使用有条件Cas9稳定评估基因功能的新工具包

这种方法提供快速，温度控制的CRISPR-Cas9基因编辑下的小分子，盾牌-1。在将其与Cas9的构成激活进行比较时，它还提供了更少的脱靶效应、更低的细胞毒性，以及更高的内部控制基因编辑。这种粒子的主要优点是，它可用于基本基因的表征，以及肿瘤存活基因。

破坏DD-Cas9的稳定与其表达无关，这允许在同一促进者下共同表达感兴趣的基因。这种方法可以很容易地应用于体内和体外研究。盾牌-1也可以穿透血脑屏障，这使得研究参与大脑发育的基因也变得容易。

均匀地播种健康的 HEK293T 细胞，密度为每 10 厘米组织培养板 10 到 200 万细胞，使用 10 毫升葡萄糖 DMEM 和 10% 过滤 FBS。在组织培养孵化器中将细胞在5%的二氧化碳和37摄氏度下孵化20小时。第二天，确认细胞通过亮场显微镜达到70%的汇合度，并且它们均匀地分散在板块中。

在转染前一小时更换介质，最终体积为 10 毫升。准备两个管与500微升的温暖介质。加入25微升转染试剂管一，并在室温下孵育5分钟。

在另一根管子上，加入质粒的混合物。将一管一与管二混合，形成转染混合物，并在室温下孵育20分钟。将转染混合物滴入 HEK293T 细胞，并在组织培养培养器中孵化板。

18 小时后，小心地将介质换成 10 毫升新鲜 DMEM，并配以 10% FBS 以去除转染试剂。在接下来的48小时内孵育细胞。48 小时后，用 10 毫升注射器收集超高纳坦，并通过 0.45 微米过滤器将其传递。

阿利奎特病毒超高，并储存在零下80摄氏度。为了确定病毒滴答机，将每口井的500万个HED293T细胞种子成两个六井板。在37摄氏度和5%的二氧化碳照时将两个板块孵化过夜，达到50%至60%的汇流。

第二天，使用六井板块中的一个来计算六口井中的细胞。解冻用于执行序列稀释的病毒，每毫升聚乙烯试剂添加 8 微克，用 10% FBS 制备 DMEM 以连续稀释病毒，并添加聚乙烯试剂。在含有介质的聚乙烯中，准备 0.1 到 0.0001 的 10 倍系列稀释的两毫升。

从六井板中取出介质，在井中加入一毫升病毒稀释剂，留下一口井，单独将介质作为负控制，一口井与 100% 病毒一起。孵育细胞24小时。第二天，从六井板中取出带有病毒的介质，并将其换成两毫升的新鲜 DMEM，并配以 10% FBS。

孵育细胞48至72小时，每天用荧光显微镜观察GFP。48 至 72 小时后，分离细胞，并在最大缓冲区重新悬浮。使用流细胞计确定 GFP 表达的百分比，并使用文本手稿中给出的公式计算病毒滴答声。

将细胞系在10厘米的板中镀上，在一夜之间孵育，达到50%至60%的汇合，然后在10毫升的培养介质中感染500至2000微升病毒颗粒的细胞。孵育病毒介质24小时。第二天，将病毒介质更改为培养介质，并使用流细胞学确定 GFP 阳性细胞的百分比。

使用 BD FACSARIA II 进行细胞分拣，选择 GFP 阳性细胞。扩大积极选择的细胞并冻结库存。在感染后24小时内，将积极选择的细胞和未转化的细胞分别镀在12井板中。

等到细胞连接并改变介质到含有200纳米摩尔盾-1的细胞培养介质。用转导和未转化的细胞替换板中的介质，每个板材留下两口井，并作为负控。在将盾-1加入井中后，在零、二、六、十二、二十四、四十八和七十二小时内从每口井中孵育和提取蛋白质。

然后从其他油井中取出带有 Shield-1 的介质，并将其更改为常规细胞介质。在改变介质后2小时、6小时和12小时从这些井中收集蛋白质。Cas9蛋白的诱导被证实其表达水平在转导细胞和车辆之间相似，尽管存在或不存在盾-1。

使用 Shield-1 治疗两小时后，在转导的 A549 细胞系中充分感应了 Cas9 表达，在盾牌-1 退出后 6 到 12 小时内，该表达可以忽略不计的。Shield-1 治疗的转导 A549 细胞在 48 小时后数量减少，而不影响 Rinella 样本，该样本通过使用抗体对抗耗尽的 RPA3 蛋白进行免疫膨胀验证。基因编辑反转或内德尔突变通过测量师核酸酶检测得到确认。

所设计的伦蒂病毒载体结构是一个双生体系统，在同一EF-1a促进器下具有另一个感兴趣的基因。一种改良的荧光蛋白P2A被添加到追踪受感染的细胞中。在车辆和 A549 转导细胞中观察到 mVenus 蛋白质的表达，独立于 DD-Cas9 表达和盾牌-1 治疗。

使用 DD-Cas9 矢量有效导电细胞线是限制速率的步骤之一，因为具有健康的 HEK293T 细胞并使用其低通量是至关重要的。DD-Cas9 质粒、包装质粒和包络质粒之间的比例优化对于最佳转化非常重要。但除此之外，稳定DD-Cas9目标细胞所需的盾-1数量也是您需要小心的事情。

DD-Cas9 与 Cre 质粒也可用，它可用于研究基于 Cre-lox 系统的活体研究中的遗传相互作用。