通过活体显微镜观察斑马鱼胚胎中分枝杆菌感染期间巨噬细胞的裂解性细胞死亡

该方案能够清晰地区分分枝杆菌感染过程中巨噬细胞的死亡方式。通过平行观察多个胚胎，可大大提高捕获巨噬细胞溶解性细胞死亡全过程的概率。该方案也可适用于感染或无菌性炎症等类似情境下细胞死亡及其他细胞行为的观察。

在长时间活体成像过程中，必须尽可能降低激光强度，以避免光漂白和光毒性。根据文稿所述接种后，将培养物在3000 × g条件下离心10分钟，使海分枝杆菌沉淀。弃去上清液，仅保留300微升，然后重新悬浮沉淀物。

加入3毫升含10%甘油的7H9培养基，进一步重悬菌体沉淀，然后将悬液置于水浴中超声处理，功率100瓦，开启15秒，关闭15秒，总共处理2分钟，以获得单细胞均质悬液。将细菌悬液转移至10毫升注射器中，通过5微米滤膜过滤，去除任何细菌团块。使用分光光度计测定悬液的光密度，并用含10%甘油的7H9培养基稀释至600 nm波长下的光密度（OD600）为1.0。

将悬浮液分装为每份10 µL，于-80 °C冰箱中保存以备后续使用。首先，将琼脂糖置于95 °C的加热块中加热，直至完全融化。通过将琼脂糖置于45 °C的加热块中，使其保持液态。

为了在躯干区域进行肌肉内感染的固定，将0.5毫升1%（重量/体积）的琼脂糖均匀地倒入玻璃载片上，形成底层琼脂糖层。将载片置于冰盒或冷表面上静置3分钟以使其凝固。在麻醉斑马鱼胚胎后，将最多60个斑马鱼胚胎放置在底层琼脂糖上，并小心地将其排列成两行。

加入0.3毫升0.5%（质量/体积）琼脂糖以形成上层之前，用纸巾除去底层琼脂糖表面残留的水分。确保胚胎完全包埋在琼脂糖中。将玻片再次放回冰盒中，使琼脂糖凝固。

用额外的E3胚胎水覆盖琼脂糖表面，保持其上层湿润。接着，调整显微注射仪和显微操作器至适合显微注射的正确位置和参数设置。使用微量移液器将3 µL制备好的细菌培养液转移至已准备好的注射针中。

移液时应缓慢且小心，避免产生气泡。向鱼体主干区域注入 100 CFU。显微注射后，用塑料移液管将斑马鱼胚胎小心冲洗至新鲜的养鱼用水中。

为了进行中脑感染的包埋，使用塑料移液管将四到六只经三卡因麻醉的胚胎转移至琼脂糖中。用10号针头小心地将每只胚胎的头部朝上摆放。待所有胚胎位置固定后，将载玻片转移至冰盒或冷表面上，使琼脂糖凝固。

向中脑注射500 CFU。显微注射后，用塑料移液管小心地将斑马鱼胚胎冲洗至新鲜的卵水中。待琼脂糖完全凝固后，用一层卵水覆盖琼脂糖。

设置好环境培养箱后，将装有斑马鱼的35毫米玻璃底培养皿放入环境培养箱中。打开405二极管、20%功率的氩气激光以及DPSS 561纳米激光。在光谱设置中调节合适的激光功率。

选择 XYZ 顺序扫描采集模式，并将图像格式设置为 512 × 512 像素。切换至实时数据模式，定位第一条斑马鱼的位置，并标记起始和终止的 Z 位置。对剩余的每个胚胎重复此过程。

在程序末尾添加一个暂停。定义程序的循环和周期，并保存文件。在本研究中，我们使用了先前报道的转基因品系 coro1a:eGFP;lyzDsRed2 和转基因品系 mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP，以在体内区分巨噬细胞和中性粒细胞。

大量吞噬细菌的巨噬细胞变得圆润，运动能力降低，最终出现胞质肿胀、细胞膜破裂以及胞质内容物迅速释放。经紫外线照射的巨噬细胞表现出典型的凋亡细胞表型，如细胞收缩、细胞核断裂和染色质浓缩。同时还观察到巨噬细胞主动吞噬并播散M.merinum。

然而，中性粒细胞的吞噬能力有限，并在无明显细菌吞噬的情况下迅速发生溶解性细胞死亡。结合强大的基因编辑工具，该方案可为深入理解多种因素对体内宿主-病原体相互作用的影响提供一个有效的平台。