Name: 量化金黄色葡萄球菌对人多态核白细胞的细胞毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学习从人全血中分离多形核白细胞并使用流式细胞术和96孔板实验量化金黄色葡萄球菌细胞毒性的方法。该方案适用于研究宿主-病原体相互作用及先天免疫反应。

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本工作得到了美国国立卫生研究院基金（NIH-1R56AI135039-01A1、1R21A128295-01、U54GM115371）以及蒙大拿州立大学农业实验站资金和Murdock慈善信托设备基金的支持。

根据蒙大拿州立大学人体受试者机构审查委员会批准的方案，采集了健康献血者的肝素化静脉血。所有献血者均签署了书面知情同意书，同意参与本研究。
1. 人多形核白细胞的纯化及人血清的分离
注意：所有试剂应使用市售的内毒素检测试剂盒常规检测内毒素的存在，且内毒素含量应低于&#60;25.0 pg/mL，以防止中性粒细胞发生非预期的激活。
<ol>
	<li>将50 mL的3%葡聚糖-0.9% NaCl（w/v）、35 mL的0.9% NaCl（w/v）、20 mL的1.8% NaCl（w/v）、12 mL的1.077 g/mL密度梯度溶液以及20 mL的注射级或灌注级水置于室温。</li>
	<li>为分离人血清，将4 mL新鲜采集的未加抗凝剂的人全血在37 °C下于15 mL玻璃管中孵育30分钟。孵育后，在室温下以2,000–3,000 × g离心10分钟。将上层血清转移至新的15 mL锥形离心管中，并置于冰上。</li>
	<li>在两个重复的50 mL锥形离心管中（每管总体积为50 mL），将25 mL新鲜采集的肝素化（1000单位/mL）人全血与25 mL室温下的3%葡聚糖-0.9% NaCl（1:1比例）混合。通过轻轻摇动每个50 mL锥形管进行混匀，然后在室温下静置30分钟。</li>
	<li>室温孵育后，将出现两层分离的液体。将每管葡聚糖-血液混合物的上层液体转移至新的50 mL锥形管中，在室温下以450 × g离心10分钟，使用低刹车或无刹车。</li>
	<li>小心吸除上清液并弃去，避免扰动细胞沉淀。将每个细胞沉淀轻轻重悬于2 mL室温0.9% NaCl中，将重悬的细胞沉淀合并至一个50 mL锥形管中，然后加入剩余的0.9% NaCl（终体积为35 mL）。</li>
	<li>使用手动移液器，将10 mL室温下的1.077 g/mL密度梯度溶液小心地铺在细胞悬液下方。在室温下以450 × g离心30分钟，使用低刹车或无刹车。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。上清液中含有外周血单个核细胞，可按先前所述方法收集14。</li>
	<li>通过将细胞沉淀重悬于20 mL室温水中以裂解红细胞。轻轻摇动管子30秒进行混匀。红细胞裂解过程中将伴随明显的浊度下降。</li>
	<li>立即加入20 mL室温下的1.8% NaCl（室温[RT]），并在室温下以450 × g离心10分钟。 
	注意：为最大化中性粒细胞（PMN）得率并防止PMN裂解和/或激活，应尽量缩短PMN在水中单独停留的时间。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞沉淀轻轻重悬于2 mL室温RPMI 1640培养基中，并置于冰上。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。将纯化的PMN以1 × 107 个细胞/mL的浓度重悬于冰冻RPMI中，并保持在冰上。</li>
	<li>在两个重复的流式细胞术管中，将100 µL纯化的PMN（1 × 106 个细胞）与300 µL含1 µL碘化丙啶染料的冰冻Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）混合。为建立细胞膜损伤的阳性对照，在其中一个流式细胞术管中加入40 µL 0.5% Triton X-100溶液，并充分混匀。</li>
	<li>使用流式细胞术检测纯化细胞的前向散射、侧向散射及碘化丙啶染色情况（激发/发射最大值为535/617 nm）（图1）。 
	注意：前向散射和侧向散射分析可识别出不需要的淋巴细胞和单核细胞群体。碘化丙啶仅能染色细胞膜受损的细胞；若纯化的PMN中碘化丙啶阳性细胞比例显著升高，则不应使用。在本研究中，仅当纯化细胞中PMN占比&#62;98%且碘化丙啶阳性细胞比例&#60;5%时，才使用该批PMN。</li>
	<li>为进行PMN细胞毒性实验，准备一块96孔板，将用于该实验的各个孔用100 µL以DPBS稀释的20%分离人血清包被。 
	注意：将PMN直接接种于塑料或玻璃表面会导致细胞激活。务必至少设置一个仅加入培养基的阴性对照孔，以及一个加入0.05% Triton X-100的阳性对照孔。</li>
	<li>将板在37 °C孵育30分钟。孵育后，用冰冻DPBS洗涤包被孔两次，以去除多余的血清。轻轻将板倒置拍打以去除残留的DPBS，并将板置于冰上。</li>
	<li>向每个包被孔中轻轻加入100 µL浓度为1 × 107 个细胞/mL的纯化人PMN（每孔1 × 106 个PMN）。将板置于冰上孵育至少5分钟，使PMN沉降至孔底。保持板面水平，以确保细胞在各孔中均匀分布，并始终置于冰上以避免PMN发生非特异性激活。</li>
</ol>
2. 金黄色葡萄球菌S. aureus胞外蛋白对人多形核白细胞的细胞毒性检测
<ol>
	<li>培养 S. aureus 在37 °C摇床培养箱中，于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中过夜培养。在这些研究中，分别在150 mL锥形瓶中加入20 mL TSB，并接种冻存的菌种培养物 S. aureus 菌株 USA300 或 USA300ΔsaeR/S 并在250 rpm振荡条件下培养约14小时。</li>
	<li>传代培养 S. aureus 通过将过夜培养的细菌培养物用新鲜培养基进行1:100稀释。在37 °C条件下振荡培养，直至细菌达到早期稳定生长期。 
	注意：在这些实验中，将200 µL过夜培养的USA300或USA300Δ菌液接种至装有20 mL胰蛋白胨大豆肉汤的150 mL锥形瓶中saeR/S 37 °C、250 rpm 振荡培养 5 小时。</li>
	<li>当细菌达到早期稳定生长期时，转移1 mL的传代培养液 S. aureus 加入1.5 mL微量离心管中，于5,000 × g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>离心后，将上清液转移至一支3 mL注射器中。将上清液经0.22 µm滤膜过滤，收集至预冷的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>用预冷的培养基对上清液进行系列稀释 S. aureus. 
	注意：对于所示实验，采用的是来自 USA300 和 USA300Δ 的上清液saeR/S 用预冷的TSB进行连续四次1/2 log稀释。</li>
	<li>轻轻将上清液样本或单独的培养基（用于阴性与阳性对照）加入含有来自步骤1.15的冰上中性粒细胞（PMNs）的96孔板的各个孔中。在这些实验中，加入10 µL的USA300或USA300ΔsaeR/S 将上清液样品加入各孔中。轻轻摇动酶标板，使上清液在孔中均匀分布，于37 °C孵育。</li>
	<li>在预定时间将培养板从培养箱中取出，置于冰上。向阳性对照孔中加入 40 µL 的 0.5% Triton X-100。</li>
	<li>轻轻吹打每个孔中的样品，使粘附在板上的所有中性粒细胞完全脱落，然后将样品转移至含有300 µL冰冻DPBS和1 µL碘化丙啶的预冷流式管中，置于冰上。</li>
	<li>使用流式细胞术测定碘化丙啶阳性中性粒细胞（PMNs）的比例图2A与DNA结合后，碘化丙啶的激发/发射波长为535/617 nm。</li>
</ol>
3. S. aureus 吞噬作用后针对人多形核白细胞的细胞毒性检测
注意：在开始本实验之前，必须通过实验确定待测金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株在600 nm处的光密度（OD600）与细菌浓度所定义的生长曲线。实验成功的关键在于，使用继代培养细菌的OD600值，始终在对数生长中期收获浓度相等的各株金黄色葡萄球菌（S. aureus）。
<ol>
	<li>按照步骤 2.1.1 和 2.1.2 所述方法，启动 S. aureus 菌株的过夜培养，并进行细菌的传代培养。</li>
	<li>当传代培养的 S. aureus 达到对数中期生长时，取 1 mL 培养菌液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟，收集菌体。 
	注：在我们的培养条件下，USA300 和 USA300ΔsaeR/S 菌株在培养约 135 分钟后进入对数中期6。</li>
	<li>离心后，通过吸除上清液，将菌体沉淀重悬于 1 mL DPBS 中，涡旋振荡 30 秒，再在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟，洗涤 S. aureus。</li>
	<li>用含 20% 人血清的 DPBS 稀释液 1 mL 重悬菌体沉淀，于 37 °C 振荡孵育 15 分钟，对 S. aureus 进行调理。</li>
	<li>将调理后的细菌在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟。离心后吸除上清液，将菌体沉淀重悬于 1 mL DPBS 中，涡旋振荡至菌体沉淀完全分散后再继续振荡 30 秒，随后在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将调理后的 S. aureus 菌株重悬于 1 mL RPMI 培养基中，涡旋振荡至菌体沉淀完全分散，再继续振荡 30 秒。将细菌置于冰上。</li>
	<li>用预冷的 RPMI 将调理后的 S. aureus 菌株稀释至所需浓度，涡旋振荡 30 秒后置于冰上。</li>
	<li>通过将细菌进行 10 倍系列稀释后涂布于胰蛋白胨大豆琼脂平板，确认调理后 S. aureus 的浓度。 
	注：由于本实验中使用的细菌浓度差异会显著影响后续中性粒细胞（PMN）质膜通透性（图 3A），因此每次实验均需测定各菌株的实际浓度，并确保各菌株间浓度一致。</li>
	<li>从步骤 1.14 中取出置于冰上的 96 孔板，向每孔轻柔加入 100 µL 各 S. aureus 菌株或 RPMI（用于阳性和阴性对照）。轻柔摇动培养板，使 S. aureus 在孔内均匀分布。</li>
	<li>将培养板在 4 °C 下以 500 × g 离心 8 分钟，同步启动吞噬作用15。离心后立即转移至 37 °C 培养箱中孵育（T = 0）。</li>
	<li>在预定时间点，将培养板从孵育箱中取出并置于冰上，向阳性对照孔中加入 40 µL 0.5% Triton X-100。</li>
	<li>用移液器轻柔吹打各孔样品，彻底脱离附着在板上的所有 PMN，然后将样品转移至含有 200 µL 预冷 DPBS 和 1 µL 碘化丙啶的流式细胞术管中，置于冰上。</li>
	<li>按照步骤 2.9 所述方法，使用流式细胞术分析样品的碘化丙啶染色情况。</li>
</ol>

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<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SaeR%2FS+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了从人血中纯化中性粒细胞（PMNs）的方法，以及两种利用碘化丙啶（propidium iodide）定量S. aureus对这些重要先天免疫细胞细胞毒性的不同检测方法。这些实验的成功取决于所纯化PMNs的质量，以及S. aureus及其病原体分泌的胞外蛋白的适当制备。在PMN分离过程中，为尽量减少细胞在纯化期间及之后的激活，应使用无内毒素污染的试剂，轻柔处理细胞样品，并将细胞保持在适宜温度。PMN被激活的表现包括纯化过程中出现细胞聚集，以及超过5%的分离细胞碘化丙啶染色呈阳性。由于PMNs的寿命相对较短，必须在同一天内完成从人血中分离并进行实验检测。若纯化后的PMNs在冰上放置超过3小时，将开始出现自发性凋亡的迹象。如前所述，每次PMN制备均需通过流式细胞术分析前向散射（forward scatter）和侧向散射（side scatter），并结合碘化丙啶染色，仔细评估细胞的纯度和完整性。
S. aureus 表达的双组分白细胞毒素是导致本实验方案所述检测方法中观察到的大多数中性粒细胞（PMN）质膜完整性受损的原因。不同 S. aureus 菌株之间这些毒素以及其他成孔肽（如酚溶性调节因子）的表达差异，会导致对人中性粒细胞细胞毒性的不同。此外，S. aureus 菌株在体外培养过程中的显著生长差异也会影响成孔毒素的表达及其后续的细胞毒性效应。同时，在吞噬实验中，S. aureus 与中性粒细胞的比例对中性粒细胞质膜通透性具有重大影响（图3A），因此这些实验要求在对数生长中期，通过测定传代培养细菌的 OD600 值，一致地收获每种测试 S. aureus 菌株的相等浓度。鉴于上述因素，在开展细胞毒性检测之前，为所有待检菌株建立生长曲线至关重要。我们不建议将这些方法用于分析在体外生长特性存在显著差异的 S. aureus 菌株的细胞毒性。
USA300 是一种具有强毒力的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）分离株，已知其对人多形核中性粒细胞（PMNs）具有高度细胞毒性15，而在该菌株中缺失 SaeR/S 会显著降低多种双组分白细胞毒素的转录水平，这些毒素以人 PMNs 为靶标6,12，因此这些菌株是利用本文所述检测方法比较细胞毒性的理想模型。然而，不同金黄色葡萄球菌（S. aureus）分离株之间存在广泛的遗传变异，当使用其他 S. aureus 菌株进行测试时，本方案中详述的参数可能不会导致对人 PMNs 细胞毒性的显著变化。在使用其他 S. aureus 菌株时，可能需要调整培养条件、上清液添加体积或细菌与 PMNs 的比例，以确保这些方法的成功应用。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
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Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

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Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus 是一种革兰氏阳性细菌，可引起人类多种疾病。这种重要的病原体可产生大量毒力因子，参与感染的不同阶段。这些因子包括使S. aureus能够黏附于不同类型宿主组织的表面分子1、干扰宿主免疫反应的胞外蛋白2，以及一系列靶向不同宿主细胞的分泌性毒素3。本报告中，我们描述了一种定量检测S. aureus产生的胞外蛋白对人多形核白细胞（PMNs，即中性粒细胞）——宿主先天免疫反应的主要效应细胞——细胞毒性的方法。
中性粒细胞（PMNs）是哺乳动物中最丰富的白细胞。这些循环免疫细胞会迅速被招募到宿主组织受损部位，以响应由常驻细胞产生的危险信号或入侵微生物所特有的化合物。在血管外渗过程中，这些分子的胞外输入以及与活化的宿主常驻细胞的直接接触，会增强中性粒细胞的活化状态，该过程称为“启动”4,5。已启动并到达受损组织的中性粒细胞随后执行重要的固有免疫反应，旨在防止感染的发生。这些反应包括对入侵微生物的结合与内吞（即吞噬作用），从而触发一系列胞内事件，最终通过多种强效抗菌化合物的联合作用将微生物杀灭5。
中性粒细胞（PMNs）在保护人类免受入侵病原体感染方面发挥着至关重要的作用，尤其在预防S. aureus感染中具有重要意义4。然而，这种细菌可产生多种毒力基因，干扰中性粒细胞的不同功能。这些毒力因子包括可阻断信号分子识别、阻止细菌在宿主组织上黏附、抑制抗菌化合物生成以及破坏细胞质膜完整性的胞外蛋白4。S. aureus通过多个双组分感应系统共同感知特定环境信号，进而协调这些毒力基因的时序性表达。其中，SaeR/S双组分系统是感染过程中调控S. aureus毒力基因转录的主要正向调节因子6,7,8,9,10,11。特别是，该双组分系统已被证实对产生特异性靶向人中性粒细胞的双组分杀白细胞素至关重要12。
本方案分为三个不同部分。第一部分描述了使用密度梯度离心法从人血液中纯化中性粒细胞（PMNs）的方法，该方法改编自Bøyum13 和 Nauseef14 建立的技术。第二和第三部分详细介绍了两种不同的技术，用于检测 S. aureus 的细胞毒性；一种是利用 S. aureus 产生的胞外蛋白对 PMNs 进行中毒处理，另一种则是考察活细菌在被吞噬后对 PMNs 的损伤能力。这些实验通过碘化丙啶（propidium iodide）来检测由 S. aureus 孔道形成毒素引起的 PMN 质膜完整性的丧失。碘化丙啶是一种DNA结合型荧光染料，通常不能穿透细胞膜，但可进入因 S. aureus 毒素作用而受损的细胞质膜。通过流式细胞术分析，可快速定量碘化丙啶阳性的PMNs，从而评估不同 S. aureus 菌株的相对细胞毒性。实验中以耐甲氧西林 S. aureus（MRSA）菌株USA300（经脉冲场凝胶电泳鉴定）及其在 saeR/S 基因位点的同源缺失突变体（USA300ΔsaeR/S）作为模型，展示这些方法如何定量 S. aureus 对人PMNs的细胞毒性。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠注射液，USP，500 mL VIAFLEX 塑料容器</td><td>Baxter</td><td>2B1323Q</td><td>中性粒细胞纯化</td></tr><tr><td>1.5 mL 带 snap cap 的微量离心管</td><td>VWR</td><td>89000-044</td><td>用于洗涤细胞</td></tr><tr><td>1.8% 氯化钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>中性粒细胞纯化</td></tr><tr><td>12x75 mm 培养管</td><td>VWR</td><td>60818-430</td><td>用作流式细胞术检测管</td></tr><tr><td>20% (w/w) 葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8802</td><td>中性粒细胞纯化</td></tr><tr><td>3125 手动计数器</td><td>Traceable Products</td><td>3125CC</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td>用于分装培养基</td></tr><tr><td>Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤，大豆-酪蛋白消化物培养基</td><td>FischerScientific</td><td>211823</td><td>用于细胞培养增殖</td></tr><tr><td>BD 带鲁尔锁扣头的一次性注射器，3 mL</td><td>FischerScientific</td><td>BD 309657</td><td>用于过滤上清液</td></tr><tr><td>Bright-Line 血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>细胞计数装置</td></tr><tr><td>含钙镁的 1x DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水）</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>用于洗涤细胞</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>中性粒细胞纯化</td></tr><tr><td>Fisherbrand 无菌聚苯乙烯一次性移液管</td><td>FischerScientific</td><td>13-678-11E</td><td>用于吸取液体</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 孔板</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0687</td><td>用于盛放实验样品的培养板</td></tr><tr><td>OMICRON 注射器滤器</td><td>Omicron Scientific</td><td>SFPV13R</td><td>用于过滤上清液</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3566</td><td>细胞膜非通透性 DNA 染料</td></tr><tr><td>PYREX 品牌 4980 锥形瓶</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-34503-24</td><td>用于细胞培养增殖</td></tr><tr><td>RPMI 1640，1X，不含 L-谷氨酰胺和酚红</td><td>Corning</td><td>17-105-CV</td><td>用于重悬细胞</td></tr><tr><td>无菌冲洗用水，USP</td><td>Baxter</td><td>2F7113</td><td>中性粒细胞纯化</td></tr><tr><td>移液器辅助泵</td><td>Bel-Art Products</td><td>F37898</td><td>用于吸取液体</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>细胞膜完整性阳性对照</td></tr></tbody></table>

量化细胞毒性 金黄色葡萄球菌 抗人多形核白细胞

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus 能够分泌多种靶向并破坏多形核白细胞（PMNs 或中性粒细胞）膜完整性的白细胞毒素。本实验方案分为三个部分，分别描述了人源 PMNs 的纯化方法以及 S. aureus 对 PMNs 细胞毒性的定量检测。第 1 部分详细介绍了通过密度梯度离心法从人血液中分离 PMNs 和血清的方法。第 2 部分检测 S. aureus 分泌的胞外蛋白对纯化后人源 PMNs 的细胞毒性。第 3 部分测定活 S. aureus 被吞噬后对人源 PMNs 的细胞毒性。这些实验通过流式细胞术分析经碘化丙啶（propidium iodide）染色的 PMNs，检测 S. aureus 白细胞毒素对 PMN 细胞膜完整性的破坏作用；碘化丙啶是一种不能穿透完整细胞膜的 DNA 结合荧光染料。总体而言，这些方法能够快速评估 S. aureus 对原代人源 PMNs 的细胞毒性，且易于拓展应用于宿主-病原体相互作用其他方面的研究。

我们已展示了如何利用上述方法相对定量细胞毒性的程度 S. aureus 使用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PFGE型USA300及其等基因缺失突变株对抗人中性粒细胞 saeR/S 在此菌株（USA300ΔsaeR/S) 此前研究中产生的6采用本方案第1节所述方法分离的中性粒细胞经碘化丙啶染色后，通过流式细胞术进行检测。利用前向散射与侧向散射图分析纯化中性粒细胞中单核细胞或淋巴细胞的污染情况图1A，B）并使用碘化丙啶染色测定中性粒细胞的完整性（图1C). 所述的人类中性粒细胞（PMN）纯化方法可稳定获得 0.5 x 107 至 1 × 108 中性粒细胞 &gt;98% 纯度，且为 &gt;95% 碘化丙啶染色阴性。
通过本方案第2节所述步骤，检测了USA300和USA300ΔsaeR/S产生的胞外蛋白对纯化中性粒细胞（PMN）的细胞毒性（图2）。这些实验表明，在与USA300产生的胞外蛋白共同孵育30分钟后，纯化的PMN中碘化丙啶染色呈浓度依赖性增加（图2B）。先前研究表明，SaeR/S双组分系统在多种靶向人PMN的双组分白细胞素的表达中具有重要作用6,10,11,16。与这些先前发现一致的是，在暴露于USA300ΔsaeR/S产生的胞外蛋白后，检测到的碘化丙啶阳性PMN极少（图2B）。进一步实验显示，在USA300胞外蛋白作用下，裂解PMN的比例持续上升，并在约30分钟后达到平台期（图2C）。在所有时间点，暴露于USA300ΔsaeR/S产生的胞外蛋白后，人PMN的裂解程度均极低。这些结果说明了该检测方法在相对定量S. aureus胞外蛋白对人PMN细胞毒性方面的实用性。
我们采用本方案第3节所述的S. aureus吞噬后对人中性粒细胞（PMNs）的细胞毒性检测方法，测试了USA300和USA300ΔsaeR/S菌株（图3）。在吞噬USA300后90分钟，碘化丙啶阳性PMNs的比例随细菌浓度增加而升高（图3A）。而在吞噬USA300ΔsaeR/S后，碘化丙啶阳性PMNs的比例显著降低（图3A），这一结果支持其他研究发现，表明SaeR/S双组分系统在S. aureus对人PMNs的细胞毒性中具有重要作用（图2）7,11。如前所述并如图3A所示，S. aureus浓度的差异对吞噬后PMNs裂解程度具有显著影响。对各实验中使用的USA300和USA300ΔsaeR/S接种物浓度进行计数后表明，这两种菌株间细胞毒性的差异并非由所用细菌浓度不同所致（图3B）。这些结果表明，S. aureus吞噬后对人PMNs的细胞毒性检测可用于评估不同S. aureus菌株破坏人PMNs质膜完整性的能力。
<img alt="用于细胞群体分析的流式细胞术散点图和直方图；粒细胞、单核细胞、碎片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：纯化中性粒细胞的流式细胞术分析。 流式细胞术散点图代表性结果显示：（A）纯化的人中性粒细胞和（B）人为污染外周血单个核细胞的中性粒细胞。（C）代表性流式细胞术直方图显示纯化中性粒细胞（灰色阴影）的碘化丙啶染色极少（&lt;1%），与经 0.05% Triton X-100 处理的中性粒细胞（红色阴影）相比。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用碘化丙啶进行流式细胞术分析；评估USA300细菌膜完整性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：金黄色葡萄球菌（S. aureus）分泌的胞外蛋白对中性粒细胞（PMNs）毒性作用的流式细胞术分析。（A）中性粒细胞经碘化丙啶染色后，在与对照培养基（蓝色阴影）、过滤后的USA300上清液（终浓度1:110，灰色阴影）或0.05% Triton X-100（红色阴影）孵育30分钟后，具有代表性的流式细胞术直方图。（B）中性粒细胞与不同浓度的USA300或USA300∆saeR/S上清液孵育30分钟后，碘化丙啶阳性细胞所占比例。（C）中性粒细胞与USA300或USA300∆saeR/S上清液（终浓度1:110）孵育后，随时间变化的碘化丙啶阳性细胞比例。数据以至少3次独立实验的均值±标准误表示，* p ≤ 0.05，** p ≤ 0.005，采用双尾t检验确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌与中性粒细胞相互作用；柱状图；碘化丙啶阳性百分比；CFU/mL 浓度；USA300，ΔsaeR/S" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：中性粒细胞吞噬作用后的流式细胞术分析 S. aureus. (A) 吞噬不同浓度的 USA300 或 USA300∆ 后 90 分钟，碘化丙啶阳性中性粒细胞的比例saeR/S (B) 包被抗体的浓度 S. aureus 用于图A所示实验的菌株。数据表示为4次独立实验的平均值±标准误，通过双尾t检验确定，* p ≤ 0.01。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种从全人血中纯化多形核白细胞的方法，以及两种定量检测其细胞毒性的实验。 金黄色葡萄球菌 针对这些重要的天然免疫细胞。

金黄色葡萄球菌能够分泌多种杀白细胞素，这些毒素可靶向并破坏多形核白细胞的细胞膜完整性……

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，可产生多种毒力因子，促进其致病过程。这些因子包括双组分白细胞毒素，可破坏多形核白细胞（也称为PMN或中性粒细胞）的膜完整性。本视频展示了从中性粒细胞全血中分离PMN的方法，以及两种用于定量金黄色葡萄球菌对这些重要先天免疫细胞毒性的独立检测方法。这些检测均可使用常规实验室设备完成，并可轻松调整以研究宿主与病原体相互作用的其他方面。本实验将使用从人类供体采集的全血，需获得相应机构委员会或审查委员会的批准，以及声明已从所有参与者获得知情同意。该实验方案的第一步是通过离心和密度梯度法分离中性粒细胞。首先，将 50 毫升 3% 右旋糖酐-0.9% 氯化钠溶液、35 毫升 0.9% 氯化钠溶液、20 毫升 1.8% 氯化钠溶液、12 毫升 1.077 克/毫升的菲可溶液以及 20 毫升水置于室温。将 25 毫升新鲜采集的肝素抗凝全血转移至两个锥形离心管中。将 25 毫升新鲜采集的肝素抗凝全血与等体积（25 毫升）室温的 3% 右旋糖酐-0.9% 氯化钠溶液按 1:1 比例混合。轻轻摇动每个50毫升锥形管以混匀，然后在室温下静置30分钟。室温孵育后，将出现两层分离的液体。将每份葡聚糖血液混合物的上层转移至新的50毫升锥形管中。在室温下以450 g离心10分钟，离心时设置低减速或不减速。小心吸除上清液并弃去，注意不要扰动细胞沉淀。将每份细胞沉淀轻轻重悬于2毫升0.9%氯化钠溶液中。将重悬的沉淀合并至一个50毫升的锥形管中，然后加入剩余的0.9%氯化钠溶液，定容至终体积35毫升。使用手动移液器，将10毫升密度为1.077克/毫升的Ficoll溶液小心地铺在细胞悬液下方。在室温下以450 ×g离心30分钟（低速或无刹车），随后轻轻吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，操作方法如前所示。通过将细胞沉淀重悬于20毫升室温水中来裂解红细胞。轻轻摇动30秒进行混匀。立即加入20毫升1.8%氯化钠溶液，并在室温下以450 ×g离心10分钟。小心吸取上清液，操作如前所示。用 2 毫升室温 RPMI 轻柔重悬细胞沉淀，并置于冰上。使用血细胞计数板对细胞进行计数。将纯化的中性粒细胞用预冷的RPMI重悬，浓度为每毫升1×10⁷个细胞，并置于冰上保存。取100 µL纯化的中性粒细胞与300 µL含1 µL碘化丙啶染料的DPBS混合，分装至两支流式细胞术检测管中，每管设两个重复。作为阳性对照，向其中一支流式细胞术检测管中加入40 µL 0.5% Triton X-100溶液，并充分混匀。采用流式细胞术检测前向散射光、侧向散射光及碘化丙啶染色情况，以评估分离所得中性粒细胞的纯度和完整性。仅可使用纯度高于98%且碘化丙啶阴性率高于95%的中性粒细胞样本。有关正常人血清分离的详细方案，请参阅完整论文。通过向将用于本实验的各个孔中加入100微升用DPBS稀释的20%分离人血清，准备用于中性粒细胞（PMN）细胞毒性检测的96孔板。务必至少设置一个仅加入培养基的阴性对照孔，以及一个加入0.05%Triton X的阳性对照孔。将板在37摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，用100微升预冷的DPBS洗涤标记孔两次，并将板置于冰上。从孔板各孔中移除残留的DPBS，轻柔地向每个编码孔中加入100微升纯化的人中性粒细胞（PMNs），细胞浓度为每毫升1×10⁷个细胞。将接种后的中性粒细胞置于冰上至少5分钟，使其充分沉降，随后用于以下细胞毒性检测。本部分描述了一种定量检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的胞外蛋白对人中性粒细胞细胞毒性的实验方法。实验前一天，在37°C摇床培养箱中，使用适当的培养基过夜培养金黄色葡萄球菌（S.aureus）。将过夜培养的菌液用新鲜培养基按1:100比例稀释，进行转接培养。在37°C条件下振荡培养，直至细菌达到早期稳定生长期。培养5小时后，取1毫升S.aureus子培养物转移至1.5毫升微量离心管中，在室温下以5,000 g离心5分钟。离心后，吸除上清液。将吸除的上清液通过0.22微米注射器滤器过滤至新的1.5毫升微量离心管中，并置于冰上。用冰上预冷的培养金黄色葡萄球菌的培养基对上清液进行系列稀释。按照前述方法，将上清液样本或用于阴性和阳性对照的培养基轻柔地加入含有中性粒细胞（PMNs）的96孔板的各个孔中，并将板置于冰上。轻柔振荡平板，使上清液在各孔中均匀分布，随后在37°C下孵育。在预定时间将培养板从培养箱中取出，置于冰上。向每根流式细胞术检测管中加入含有1微升碘化丙啶的300微升预冷DPBS溶液。将样品转移至盛有冰的流式细胞术检测管中。对于阳性对照孔，在转移至流式细胞术检测管之前，向样品中加入 20 微升 10% Triton X。使用流式细胞术分析中毒性中性粒细胞的碘化丙啶染色情况。本部分描述了一种定量测定人中性粒细胞吞噬后金黄色葡萄球菌（S.aureus）细胞毒性的实验方法。在本实验中使用相关金黄色葡萄球菌菌株之前，必须测定其在600纳米处的光密度和细菌浓度所定义的生长曲线。按照前述方法启动金黄色葡萄球菌菌株的过夜培养，并进行细菌传代培养。当传代培养的金黄色葡萄球菌达到对数生长中期时，将一毫升培养物转移至1.5毫升微量离心管中，并在室温下以5,000 g离心五分钟。用移液管吸去金黄色葡萄球菌的上清液，注意不要扰动菌体沉淀，然后将沉淀的细菌重悬于1毫升DPBS中。将样品涡旋振荡30秒。在室温下以5,000 g离心5分钟。为了对金黄色葡萄球菌进行氧化处理，首先将细菌沉淀物重悬于1毫升20%人血清中。然后在37°C条件下振荡孵育15分钟。随后通过离心洗涤氧化处理后的金黄色葡萄球菌，步骤如前所述。用预冷的RPMI培养基将氧化应激处理的金黄色葡萄球菌菌株稀释至每毫升1 × 10⁸个菌落形成单位（CFUs）。涡旋振荡样品30秒后置于冰上。通过将细菌进行10倍系列稀释后涂布于琼脂平板，确认本实验所用金黄色葡萄球菌的浓度。从步骤1.14中，将每种金黄色葡萄球菌菌株或用于阳性和阴性对照的RPMI培养基，以每孔100 µL的体积轻轻加入置于冰上的96孔板中的PMNs细胞中。轻轻摇动培养板，使金黄色葡萄球菌在各孔中均匀分布。通过在4°C条件下以500 ×g离心8分钟同步吞噬作用，并在离心结束后立即将培养板转移至37°C孵育，此时间点记为时间零点。在预定的时间点，将培养板置于冰上，向每根流式细胞管中加入含有1 µL碘化丙啶的200 µL冰冻DPBS，然后将样品转移至对应的管中。按照2.8和2.9步骤所述，通过流式细胞术分析样品的碘化丙啶染色情况。金黄色葡萄球菌（Staph aureus）产生的双组分白细胞毒素在靶向人中性粒细胞（PMNs）时，需要SA或S2组分系统，以展示本研究所述检测方法在量化金黄色葡萄球菌对人PMNs细胞毒性的应用价值。这些实验采用一种临床相关的金黄色葡萄球菌（Staph aureus）分离株进行，该菌株被鉴定为USA300，并在该菌株中构建了SA或S的同源缺失突变体。左图显示的是纯化的中性粒细胞（PMNs），右图则作为示例展示了人为污染的样本。使用本方案第一部分所述方法分离的PMNs，经碘化丙啶染色后，通过流式细胞术进行检测。多年来，前向散射和侧向散射图用于检测第1A和1B年纯化中性粒细胞（PMNs）时是否存在单核细胞或淋巴细胞污染。通过碘化丙啶染色法评估PMN的完整性。采用所述的人中性粒细胞纯化方法，我们能够稳定地分离出 5 × 10⁷ 至 1 × 10⁸ 个中性粒细胞，纯度超过98%，且碘化丙啶阴性率超过95%。检测了USA300及其AsaeR/S突变株产生的胞外蛋白对纯化中性粒细胞（PMNs）的细胞毒性。这些实验表明，在与USA300产生的胞外蛋白共同孵育30分钟后，纯化的PMNs中碘化丙啶染色呈浓度依赖性增加，而与AsaeR/S突变株的胞外蛋白孵育则未观察到此现象。进一步实验显示，经USA300胞外蛋白处理后，碘化丙啶阳性的PMNs比例持续上升，并在约30分钟后达到平台期。在暴露于AsaeR/S突变株产生的胞外蛋白后，所有时间点均观察到人PMNs的碘化丙啶染色极少。最后，检测了USA300及AsaeR/S突变株在同步吞噬后对PMNs的细胞毒性，发现在吞噬USA300后90分钟，碘化丙啶阳性的PMNs比例呈浓度依赖性增加。而在吞噬AsaeR/S突变株后，碘化丙啶阳性的PMNs数量显著减少。在每项实验中，均对USA300和AsaeR/S突变株的接种物进行了计数，结果表明，这些菌株之间的细胞毒性差异并非由所用细菌浓度的不同所致。本方案描述了从人血中纯化中性粒细胞（PMNs）的两种方法，并介绍了定量检测金黄色葡萄球菌（S. aureus）对这些天然免疫细胞细胞毒性的两种技术。这些实验操作的成功取决于所纯化PMNs的质量，以及金黄色葡萄球菌或其上清液的适当制备。进行这些实验操作时，请参考完整论文中需要考虑的重要事项。USA300 是一种具有强毒力的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）分离株，而 AsaeR/S 的缺失会显著降低针对人多形核中性粒细胞（PMNs）的毒力因子转录水平，因此这些菌株是使用所述检测方法比较细胞毒性的理想模型。当使用其他金黄色葡萄球菌（Staph aureus）菌株时，可能需要调整培养条件、上清液添加体积或细菌与PMNs的比例。

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