。...

从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞 体外 检测与转录组学研究

学习从新生小鼠皮层同时分离培养原代星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，用于研究原生动物寄生虫如Trypanosoma cruzi和Toxoplasma gondii感染中枢神经系统时的胶质细胞免疫反应。

同时分离原代星形胶质细胞和小胶质细胞用于原生动物寄生虫感染研究

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