通过微生物穿越微血管内皮细胞分析血脑屏障通透性

该方法通过测量不同处理条件下细菌的跨膜迁移情况，实现对人类血脑屏障的分析。该方法可能有助于揭示细菌性脑膜炎和术后谵妄的发病机制。该方法操作简便，治疗效果可直接通过细菌数量来反映。

可对其进行改进，以实现对内皮细胞上化合物的高通量分析。首先在生物安全柜中组装12孔板。打开包装，取出每一块插入式培养小室，然后使用灭菌镊子夹住其底部，将其放入各孔中。

在每个小室的多孔膜上包被90微升浓度为10微克/微升的IV型胶原蛋白与纤连蛋白混合液，然后将培养板置于37摄氏度的细胞培养孵箱中孵育24小时。孵育结束后，用移液器向每个小室加入1毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并用真空泵抽吸，重复洗涤两次。随后，向小室的上室和下室加入预热的DMEM/F12培养基以平衡膜，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。

接种人微血管内皮细胞时，吸出细胞培养瓶中的培养基，并用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。加入5毫升胰蛋白酶-EDTA溶液，完全覆盖细胞，于37摄氏度孵育3至5分钟。将5毫升细胞悬液转移至15毫升离心管中，加入5毫升含胎牛血清（FCS）的培养基以终止酶反应。

将悬液在210 × g条件下离心3分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于5 mL培养基中。取10 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝染液混合，然后取10 µL混合液加入计数板中。将计数板放入细胞计数仪，启动相应程序，并确保计数仪聚焦准确。

计数后，将200,000个细胞接种至12孔板的每个上室中，在37摄氏度下培养14天，每两到三天更换一次上室和下室的培养基。培养14天后，通过显微镜成像确认细胞汇合度达到100%。在进行通透性测定前一日，将一株大肠杆菌GM2163单菌落接种至3毫升LB培养基中。

将细胞在37摄氏度的振荡培养箱中培养24小时。若需用目标化合物处理细胞，先将其稀释至DMEM/F12培养基中的终浓度，然后将此混合液加入12孔板的上室和下室中，再将培养板置于细胞培养箱中孵育。孵育结束后，将完全培养基更换为不含抗生素的培养基。

通过测量过夜培养的细菌菌液在600纳米处的光密度来确定其浓度，然后在50毫升Falcon管中将其稀释至OD600为0.5。在生物安全柜中，将450微升细菌溶液加入12孔板的每个上室中，随后将培养板在37摄氏度下孵育6小时。孵育结束后，用镊子移除插入式小室，并从每个下室中取50微升培养基，注意避免将上室中的培养基溅入下室。

必须严格分离上室和下室的培养基，因为上室中的细菌溢出会导至假阳性结果。将每个样本分别滴加到不同的琼脂平板上，并使用细胞涂布器涂布均匀。将平板在37摄氏度下孵育24小时，然后计数菌落。

为了研究糖化对微生物穿越血脑屏障的影响，将细胞分别用0.5和0.15毫摩尔的乙二醛溶液处理一小时，未处理细胞作为对照。随后通过使用抗AGE抗体的免疫印迹法检测糖化水平。获得的细菌菌落被计数，并表示为菌落数的绝对值或相对于对照组归一化后的相对值。

经乙二醛处理的样品菌落数量增加，表明该处理对细胞屏障密度具有影响。为研究葡萄糖诱导的蛋白质糖基化，将THBMECs在正常葡萄糖和高葡萄糖培养基中进行培养。菌落的绝对数量以及相对于对照组归一化的菌落相对数量表明，葡萄糖对血脑屏障的完整性无显著影响。

经处理的内皮细胞可进一步通过蛋白质组学方法（例如质谱法）进行分析，以研究蛋白质组的变化。该技术有助于理解人类血脑屏障及细菌穿越机制，也可用于探索衰老以及阿尔茨海默病等神经退行性疾病的某些方面。