量化金黄色葡萄球菌对人多态核白细胞的细胞毒性

金黄色葡萄球菌是一种克阳性细菌，产生多种促进发病机制的毒性因子。其中包括双组分白细胞毒素，这些毒素会破坏多态核白细胞的膜完整性，也称为PMN或中性粒细胞。此视频说明了 PMN 与人类全身血液的分离，以及两种独特的检测方法，用于量化这些重要的先天免疫细胞的 S.aureus 细胞毒性。

这些测定都可以通过标准实验室设备完成，并且易于适应，以检查宿主病原体相互作用的其他方面。这些实验将使用从人类献血者那里抽出的全部血液，并需要得到适当的机构委员会或审查委员会的批准，并说明所有参与者都知情同意。这一程序的第一步是通过离心和密度梯度隔离嗜中性粒细胞。

首先，携带50毫升3%dextran 0.9%氯化钠、35毫升0.9%氯化钠、20毫升1.8%氯化钠、每毫升1.077克12毫升溶液和20毫升水到室温。将25毫升新鲜提取的肝素全人类血液转移到两个锥形离心管中。将25毫升新鲜抽出的肝素全血与25毫升当量室温、3%dextran、0.9%氯化钠一对一的比例结合在一起。

通过轻轻摇动每根 50 毫升锥形管混合，然后在室温下站立 30 分钟。在室温下孵育后，将出现两个单独的层。将每个 dextran 血液混合物的顶层转移到新的 50 毫升锥形管中。

在室温下以 450 g 离心 10 分钟，低或无中断。小心吸吸两种超自然剂，在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃。轻轻地将每个细胞颗粒重新用两毫升0.9%氯化钠中重新暂停。

将重新暂停的颗粒组合在单个 50 毫升圆锥体中，然后将剩余的 0.9% 氯化钠加入到 35 毫升的最终体积中。使用手移液器在细胞悬浮液下方小心地铺设 10 毫升 1.077 克 1.077 克的纤维溶液。在室温下旋转 450 g 30 分钟后，在低或无中断的情况下，轻轻吸吸上一提液，而不会干扰细胞颗粒，如前所述。

将红血球在20毫升室温水中重新产生细胞颗粒，使红血球变小。通过摇动30秒轻轻混合。立即加入20毫升1.8%氯化钠，并在室温下以450克离心样品10分钟。

如前所示，小心吸进上一液。轻轻将细胞颗粒重新暂停在两毫升室温 RPMI 中，并放在冰上。使用血速计计算细胞。

用冰冷 RPMI 每毫升 10 至第 7 个细胞的浓度重新暂停纯化 PMN，并保持在冰上。将100微升纯化PMN与300微升的DPBS相结合，在两个复制流式细胞管中含有一微升碘化二甲二醇污渍。对于正对，将 40 微升 0.5% Triton X-100 溶液加入其中一个流式细胞仪管中，彻底混合。

使用流式细胞仪测量正向散射、侧散射和碘化染色，以确定隔离 PMN 的纯度和完整性。只应使用超过98%纯正和95%以上二碘化物阴性PMN制剂。有关概述正常人血清分离的协议，请参阅全文。

通过将用 DPBS 稀释的 20% 分离人类血清的 100 微升添加到用于此测定的单个孔中，为 PMN 细胞毒性测定准备一个 96 孔板。请务必包括至少一个只接收介质的负控制井和至少一个正控制井，该井将收到 0.05% Triton X. 孵化板在 37 摄氏度 30 分钟。孵育后，用100微升的冰冷DPBS洗两次编码井，将板放在冰上。

从板井中去除任何残留的DPBS，并轻轻地将100微升的纯化人类PMN，每毫升10个细胞的10倍添加到每毫升第7个细胞到每个编码孔。允许镀微粒细胞在以下细胞毒性测定中使用前至少五分钟在冰上沉淀。本节介绍一种测定方法，该测定方法可量化金黄色葡萄球菌对人类PMN产生的细胞外蛋白质的细胞毒性。

在实验前一天，在37摄氏度的震动培养箱中，在适当的介质中养殖S.aureus过夜。亚培养S.aureus通过执行1至100稀释过夜细菌培养与新鲜介质。在37摄氏度下孵育，并摇动，直到细菌达到早期静止生长阶段。

经过5个小时的生长，将一毫升亚培养素S.aureus转移到1.5毫升微离心管中，并在室温下以5000克离心，5分钟。离心后，吸上一种。通过0.22微米注射器过滤器将吸气的过流液液进入新的1.5毫升微离心管中，并放在冰上。

使用冰冷介质对超级钠进行连续稀释，用于培养金黄色葡萄球菌。如前所述，在冰上含有PMN的96孔板的单个孔中轻轻添加上超常样品或借来用于负和正对的介质。轻轻的岩石板，在井中分配超级钠，并在37摄氏度下孵育。

在所需时间，从培养箱中取出板，放在冰上。在每个流动的细胞仪管中加入300微升含有一微升碘化物的冰冷DMBS。将样品转移到冰上流动的细胞仪管。

对于正对照井，在转移到流式细胞仪管之前，在样品中加入20微升10%Triton X。使用流式细胞分析醉斑PMN的碘化污渍。本节介绍一种分析方法，该测定方法可量化人类 PMN 吞噬后 S.aureus 的细胞毒性。

在进行此分析之前，必须确定由 600 纳米的光学密度和细菌浓度定义的生长曲线。开始一夜之间培养的S.aureus菌株和亚培养细菌，如前所述。一旦亚培养的金黄色葡萄球菌达到中指数生长，将一毫升培养细菌转移到1.5毫升微离心管，并在室温下以5000克离心5分钟。

在不干扰颗粒的情况下吸气其上一提液，并在一毫升 DPBS 中重新暂停颗粒细菌，以吸气洗涤 S.aureus。旋转样品30秒。在室温下以5000克离心样品5分钟。

要氧化金黄色葡萄球菌，首先将细菌颗粒重新在20%人血清的一毫升中重新暂停。然后在37摄氏度下孵育样品，搅拌15分钟。如前面所示，在离心后洗涤牛化金黄色葡萄球菌。

稀释牛性金黄色葡萄球菌菌株到1倍10到第8个菌落形成单位，每毫升CU，与冰冷的RMHI。旋转样品30秒，放在冰上。通过电镀一至10系列细菌在阿加上，确认用于这些测定的金黄色葡萄球菌的浓度。

从步骤 1.14 开始，在每口金黄色葡萄球菌菌株（或用于正负对控的 RPMI）的 96 井板中轻轻添加 100 微升。轻轻的岩石板，在井中分配金黄色葡萄球菌。在4摄氏度下，在500克的离心板中同步噬菌体，在4摄氏度下在37摄氏度下孵育板，即时间零。

在所需的时间点，将板放在冰上，并添加200微升的冰冷DPBS，其中包含一个微升的碘化丙二，每个流动的细胞测量管，然后转移样品到相应的管。使用流量细胞学分析样品，如2.8和2.9所述。以金黄色葡萄球菌为目标的双组分白细胞毒素的转录要求SA或S2成分系统证明所述测定的效用，以量化金黄色葡萄球菌细胞毒性。

这些实验是在临床上相关的金黄色葡萄球菌分离物中进行的，该分离物被确定为此菌株中SA或S的原生缺失突变物中的USUS300。左面板描述纯化的 PMN，右面板以有意污染的样品为例。使用本协议第一节所述程序隔离的PMN被染色为碘化丙胺，并使用流式细胞仪进行检测。

前向和侧散射图用于检测纯化PMN在1A年和1B年被纯化PMN的污染。通过使用所述的人类PMN纯化方法，我们可以持续分离5倍10到7至10倍至8个PMN，这些PMN超过98%纯，超过95%的碘化阴性。

对经过纯化的PMN进行细胞毒性测试，对美国300和阿赛R/S突变体产生的细胞外蛋白的细胞毒性进行了检测。这些实验表明，在用美国300生产的细胞外蛋白中毒30分钟后，纯化PMN的碘化染色浓度增加，但与阿赛R/S突变体无关。进一步的实验表明，美国300个细胞外蛋白中毒后，碘化丙胺阳性PMN的比例稳步上升，在大约30分钟后趋于稳定。

在接触 AsaeR/S 突变体产生的细胞外蛋白质后，所有时间点都注意到人类 PMN 的碘化染色最小。最后，对同步吞噬后美国300和SaeR/S突变体对PMN的细胞毒性进行了测试，在美索细胞病后90分钟观察到碘化阳性PMN的浓度依赖性增加。在 AsaeR/S 突变体形成噬菌体后，PMN 的碘化阳性显著减少。

在这些实验中都使用了美国300和SaeR/S突变 inculum 的枚举，表明这些菌株之间的细胞毒性对比并不是由于所用细菌浓度的差异。该协议描述了从人类血液中的PMN的纯化，用两种不同的技术来量化S.aureus对这些先天免疫细胞的细胞毒性。这些程序的成功将取决于纯化的PMN的质量以及金黄色葡萄球菌或超级钠的适当制备。

请查阅全文，了解执行这些程序时要考虑的要点。USA300 是一种致命的 MRSA 分离物，AsaeR/S 的丧失显著减少了针对人类 PMN 的毒性因子的转录，使这些菌株成为使用所述分析比较细胞毒性的理想模型。使用其他金黄色葡萄球菌菌株时，可能需要定制生长条件、添加的超级盐剂数量或细菌与 PMN 的比率。