通过生命内显微镜在斑马鱼胚胎的分孔细菌感染过程中巨噬细胞细胞死亡的可视化

该协议描述了一种技术，用于可视化在胚胎斑马鱼的巨噬行为和死亡在分枝杆菌感染期间。包括制备细菌、胚胎感染和生命内显微镜的步骤。在涉及感染或无菌炎症的类似情况下，此技术可应用于观察细胞行为和死亡。

该协议可以清楚地区分分枝杆菌感染期间的巨噬细胞死亡模式。通过并行观察多个胚胎，它大大增加了捕获整个巨噬细胞细胞死亡过程的概率。该协议也适用于在涉及感染或无菌炎症的类似情况下观察细胞死亡和其他细胞行为。

在扩展的实时成像过程中，保持激光的强度尽可能低，以避免光漂白和毒性是非常重要的。根据手稿接种后，在3000次G下离心培养10分钟，将分枝杆菌收集为颗粒。丢弃所有，但300微升的上一液，并重新悬浮颗粒。

加入3毫升的7H9介质与10%甘油进一步重新悬浮颗粒，然后在水浴中声波悬浮液在100瓦，15秒开和15秒关闭，共两分钟，以实现一个单一细胞均质。将细菌悬浮液转移到10毫升注射器中，并通过5微米过滤器去除任何细菌团块。使用分光光度计测量悬浮液的光学密度，并使用含有 10%甘油至 OD 600 的 7H9 介质稀释。

将悬浮液分成10微升等分，储存在负80摄氏度的冰柜中，供进一步使用。首先，在95摄氏度的加热块中加热气，直到其完全熔化。将气糖放入45摄氏度的加热块中，保持液体形式的气糖。

要安装在树干区域肌肉感染，创建底部的阿加罗斯层，通过体积 agarose 均匀地将 0.5 毫升 1% 的重量均匀地浇注到玻璃幻灯片上，以创建底部的 agarose 层。将幻灯片放在冰架或冷表面上三分钟，以凝固。麻醉斑马鱼胚胎后，将多达60个斑马鱼胚胎放在底部的阿加罗斯层上，并小心地将它们布置成两排。

用纸巾去除底部加糖层上剩余的水，然后按体积加糖添加 0.3 毫升 0.5% 的重量以创建上层。确保胚胎完全嵌入在糖中。将玻璃滑梯再次返回到冰盒中，以凝固加糖。

通过额外的 E3 蛋水覆盖表面，保持气糖的顶层湿润。接下来，将微注射器和微操纵器调整到微注射的正确位置和设置。使用微加载器将三根微升的准备好的细菌培养剂转移到准备好的针头中。

缓慢而小心地移液，以避免形成气泡。将 100 CFU 注入中继区域。微注射后，用塑料移液器小心地将斑马鱼胚胎冲洗成新鲜的蛋水中。

要安装中脑感染，使用塑料移液器将四到六个三分五角的胚胎移植到红糖中。用10个量针小心地将每个胚胎的头部向上放置。一旦所有胚胎位置固定，将玻璃幻灯片转移到冰盒或冷表面，让红糖凝固。

将 500 CFU 注入中脑。微注射后，用塑料移液器小心地将斑马鱼胚胎冲洗成新鲜的蛋水中。一旦阿加罗斯完全凝固，用一层蛋水盖住加糖。

设置环境室后，将 35 毫米玻璃底盘与斑马鱼放在环境室中。打开 405 二极管，在 20% 的功率下打开 argon，以及 DPSS 561 纳米激光器。在频谱设置中设置适当的激光功率。

选择 XYZ 顺序扫描采集模式，将图像格式设置为 512 x 512 像素。切换到实时数据模式，定位第一个斑马鱼的位置，并标记开始和结束 Z 位置。对剩余的每个胚胎重复此过程。

在程序结束时添加暂停。定义程序的循环和循环，并保存文件。在这项研究中，我们利用先前报道的转基因共生1a:eGFP;lyzDsRed2，以及转基因mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP，来区分体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞。

大量被细菌感染的巨噬细胞变得圆，并表现出运动性降低，最终的细胞质肿胀，细胞膜破裂，细胞质含量迅速传播。紫外线辐射巨噬细胞显示典型的凋亡细胞表型，如细胞收缩、核分裂和染色质凝结。还观察到巨噬细胞积极噬菌体和传播M.merinum。

然而，嗜中性粒细胞的吞噬能力有限，并迅速经历了细胞细胞死亡，没有明显的细菌感染。结合强大的基因编辑工具，该协议可为进一步了解多种因素对体内宿主-病原体相互作用的影响提供一个有效的平台。