结合使用尾静脉转移分析与实时 Vivo 成像，以量化乳腺癌转移殖民化和肺负担

我们的协议可用于快速轻松地测试任何候选基因在转移殖民化和生长中的作用。该协议还允许实时监测转移、形成和生长，以及量化同一动物的转移数量和大小，而无需切除或组织标记。在12井的板块中，每井有15万个T1细胞，在完整的生长介质中。

在37摄氏度下孵育5%的二氧化碳过夜。第二天，从细胞中吸出生长介质。加入500微升荧光酶病毒上清液和500微升荧光蛋白病毒上清液，同时用荧光酶和荧光蛋白病毒超级纳酸同时感染细胞。

然后，每毫升六溴二甲酸碱加入一微升8毫克，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育24至48小时。用500微升的三辛辛对四个T1细胞进行试鸣。两到五分钟后，将所有细胞转移到四毫升选择培养基中的六厘米培养皿中，从而淬火。

选择完成后，确认受感染的四个T1细胞在50至100倍的放大率下使用倒置荧光显微镜表达ZsGreen荧光蛋白。还要确认受感染的四个T1细胞使用市售的荧光素酶活性试剂盒表达荧光素酶。继续执行文本协议中描述的体内实验设计优化。

吸气介质并用 1X PBS 冲洗细胞板。每15厘米的板用5毫升的三辛辛对细胞进行两到五分钟的试穿，然后将所有细胞转移到锥形管中。用足够的完整生长培养培养培养皿清洗剩余的细胞，以淬火。

将洗涤添加到同一锥形管中。使用自动单元格计数器对单元格进行计数，以确定单元格总数。接下来，将122倍G的细胞离心3分钟，吸进上一代。

以所需的浓度重新悬浮1X PBS中的细胞。在这里，每只小鼠注入25，000个细胞，100微升PBS。因此，重新悬浮的细胞每毫升有25万个细胞。

将细胞悬浮液放在冰上直到注射。在动物设施的引擎盖中工作，通过倒置管子或使用一毫升注射器轻轻但彻底混合细胞，以确保它们均匀地重新悬浮。现在，用细胞悬浮液加载一毫升 Luer Lock 注射器并排出多余的气泡。

将半英寸 30 量表针放在注射器上，斜面向上并排出气泡。轻轻地将鼠标放在啮齿动物约束器中。横向尾静脉应可见和扩张。

如果没有，轻轻捏住尾巴的底座，将尾巴浸入温暖的自来水中，以扩张静脉。使用酒精擦拭清洁尾部，然后将针头插入尾静脉，斜面向上，并注入100微升细胞悬浮液。如果针头正确插入静脉，它应容易向前和向后稍微滑动，在推柱塞时不应有阻力。

成功的注射还应导致冲洗，其中静脉的蓝色在注射后几秒钟变白。慢慢取出针头，用无菌纱布，向注射部位施加压力，止血。将鼠标返回到其保持架并监控 15 分钟，以确保完全恢复。

打开体内活体动物成像设备，打开图像软件，然后登录。单击初始化按钮并等待计算机初始化。将视野更改为 D.首次使用时，通过单击编辑、首选项、采集和自动曝光来编辑曝光设置。

将最大曝光时间从默认的 60 秒更改为 300 秒，然后单击”确定”。用D-荧光素加载一毫升注射器，然后向注射器中加入半英寸30量针并排出气泡。测量并记录麻醉小鼠的质量。

用拇指和指尖捏住脖子的擦伤，抓住小指和手底之间的尾巴，来约束鼠标。以 45 度角反转鼠标，其头部朝下。将针，斜面向上插入鼠标的左侧 IP 空间。

通过拉回小卷来确认进入 IP 空间。在 IP 空间中绘制时，针底不应有颜色。注射适当体积的D-荧光素，剂量为每公斤150毫克。

在 D-荧光素管理后，立即启动计时器。将鼠标平放在成像设备的背部，鼻子放在鼻锥中，并确保对异氟烃进行1.5%到2.5%的同位素。单击发光框和照片盒。

将曝光时间更改为自动，然后在采集控制面板中单击”获取”。成像后，将鼠标返回到其保持架并监控 15 分钟，以确保完全恢复。安乐死后，如文本协议中描述的，从每只小鼠中分离并去除肺部，并在 1X PBS 中冲洗，以去除多余的血液。

使用带 GFP 宽带滤波器的荧光立体镜，在光明场以 10 倍的光面获得 ZsGreen 转移的图像。使用图像分析软件量化图像中转移的大小和数量。要处理和分析使用体内活体动物成像设备采集的图像中的数据，请打开图像软件中每只鼠标的所有图像文件。

单击图像窗口左上角的箭头并更改为相应的单位，确保单位对生物发光数据有辐射，为荧光数据提高效率。使用上一个时间点的图像，通过首先单击工具调色板窗口中的 ROI 工具来创建感兴趣的区域或 ROI。然后，通过单击箭头并选择一个 ROI 插入一个 ROI。

单击 ROI 的边界，然后移动到鼠标的胸前。调整 ROI 的大小，以便它覆盖鼠标的胸部，并且不排除信号。然后，单击测量 PI，将原始数字复制或键入 Excel 工作表。

绘制和分析文本协议中描述的数据。右键单击图像文件中可复制 ROI，然后将其粘贴到其他时间点的图像文件中，然后单击测量 ROI。针对 YAP 和 TAZ 的串联 miR-30 型 shRNA 的逆转录病毒载体可减少四个 T1 细胞中的 YAP 和税蛋白表达和转录活性。

四个T1荧光酶细胞通过ZsGreen表达版本的这种串联的LYP/TAZ shRNA载体或受控的基于miR-30的shRNA进行稳定转导。生物发光图像显示，与注射了 YAP/TAZ 击倒细胞的小鼠相比，注射对照细胞的小鼠转移性负担增加的速度明显加快。在实验过程中为每只小鼠测量的对数10转化荧光素酶信号图也表明，与注射了 YAP/TAZ 击倒细胞的小鼠相比，注射对照细胞的小鼠的速率更快。

与手动计数时使用对照细胞的小鼠相比，注射使用 YAP/TAZ 敲打细胞的小鼠中形成的转移明显较少。使用图像分析软件时也观察到了同样的趋势。不仅更多的转移形成对照小鼠，但他们通常更大。

一致地，YAP/TAZ击倒也大大减轻了肺部的转移性负担。成功将同等数量的健康细胞注入每只小鼠，对于确保高质量数据至关重要。在使用传染性逆转录病毒和扁病毒时，请谨慎使用并遵循安全准则，尤其是在病毒具有人类传染性时。

这项技术使我们能够说明候选基因和转移性殖民化和生长的作用，为识别和测试治疗转移性疾病的新治疗目标提供了一种方法。按照这个程序，含有肺的转移可以通过免疫荧光或组织标记进一步分析，以调查改变的基因如何影响转移，并确定可能涉及的其他蛋白质。