Name: 使用有条件Cas9稳定评估基因功能的新工具包 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 了解利用小分子Shield-1实现条件性稳定化的CRISPR-Cas9基因编辑技术，该技术可减少脱靶效应和细胞毒性，适用于体外和体内研究，并能穿透血脑屏障以研究脑发育相关基因。

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感谢本实验室的前任成员以及科学家Serif Senturk在前期工作中所做出的贡献。感谢Danilo Segovia对本文稿的审阅与批评指正。本研究的开展与完成得益于Swim Across America以及美国国家癌症研究所癌症靶点发现与开发中心项目的支持。

1. DD-Cas9 载体
<ol>
	<li>从 Addgene 获取 DD-Cas9 载体（含填充序列和 Venus（EDCPV）的 DD-Cas9，质粒编号 90085）。 
	&#8203;注意：这是一种慢病毒 DD-Cas9 质粒，含有 U6 启动子以驱动单导向 RNA（sgRNA）的转录，同时 EFS 启动子驱动 DD-Cas9 的转录。Cas9 的 C 末端带有 DYKDDDDK 序列（flag 标签），其后接有 2A 自剪切肽（P2A），用于分隔 DD-Cas9 与修饰的荧光蛋白 Venus（mVenus）。</li>
</ol>
2. 小向导RNA（sgRNA）设计
<ol>
	<li>使用多种算法之一设计将克隆至 DD-Cas9 载体中的小向导 RNA（sgRNA），以靶向特定基因组区域。 
	注意：为降低脱靶效应，建议通过网站 http://crispr.mit.edu 选择得分最高的 sgRNA 序列。</li>
	<li>为每条 sgRNA 序列设计并订购两条寡核苷酸，以构建完整的 sgRNA。 
	&#8203;注意：由于质粒将被 BsmBI 酶消化，因此在设计正向和反向寡核苷酸时，需在 sgRNA 序列两端添加 BsmBI 酶切黏性末端。请参考表 1中的模板。</li>
</ol>
3. 将sgRNA克隆至慢病毒DD-Cas9载体
<ol>
	<li>去磷酸化5&#8242;使用碱性磷酸酶（FastAP）在限制性内切酶消化反应中对 DD-Cas9 质粒的末端进行去磷酸化。 
	注意：载体在连接过程中可能会重新环化，尤其是在使用单一限制性内切酶线性化时。为防止载体重新环化，可在消化反应中直接加入磷酸酶对质粒进行去磷酸化处理。
	<ol>
		<li>用 BsmBI 酶对质粒进行去磷酸化和消化，制备如下混合物：5 &#181;微克 DD-Cas9 质粒，6 &#181;L 消化缓冲液（10×），0.6 &#181;L DTT（100 mM），3 &#181;BsmBI 的 L，3 &#181;L 的 FastAP，加至 60 &#181;60 微升无核酸酶水 &#181;L 总反应体积。 
		注意：最后将 BsmBI 酶和 FastAP 加入混合物中。</li>
		<li>37℃孵育混合物30分钟&#160;&#176;C 热块或热循环仪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化经消化的 DD-Cas9 质粒。
	<ol>
		<li>制备0.8% DNA琼脂糖凝胶，以去除未完全消化的质粒和酶的残留。使用较宽的胶梳以获得更好的分离效果，并在90 V电压下电泳。</li>
		<li>在360–365 nm紫外光下观察条带，并切下凝胶中较大的质粒条带。弃去对应于填充片段的2 kb片段。</li>
		<li>使用商业化的胶回收试剂盒纯化大片段凝胶条带，并按照制造商的说明进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将退火的寡核苷酸与酶切后的DD-Cas9质粒连接。
	<ol>
		<li>磷酸化并退火sgRNA寡核苷酸。
		<ol>
			<li>准备1的混合物 &#181;T4 连接缓冲液（10 倍浓度）1 L &#181;Oligo 1 的 L（100） &#181;M），1 &#181;Oligo 2 的 L（100） &#181;M），6.5 &#181;无核酸酶水。最后，加入0.5 &#181;L 的 T4 PNK。该反应的总体积为 10 &#181;L.</li>
			<li>将反应混合物加入热循环仪，并设置以下条件：37&#160;&#176;C，30 分钟，95 &#176;C，持续5分钟，然后逐渐降至25 &#176;C，以5的速度 &#176;℃/min 
			&#8203;注意：在将寡核苷酸进行连接之前，必须先将PNK热失活，否则PNK会磷酸化载体。磷酸化步骤与退火步骤在PCR仪中同时进行。sgRNA寡核苷酸5'端添加磷酸基团的磷酸化步骤是连接反应所必需的。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将经消化的DD-Cas9质粒与sgRNA寡核苷酸连接。
		<ol>
			<li>将退火的寡核苷酸用无核酸酶水稀释至1:200，连接反应中使用50 ng质粒DNA。 
			&#8203;注意：使用6个插入片段 : 1个载体的摩尔比，以促进插入片段的连接；或使用连接计算器计算摩尔比：http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation。</li>
			<li>准备连接反应体系：50 ng 经消化和纯化的 DD-Cas9 载体、适量稀释的退火寡核苷酸片段、1 &#181;L T4 连接缓冲液（10 倍浓度），1 &#181;T4 DNA连接酶，最多10 L &#181;加入无核酸酶水，使反应总体积达到10 μL &#181;L.</li>
			<li>如果使用 &#34;高浓度&#34; 连接酶，室温孵育反应5分钟。否则，室温孵育2小时，或为获得更高的连接效率，于16℃孵育 &#176;C 过夜。 
			&#8203;注意：若使用标准 T4 DNA 连接酶，需在 65 ℃ 进行热失活 &#176;C 反应 20 分钟。如果使用连接酶预混液，则无需热失活。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细菌转化
<ol>
	<li>将10 cm LB-氨苄青霉素琼脂平板在室温下预热。</li>
	<li>将50 µL “One shot Stbl3” 感受态细菌细胞在冰上解冻。</li>
	<li>向50 µL感受态细菌细胞中加入2–3 µL连接反应混合物，用手指轻弹管底4次，轻轻混匀。冰上孵育30分钟。</li>
	<li>使用计时器，于精确的42 °C热激40秒，随后将细菌细胞放回冰上冷却5分钟。</li>
	<li>向细菌细胞中加入500 µL不含抗生素的SOC培养基，在37 °C、250 rpm的摇床培养箱中培养45分钟。</li>
	<li>取100 µL转化后的细菌涂布于预热的LB-氨苄青霉素平板上，于37 °C过夜培养。</li>
</ol>
5. 连接质粒的中量/大量提取
<ol>
	<li>准备大提/小提质粒的起始菌液。
	<ol>
		<li>第二天挑取单个细菌克隆，接种至8 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，作为起始培养物。</li>
		<li>将细菌置于摇床中，37 °C、250 rpm振荡培养10–12小时。</li>
		<li>取3–5 mL菌液用于质粒小提，或作为大提质粒的起始菌液。剩余菌液按细菌培养物与甘油体积比1:1加入100%甘油，制备成细菌甘油保存菌种。 
		&#8203;注意：此处我们将描述质粒小提的操作步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒小提操作步骤
	<ol>
		<li>收集3–5 mL细菌细胞，于12,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>用200 µL P1缓冲液（含RNase A，4 °C保存）重悬菌体沉淀。</li>
		<li>加入200 µL P2缓冲液，轻轻颠倒离心管10次，混匀，直至溶液变澄清。</li>
		<li>加入300 µL P3缓冲液，颠倒离心管10次混匀。溶液将变浑浊。立即于12,000 × g离心10分钟。</li>
		<li>将澄清的上清液转移至离心柱中，于12,000 × g离心1分钟。 
		弃去穿流液。 
		&#8203;注意：确保上清液完全澄清。颗粒物可能堵塞离心柱，降低柱子效率。</li>
		<li>加入400 µL PD缓冲液，于12,000 × g离心1分钟。弃去穿流液。</li>
		<li>加入600 µL PW缓冲液洗涤离心柱，于12,000 × g离心1分钟。弃去穿流液。</li>
		<li>将离心柱于最高转速离心3分钟，以去除残留缓冲液。弃去穿流液，并静置2分钟。</li>
		<li>将离心柱转移至新的离心管中，加入50 µL洗脱缓冲液。孵育5分钟后，于最高转速离心2分钟。</li>
		<li>使用Nanodrop仪器测定含sgRNA插入片段的纯化DD-Cas9质粒浓度（ng/µL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过DD-Cas9质粒的DNA测序验证sgRNA的克隆结果。使用表2中的U6引物序列。</li>
</ol>
6. 慢病毒制备
<ol>
	<li>准备用于转染的HEK293T包装细胞。
	<ol>
		<li>使用状态良好的HEK293T细胞（传代次数不超过10代），以每10 cm组织培养皿1-2 × 106个细胞的密度均匀接种。每皿加入10&#160;mL含10%过滤胎牛血清（FBS）的葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。将细胞置于组织培养孵箱中，在5% CO2、37 °C条件下培养20小时。</li>
		<li>次日，通过明场显微镜确认细胞融合度达到约70%，且在培养皿中分布均匀。转染前1小时更换培养基，最终体积为10 mL。 
		&#8203;注意：培养基中不应含有抗生素和抗真菌剂。</li>
		<li>准备两个含有500 µL温热培养基（例如OptiMEM）的离心管。
		<ol>
			<li>向第1管（含500 µL温热培养基）中加入25 µL转染试剂，室温孵育5分钟。</li>
			<li>同时，在第2管中加入质粒混合物：将3.5 µg含克隆sgRNA的DD-Cas9质粒、6 µg包装质粒（psPAX2）和3 µg包膜质粒（pMD2.G）加入500 µL温热培养基中，混匀。&#160;</li>
			<li>将第1管与第2管混合，形成转染混合液，室温孵育20分钟。</li>
			<li>将转染混合液逐滴加入HEK293T细胞中，随后将培养皿置于组织培养孵箱中，在5% CO2、37 °C条件下过夜孵育。</li>
			<li>18小时后，小心更换为10 mL新鲜DMEM（含10% FBS），以去除转染试剂。继续孵育48小时。</li>
			<li>48小时后，用10 mL注射器收集上清液，并通过0.45 µm滤器过滤。</li>
			<li>分装病毒上清液，并于-80 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 使用流式细胞术测定病毒滴度和转导效率
<ol>
	<li>将 HEK293T 细胞以每孔 5 × 105 个细胞的密度接种至 6 孔板中。共接种两块 6 孔板，其中一块用于次日细胞计数。</li>
	<li>将 6 孔板置于 37 °C、95% 湿度、5% CO2 的培养箱中过夜培养，使细胞在次日达到 50–60% 汇合度。</li>
	<li>次日，取其中一块 6 孔板，对 6 个孔中的细胞进行计数。</li>
	<li>解冻用于进行系列稀释的病毒分装液，并加入 8 µg/mL 的聚凝胺（polybrene）试剂。</li>
	<li>配制含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基用于病毒的系列稀释，并加入 8 µg/mL 的聚凝胺试剂。</li>
	<li>在含聚凝胺的培养基中，将慢病毒进行 10 倍系列稀释，制备从 1 × 10-1 到 1 × 10-4 的 2 mL 稀释液。</li>
	<li>吸去 6 孔板中的培养基，向各孔中加入 1 mL 不同稀释度的病毒液。设一孔仅加入培养基作为空白对照，另设一孔加入未稀释的病毒（100% 病毒）。</li>
	<li>将细胞在培养箱中与病毒共孵育 24 小时。</li>
	<li>次日，吸去含病毒的培养基，更换为 2 mL 新鲜的含 10% FBS 的 DMEM 培养基，继续培养 48–72 小时。每天使用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况。</li>
	<li>培养 48–72 小时后，消化细胞并将其重悬于 MACS 缓冲液中。</li>
	<li>使用流式细胞仪测定 GFP 阳性细胞的百分比。</li>
	<li>根据以下公式计算病毒滴度：TU/mL = （转导细胞数 × 荧光阳性率 × 稀释倍数）/（转导体积（mL））</li>
</ol>
8. 靶细胞的慢病毒转导
<ol>
	<li>将目标细胞系接种至10 cm培养皿中，过夜培养，使细胞在次日达到50-60%的融合度。 
	注：我们使用了表达DD-Cas9及两条独立RPA3基因sgRNA的A549细胞系，同时也使用了表达Renilla对照载体的A549细胞系。将这些细胞以2 × 103个细胞/cm2的密度接种，在37 °C、95%湿度、5% CO2条件下过夜培养，使次日细胞融合度达到50-60%。培养基使用含10%过滤胎牛血清的RPMI培养基。后续步骤如下：</li>
	<li>次日，用500-2000 µL病毒颗粒加入至10 mL总体积的培养基中感染细胞，病毒培养基孵育24小时。</li>
	<li>次日，将病毒培养基更换为常规培养基，并通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的比例。</li>
	<li>通过FACS细胞分选或博来霉素筛选富集GFP阳性细胞。</li>
	<li>扩增筛选后的阳性细胞，并冻存细胞储备株。</li>
</ol>
9. Cas9介导基因编辑的条件性诱导
<ol>
	<li>感染后24小时，将经阳性筛选的细胞以及未转导的细胞分别接种至12孔板中。待细胞贴壁后，更换为含有200 nM Shield-1的细胞培养基。在每块板中保留两个孔使用普通培养基作为阴性对照，其余孔分别加入转导和未转导的细胞培养基。</li>
	<li>在加入Shield-1后的不同时间点（0、2、6、12、24、48和72小时）对各孔细胞进行孵育并提取蛋白。</li>
	<li>随后，从其余各孔中移除含Shield-1的培养基，并更换为普通细胞培养基。</li>
	<li>在更换培养基后2、6和12小时，收集这些孔中的蛋白质。</li>
	<li>通过Western印迹分析，检测在添加和撤除配体Shield-1后，不稳定型DD-Cas9蛋白调控的可逆性与快速性。使用靶向DYKDDDDK标签的抗体检测目标蛋白，并以例如β-微管蛋白（beta-tubulin）为靶标的对照抗体作为内参。</li>
	<li>通过Western印迹分析观察剂量-反应曲线，确定Shield-1的最佳使用浓度。</li>
</ol>
10. 基因编辑的验证
注意：GFP 表达检测（如流式细胞术分析和博来霉素筛选标记）仅能确认 CRISPR 试剂成功递送，但无法确定目标序列是否被成功靶向。验证 CRISPR 实验中基因靶向是否成功的最常用检测方法包括 Sanger DNA 测序、下一代测序、Surveyor 核酸酶检测、通过分解追踪插入缺失（TIDE）检测，或蛋白质印迹分析16,17,18。
<ol>
	<li>将经过阳性筛选的细胞接种，并更换为含有200 nM Shield-1的培养基。培养细胞5天，每3天更换一次含Shield-1的培养基。</li>
	<li>在使用Shield-1诱导DD-Cas9 5天后，采用上述验证技术进行检测。</li>
</ol>

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<li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li>
<li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li>
<li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li>
<li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297(2012).</li>
<li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li>
<li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269(2012).</li>
<li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293(2016).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

CRISPR/Cas9 技术彻底改变了对基因组进行功能性研究的能力2。然而，基因的失活常常导致细胞死亡、功能缺陷以及发育异常，从而限制了此类方法在基因功能研究中的应用7。此外，Cas9 的持续表达可能导致细胞毒性以及脱靶效应的产生6。目前已开发出多种方法以实现对 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术的时间控制6。这些系统主要基于对 Cas9 和/或 sgRNA 的转录调控，或 Cas9 在转录后及翻译后的激活机制21,22,23。作为对这些系统的替代，我们开发了一种基于 Cas9 条件性不稳定化的新颖工具包。
本方案的关键步骤是针对特定基因设计至少两个或三个单导向RNA（sgRNA），以避免脱靶效应并促进高...

CRISPR-Cas9 是 &#34;clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9&#34; 的缩写，最初是在细菌适应性免疫系统的研究中被发现的1,2。如今，CRISPR/Cas9 已成为最广为人知的可编程基因编辑工具，该系统的多种改进版本已被开发出来，可用于转录调控和表观遗传修饰3。该技术能够对几乎任何DNA序列进行高度精确的遗传操作4。
CRISPR 基因编辑的核心组分包括可定制的引导 RNA 序列和 Cas9 核酸酶5。该 RNA 引导序列与 DNA 中的靶向互补序列结合，从而引导 Cas9 核酸酶在基因组的特定位点产生双链断裂3,4。随后，该断裂位点通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行修复，从而在靶向的 DNA 序列中引入相应的改变5。
基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术易于使用，且相较于以往的基因编辑技术成本较低，已在多种系统中被证实具有高效性和稳健性2,4,5。然而，该系统仍存在一些局限性。已有研究表明，Cas9的持续表达常导致脱靶效应增加以及细胞毒性升高4,6,7,8。此外，Cas9对必需基因和细胞存活基因的持续靶向会削弱其进行某些功能研究（如细胞死亡动力学研究）的能力7。
为解决上述问题，已开发出多种可诱导或条件控制的CRISPR-Cas9工具6，例如Tet-ON和Tet-Off系统9；位点特异性重组系统10；化学诱导接近系统11；内含肽依赖性剪接系统3；以及基于4-羟基他莫昔芬雌激素受体（ER）的核定位系统12。总体而言，这些方法中的大多数（如内含肽剪接和化学诱导接近分裂系统）无法实现可逆调控，对药物处理的动力学响应较慢（如Tet-On/Off系统），或不适用于高通量操作6。
为克服这些局限性，我们开发了一种新型工具包，不仅能够实现快速、稳健且时间可控的基因编辑，还可确保可追溯性、可调节性以及适用于高通量基因操作。该新型技术可用于细胞系、类器官和动物模型。我们的系统基于一种经过工程改造的结构域，当其与Cas9融合时，可诱导Cas9的快速降解；但可通过一种高选择性、无毒且细胞可渗透的小分子迅速稳定。更具体而言，我们将人源FKBP12突变体“&#34;不稳定结构域&#34;”（DD）与Cas9进行融合，使其在哺乳动物细胞中表达时，通过泛素-蛋白酶体系统实现快速且组成型的降解13。DD的合成配体Shield-1能够稳定DD的构象，从而高效地阻止与DD融合的蛋白（如Cas9）被降解，并具有快速的动力学响应14,15。值得注意的是，Shield-1与突变型FKBP12的结合亲和力比其野生型高出三个数量级14。
DD-Cas9/Shield-1 体系可用于在培养细胞和动物模型中系统性地鉴定和表征必需基因，我们此前已通过条件性靶向线粒体代谢中起重要作用的 CypD 基因、致癌转化中的关键因子 EGFR 以及 DNA 损伤应答中的核心基因 Tp53 证明了这一点。除了实现时间和条件可控的基因编辑外，该方法的另一优势在于 DD-Cas9 的稳定化&#160;不依赖于其转录水平。这一特性使得在相同启动子驱动下，能够共表达可追踪的标记物以及重组酶，例如依赖雌激素受体的重组酶 CREER。在本研究中，我们展示了该方法如何在体外成功应用于条件性靶向 DNA 复制相关基因 RPA3 等示例。

<table><tbody><tr><td>100 mM DTT</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X FastDigest缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>B64</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 连接缓冲液</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>比色BCA试剂盒</td><td>皮尔斯</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，GlutaMax</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10566024</td><td></td></tr><tr><td>FastAP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EF0654</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest BsmBI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FD0454</td><td></td></tr><tr><td>Flag [M2] 小鼠单克隆抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td></td></tr><tr><td>基因组DNA提取试剂盒</td><td>Macherey Nagel</td><td>740952.1</td><td></td></tr><tr><td>lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Phusion高保真DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR &amp;amp; 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>二抗</td><td>LICOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shield-1</td><td>Cheminpharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 感受态细菌细胞</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>SURVEYOR 突变检测试剂盒</td><td>Transgenomic/IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;微管蛋白 [DM1A] 小鼠单克隆抗体</td><td>Millipore</td><td>CP06-100UG</td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用条件性 cas9 稳定化评估基因功能的新工具包

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术已成为在基因组中引入精确且靶向性修饰的常用实验工具。与早期技术相比，该技术因其操作简便和高准确性而迅速普及。然而，该系统的组成型激活限制了其应用范围。本文介绍一种基于Cas9蛋白条件性稳定化实现对CRISPR/Cas9活性进行时间调控的新方法。通过将雷帕霉素结合蛋白FKBP12的工程化突变体融合至Cas9蛋白（DD-Cas9），可实现Cas9的快速降解，而该降解过程可通过添加FKBP12合成配体（Shield-1）得以逆转并稳定Cas9蛋白。与其他可诱导系统不同，该系统可轻松改造为双顺反子系统，用于共表达DD-Cas9与另一个目的基因，同时不对第二个基因进行条件性调控。该方法可构建可追踪的系统，并实现由Cas9核酸酶靶向的等位基因进行平行且独立的操控。该技术平台可用于在体外和体内环境中对必需基因进行系统性鉴定与功能表征，并解析基因间的功能相互作用。

为了实现 Cas9 的条件性表达，我们开发了一种双慢病毒载体系统，该系统包含一个由 U6 启动子驱动的、用于持续表达 sgRNA 的元件，以及一个由 EF-1α 核心启动子驱动的、用于表达 DD-Cas9 融合蛋白的元件（图1A)19. 为阐明该系统的稳健性与高效性，我们利用慢病毒载体对肺腺癌 A549 细胞系进行了转导。通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和使用抗-Flag 特异性抗体的蛋白质印迹法（Western blot analysis），检测了在有或无配体 Shield-1 存在条件下 Cas9 的表达水平。实验以未感染细胞和模拟感染细胞（载体对照）作为对照组。细胞经 10 至 1000 nM 浓度范围的 Shield-1 处理 7 天。结果显示，Shield-1 能够以显著的剂量依赖方式调控 DD-Cas9 的表达（图1B 和 图2A...

本文介绍了一种基于小分子 Shield-1 条件性调控簇状规律间隔短回文重复序列相关蛋白9（Cas9）时空稳定性的基因组编辑工具。该方法可用于培养细胞和动物模型。

一种利用条件性 Cas9 稳定化评估基因功能的新工具包

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术已成为一种广泛应用的实验室……

该方法可在小分子 Shield-1 存在下实现快速、温度可控的 CRISPR-Cas9 基因编辑。与 Cas9 的组成型激活相比，该方法还具有更少的脱靶效应、更低的细胞毒性，以及更高的内部可控基因编辑效率。该技术的主要优势在于可用于必需基因以及肿瘤存活基因的功能表征。DD-Cas9 的去稳定化与其表达水平无关，因此可以在同一启动子下共表达目的基因。该方法可轻松应用于体内和体外研究。Shield-1 还能够穿透血脑屏障，因而也易于研究参与脑发育的基因。使用含10%过滤胎牛血清的葡萄糖DMEM培养基，以每10厘米组织培养皿100万至200万个细胞的密度均匀接种健康的HEK293T细胞。将细胞置于组织培养孵育箱中，在5%二氧化碳和37°C条件下孵育20小时。次日，通过明场显微镜确认细胞密度达到70%融合度，并观察其在培养皿中分布均匀。转染前一小时更换培养基，终体积为10毫升。准备两支试管，每管加入500微升预热的培养基。向第一管中加入25微升转染试剂，室温孵育5分钟。向另一管中加入质粒混合物。将第一管与第二管混合，形成转染混合液，在室温下孵育20分钟。将转染混合液逐滴加入HEK293T细胞中，并将培养板置于组织培养孵育箱中孵育。18小时后，小心更换培养基，加入10毫升含10% FBS的新鲜DMEM，以去除转染试剂。将细胞继续培养48小时。48小时后，用10毫升注射器收集上清液，并通过0.45微米滤膜过滤。将病毒上清液分装后于-80摄氏度保存。为测定病毒滴度，每孔接种500万个HEK293T细胞至两块六孔板中。将两块六孔板于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，使细胞融合度达到50%至60%。第二天，使用六孔板之一计数六个孔中的细胞。解冻将用于进行系列稀释的病毒分装液，加入终浓度为每毫升8微克的polybrene试剂，准备含10%胎牛血清的DMEM培养基用于病毒的系列稀释，并加入polybrene试剂。用含有polybrene的培养基配制2毫升的慢病毒十倍系列稀释液，稀释比例从0.1至0.0001。从六孔板中移除培养基，向各孔中加入一毫升病毒稀释液，留一孔仅加培养基作为阴性对照，另留一孔加入100%病毒。将细胞培养24小时。次日，从六孔板中移除含病毒的培养基，更换为两毫升含10%FBS的新鲜DMEM。将细胞孵育48至72小时，每天使用荧光显微镜观察GFP。孵育48至72小时后，消化细胞并将其重悬于max缓冲液中。使用流式细胞仪测定GFP表达的百分比，并根据文稿中提供的公式计算病毒滴度。将目标细胞系接种于10厘米培养皿中，过夜培养至细胞融合度达到50%至60%。随后用500至2,000微升病毒颗粒感染细胞，总体积为10毫升培养基。病毒感染培养24小时。次日，将病毒培养基更换为普通培养基，并通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的比例。使用 BD FACSAria II 进行细胞分选，筛选出 GFP 阳性细胞。扩增筛选后的阳性细胞并冻存备用。在感染后 24 小时，将筛选后的阳性细胞和未转导的细胞分别接种至 12 孔板中。等待细胞贴壁后，更换为含有200纳摩尔Shield-1的细胞培养基。将转导和未转导细胞的培养板中的培养基更换，每块板保留两个孔使用常规培养基作为阴性对照。在向各孔加入Shield-1后，于0、2、6、12、24、48和72小时分别收集各孔细胞并提取蛋白质。然后从其余孔中移除含有 Shield-1 的培养基，并更换为常规细胞培养基。在更换培养基后 2、6 和 12 小时收集这些孔中的蛋白质。通过检测转导细胞与对照细胞中 Cas9 蛋白的表达水平，确认其诱导表达情况，结果显示无论是否存在 Shield-1，Cas9 蛋白的表达水平均相似。在用Shield-1处理转导的A549细胞系两小时后，Cas9表达出现充分诱导，撤除Shield-1后6至12小时内该表达可忽略不计。转导的A549细胞经Shield-1处理48小时后数量减少，但对Rinella样本无影响，该结果通过使用针对耗竭的RPA3蛋白的抗体进行免疫印迹验证。基因编辑倒位或插入缺失突变通过Surveyor核酸酶检测确认。设计的慢病毒载体构建体为双顺反子系统，在同一EF-1a启动子下携带另一个目的基因。添加了一种改良的荧光蛋白P2A，用于追踪感染的细胞。在载体对照组和转导的A549细胞中均观察到mVenus蛋白的表达，该表达与DD-Cas9的表达及Shield-1处理无关。细胞系高效转导 DD-Cas9 载体是限速步骤之一，因此保持 HEK293T 细胞的健康状态并使用低代次细胞至关重要。DD-Cas9 质粒、包装质粒和包膜质粒之间的比例优化对于实现最佳转染效果非常重要。此外，还需特别注意稳定 DD-Cas9 靶细胞所需的 Shield-1 用量。带有 Cre 质粒的 DD-Cas9 也可获得，可用于基于 Cre-lox 系统的体内研究中遗传相互作用的分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用有条件Cas9稳定评估基因功能的新工具包

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus129 × Mus...

利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。...

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

利用CRISPR/Cas9进行靶向基因编辑极大地促进了对基因生物学功能的理解。在此，我们采用CRISPR/Cas9技术在细胞因子依赖性造血细胞中构建钙网蛋白突变模型，以研究其致癌活性。...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究突变型钙网蛋白在细胞因子依赖性造血细胞中的致癌活性

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

本文介绍了一种sgRNA/CAS9核酸酶与下一代测序的实验方案，可用于鉴定与CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变。...

利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

本方案描述了一种可扩展的导管内CRISPR筛选方法，可实现并行 体内...

平行 体内 小鼠乳腺中基因敲除与激活的筛选

了解利用小分子Shield-1实现条件性稳定化的CRISPR-Cas9基因编辑技术，该技术可减少脱靶效应和细胞毒性，适用于体外和体内研究，并能穿透血脑屏障以研究脑发育相关基因。

一种利用条件性 Cas9 稳定化评估基因功能的新工具包

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