Name: 完全加工重组KRAS4b:分离和描述脱脂和甲基化蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学习从昆虫细胞中分离纯化法尼基化和羧甲基化KRAS蛋白的高产率方案，每升表达物可获得三至五毫克蛋白。该方法适用于生物物理和结构生物学实验，为癌症药物筛选研究提供重要工具。

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我们感谢癌症研究弗雷德里克国家实验室蛋白质表达实验室的Carissa Grose、Jen Melhalko和Matt Drew在克隆与表达方面提供的支持。本项目全部或部分由美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院的联邦资金资助，合同编号为HHSN261200800001E。本出版物的内容不一定反映卫生与公共服务部的观点或政策，提及的商标名称、商业产品或组织亦不意味着美国政府的认可。

1. 蛋白质纯化
<ol>
	<li>配制缓冲液 A–H，见表1。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液</td>
			<td>缓冲剂（均为 20 mM）</td>
			<td>pH</td>
			<td>NaCl (mM)</td>
			<td>咪唑 (mM)</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>TCEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>HEPES</td>
			<td>7.3</td>
			<td>300</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>HEPES</td>
			<td>7.3</td>
			<td>300</td>
			<td>35</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>HEPES</td>
			<td>7.3</td>
			<td>300</td>
			<td>500</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>MES</td>
			<td>6.0</td>
			<td>200</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>MES</td>
			<td>6.0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>MES</td>
			<td>6.0</td>
			<td>100</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>MES</td>
			<td>6.0</td>
			<td>1000</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>HEPES</td>
			<td>7.3</td>
			<td>300</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="2">
	<li>准备纯化材料（参见材料表）：不含EDTA或其他螯合剂的蛋白酶抑制剂混合物；固定化金属亲和层析（IMAC）柱；阳离子交换层析（CEX）柱；0.45 μm注射器滤器；2 M咪唑（pH = 7.5）；可达到100,000 × g的超速离心机；可达到4,000 × g的高速台式离心机；离心过滤装置（10 KDa NMWL）；可在280 nm处读数的分光光度计；His6-烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶；以及能够混合两种缓冲液、将溶液上样至层析柱、实现梯度洗脱并收集层析柱组分的层析设备。</li>
	<li>解冻先前在-80 °C保存的约2 L昆虫细胞培养物的细胞，或使用新鲜收获的细胞。有关Tni.FNL昆虫细胞系及表达方案的详细信息，请参见Gillette等201915。用200 mL添加了1:200（v/v）不含EDTA的蛋白酶抑制剂的缓冲液A小心重悬细胞，避免引入空气或产生泡沫。 
	注意：步骤1.3及后续步骤（除非特别注明）应在室温（约22 °C）下进行。确保样品均匀至关重要，以便在下一步实现完全裂解。</li>
	<li>使用微流化器在7,000 psi条件下进行两次裂解，或使用等效的裂解系统。其他裂解方法尚未研究。</li>
	<li>由于存在堵塞滤器的化合物，昆虫细胞裂解液的澄清较为困难。因此，超速离心（4 °C下100,000 × g离心30分钟）非常关键。应避免上清液表面出现白色脂质残留物，可用棉签去除或减少该残留物。将倾出的上清液通过0.45 μm PES滤器过滤。澄清后的样品应立即使用或在-80 °C保存。 
	注意：残留物会迅速堵塞滤器，可能需要多个滤器。若不减少该物质的量，将在后续步骤中导致层析柱背压升高。</li>
	<li>测定澄清裂解液的体积，并通过加入2 M咪唑母液将样品调整至35 mM咪唑。以3 mL/min流速将样品加载至预先用缓冲液B平衡三个柱体积（CVs）的20 mL IMAC柱（HisPrep FF 16/10柱）。</li>
	<li>尽管目标蛋白通常能完全吸附到柱上，但仍建议收集柱流出液以供后续分析。以3 mL/min流速用缓冲液B洗涤柱子20 mL（1 CV），然后以4 mL/min流速继续洗涤约3 CV，直至Abs280达到稳定基线（&#60;100毫吸光度单位[mAU]）。通常需要60–80 mL缓冲液B以达到基线吸光度。</li>
	<li>使用400 mL（20 CV）的缓冲液B至缓冲液C的梯度洗脱蛋白，同时收集8 mL组分。通常，目标蛋白在梯度前半部分洗脱（图1A；未显示所有后续组分）。</li>
	<li>使用SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色分析蛋白组分。合并峰值组分，并在4 °C下用2 L缓冲液D透析过夜。 
	注意：低pH值对于确保下一步蛋白结合至关重要。然而，此透析过程中的pH变化较慢，因此适合过夜孵育。尚未研究其他缓冲液置换策略（例如提高缓冲液浓度以加快pH变化）。在较低pH值和较低盐浓度下，蛋白会随时间缓慢沉淀，此步骤中少量沉淀属正常现象。因此，我们避免在透析过程中将缓冲液置换为下一层析柱结合所需的100 mM NaCl。相反，透析时使用200 mM NaCl，上样前立即稀释至100 mM（见下文）。我们尚未研究此沉淀是否特异于KRAS4b，但已确认沉淀蛋白为KRAS4b-FMe。因此，建议作为预防措施，在透析缓冲液中使用较高NaCl浓度，直至确定目标蛋白在结合缓冲液中的稳定性。</li>
	<li>取出透析样品，在4,000 × g下离心10分钟以去除任何沉淀物。此时最终透析并澄清的样品通常仍呈浑浊状，但可直接上样至后续的CEX柱，无需进一步处理。</li>
	<li>通过用三倍柱体积（CVs）的缓冲液G洗涤，再用三倍柱体积的缓冲液F洗涤，准备20 mL阳离子交换柱（参见材料表）。 
	注意：尽管我们未系统评估其他树脂，但多位同行发现除SP Sepharose High Performance树脂外，其他树脂分辨率较差。</li>
	<li>向20 mL透析后的样品中加入20 mL缓冲液E，将其稀释至最终NaCl浓度为100 mM，并将稀释后的样品上样至阳离子交换柱。</li>
	<li>当上一次稀释样品接近上样结束时，继续将按上述方法新鲜稀释的样品加入上样管中，持续上样至柱。 
	注意：一次性将整个样品稀释至100 mM NaCl会导致目标蛋白因沉淀而显著损失。</li>
	<li>用缓冲液F洗涤柱子至Abs280基线。此过程通常需要3 CV。在400 mL（20 CV）的缓冲液F至65%缓冲液G的梯度中洗脱蛋白，以6 mL组分收集（图1B）。</li>
	<li>梯度洗脱完成后，继续用额外1.5 CV（65%缓冲液G）洗涤柱子。根据SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色分析结果及色谱图的UV谱图检查结果选择阳性组分。 
	注意：UV谱图通常包含五个峰。从较低盐浓度开始，第一个峰通常为未加工和/或蛋白水解的蛋白。第二和第三峰为两种加工形式蛋白的混合物：第二峰主要为法尼基化中间体（FARN），第三峰主要为完全加工的FMe目标蛋白。第四和第五峰代表His6-MBP-KRAS4b融合蛋白（此时所有蛋白均为此形式，因尚未进行TEV消化）。这些蛋白N端未乙酰化，C端为法尼基化（第四峰）和法尼基化加羧甲基化（第五峰）。由于第二峰和第四峰在去除标签后将产生相同的蛋白（即KRAS4b-FARN），若需要，可在本阶段合并。类似地，第三峰和第五峰可合并以产生单一的KRAS4b-FMe批次（图1B，图2）。但建议仅在确认各峰中蛋白性质后才进行合并。</li>
	<li>用His6-TEV蛋白酶消化步骤1.15中合并的蛋白（约200 μg蛋白酶/mL样品）。 
	注意：我们使用Addgene提供的质粒和方案制备His6-TEV蛋白酶（<a href="https://www.addgene.org/92414" target="_blank">https://www.addgene.org/92414</a>）。将TEV消化产物在室温下用缓冲液A透析2小时，然后在4 °C下过夜透析（使用10 kDa MWCO透析管，每毫升样品至少使用40 mL缓冲液A）。</li>
	<li>消化和透析后，以3 mL/min流速将蛋白直接上样至用缓冲液A平衡的20 mL IMAC柱。 
	注意：在整个层析过程中收集7 mL组分，因为目标蛋白对柱的亲和力较低，可能无法完全结合到树脂上。以3 mL/min流速用缓冲液A洗涤柱子，总共3 CV或直至达到基线吸光度。</li>
	<li>使用0%–10%缓冲液C的5 CV梯度洗脱目标蛋白，收集7 mL组分。作为预防措施，可用100%缓冲液C洗脱其他结合蛋白。通过SDS-PAGE分析确定阳性组分（图1C）。通常，目标蛋白在低咪唑浓度下洗脱（即在0%–10%缓冲液C梯度中），但有时也会在流穿液或柱洗涤液中出现。</li>
	<li>将最终合并的组分用缓冲液H透析。通过280 nm处的分光光度法测定蛋白浓度。 
	注意：计算时务必考虑核苷酸的存在以确定所用消光系数。</li>
	<li>可使用离心过滤装置（10 K NMWL）将蛋白浓缩至约2–5 mg/mL，且无明显蛋白损失。用0.22 μm注射器滤器过滤。测定溶液在A280处的吸光度以计算最终蛋白浓度（图1D）。在液氮中快速冷冻分装样品，并将冷冻样品在-80 °C保存。 
	注意：纯化的蛋白与GDP结合。KRAS4b-FMe可使用先前发表的方案交换为GppNHp16。</li>
</ol>
2. 完整质谱分析和天然质谱分析的样品制备
<ol>
	<li>完整质谱分析的样品制备
	<ol>
		<li>将蛋白样品置于冰上解冻后再进行分析。进行完整质量分析时，用20 mM碳酸氢铵（pH ≈ 8.4）将蛋白稀释至0.1 mg/mL。进行天然质谱分析时，用50 mM乙酸铵（pH ≈ 7.5）将蛋白稀释至0.1 mg/mL。每份样品涡旋振荡5–10秒，然后在12,500 × g条件下离心 g 离心1分钟，使溶液中的固体物质沉淀。取上清液10–20 µL，转移至玻璃自动进样瓶中。盖紧瓶盖，防止污染或蒸发。 
		注意：无论是完整质量分析还是天然质谱分析，样品均可使用10 kDa截留分子量的纤维素膜滤器进行脱盐处理，以置换缓冲液至最终稀释缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩展质量范围（EMR）质谱仪的质量分析准备 
	注意：在使用质谱仪进行任何分析之前，务必确保仪器已近期校准。同时，应根据需要佩戴手套及其他个人防护装备，以避免接触有害化学物质，并防止样品和溶剂受到污染。校准需使用市售的校准溶液以及实验室自制的2 mg/mL碘化铯溶液。
	<ol>
		<li>打开分析软件并加载相应的仪器方法文件。对于KRAS4b蛋白的完整质量分析，合适的初始参数如下：正离子检测模式；微扫描次数为3次，分辨率 = 70,000；AGC目标值 = 3e6；最大积分时间 = 200 毫秒；扫描范围 = 70–1,800 质荷比（m/z）。对于KRAS4b蛋白的天然质谱分析，合适的起始参数如下：正离子检测模式；10次微扫描，分辨率 = 17,500；源内碰撞诱导解离（CID）= 20 eV；AGC目标值 = 3e6；碰撞能量（CE）= 20；最大积分时间 = 200 ms；扫描范围 = 500–10,000 m/z。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>色谱溶剂的配制与色谱柱准备
	<ol>
		<li>配制完整质量分析所需的溶剂。溶剂A为含0.1%甲酸的水溶液。溶剂B为含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液。</li>
		<li>准备进行天然质谱分析所需的溶剂。溶剂A为水中含0.1 M醋酸铵，溶剂B为水。</li>
		<li>在配制适当的溶剂后，对系统进行冲洗，使管路中充满适当的溶剂，并彻底排除管路中的所有气泡。</li>
		<li>安装合适的色谱柱（完整质量分析采用反相色谱柱，天然质谱分析采用尺寸排阻色谱柱）。进行完整质量分析时，流速为0.5 mL/min，柱温（使用柱加热器）为50 °C，色谱柱平衡时间为15–20分钟。进行天然质谱分析时，流速为0.25 mL/min。 
		注意：始终监测色谱柱的反压，确保其不超过上限，压力升高可能表明管路堵塞或色谱柱基质受损。必要时更换色谱柱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品分析
	<ol>
		<li>将制备好的蛋白样品放入玻璃自动进样小瓶中，并置于液相系统自动进样器相应的样品架位置。在软件程序中创建样品列表，并选择适用于目标分析的仪器方法。样品列表完成后，点击 播放 单击按钮以开始分析。</li>
		<li>每次分析注入1–2 μL样品，并在每个样品前后运行水空白，以确保无残留。 
		注意：完整质量分析与天然质量分析有很大差异，需要设置截然不同的仪器方法参数。这是因为完整质量分析中，蛋白质会被 &#34;松弛的&#34; 在有机溶剂存在下，能够接受更多电荷，因此更易于去卷积并解析各电荷态的同位素分布。天然质谱分析可提供蛋白质离子较窄的电荷分布，且根据蛋白质的不同，需要调整相应的电压和碰撞能量参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析与蛋白质去卷积
	<ol>
		<li>将样品的谱图导出至软件中，以转换为去卷积谱图，从而显示蛋白质的完整质量（或天然质量）。由于带电荷谱峰丰度较高，完整质量谱图将呈现同位素峰分布；而天然质量谱图通常仅有极少峰，原因是带电荷谱峰的丰度较低。图3D).</li>
		<li>扩展峰 d 的质荷比（m/z）范围，以确认所测得的质量与预测质量一致。由于蛋白质可能携带额外电荷，预期分子量（MW）与观测分子量之间偶尔会出现轻微差异。此外，与许多质谱分析类似，即使样品经过仔细脱盐，仍可能因钠等加合物的存在而在数据中出现额外峰。有时会观察到丰度较低且 m/z 低于预期的峰，这很可能是由于中性丢失所致，即在电离过程中丢失了某个功能基团。 
		注意：如预期所示，完整质量峰与天然质量峰之间会存在差异。完整质量图谱将显示蛋白质的预期分子量（MW），不包含所连接核苷酸或其他修饰带来的额外分子量。然而，天然质量峰会显示出携带任何附加核苷酸的蛋白质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 验证KRAS4b-FMe与脂质体的结合
<ol>
	<li>膜脂质体的制备
	<ol>
		<li>配制缓冲液，包含 20 mM HEPES（pH = 7.3）、150 mM NaCl 和 1 mM TCEP。</li>
		<li>脂质体制备所需材料包括：氯仿中的 25 mM 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）和 10 mM 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸（POPS）储备液；配备支架和加热块的脂质挤出装置；氩气和液氮；超声水浴仪；带聚四氟乙烯泡沫衬垫的玻璃螺纹小瓶；以及具备动态光散射检测功能的酶标仪。</li>
		<li>将氯仿中的脂质储备液在室温下解冻 30 分钟。通过向玻璃小瓶中加入 106 μL 的 25 mM POPC（储备液）和 118 μL 的 10 mM POPS（储备液），配制 1 mL 浓度为 5 mM、组成为 70:30 的 POPC:POPS 脂质体。 
		注意：请勿使用塑料吸头分装脂质，因为氯仿可能溶解某些类型的塑料吸头。</li>
		<li>在持续通入氩气的条件下干燥脂质。吹氩气时缓慢旋转玻璃小瓶，以形成一层均匀的干燥脂膜。</li>
		<li>将样品置于真空冷冻干燥机中过夜，以彻底去除残留的氯仿。</li>
		<li>向干燥脂膜中加入 1 mL 缓冲液以重新水合脂质，涡旋混合 5 分钟。在 25 °C 下轻轻摇动 1 小时，使脂质充分水化。 
		注意：缓冲液加入干燥脂膜后，样品将呈现明显浑浊状态。</li>
		<li>通过交替将样品小瓶置于冰水浴（4 °C 或更低）和温水浴（25 °C 或更高）之间，进行五次冻融循环。</li>
		<li>将样品小瓶放入超声水浴仪中，超声处理约 0.5 小时，直至样品变为半透明。</li>
		<li>使用脂质挤出装置对样品进行挤出处理。按照制造商说明书组装挤出装置。使用孔径为 0.1 μm 的滤膜进行挤出。将样品装入一支玻璃注射器并连接至挤出装置的一端，在另一端连接一支空注射器。往复推注 10–20 次，直至样品完全透明。</li>
		<li>将最终样品在 20,000 x g 条件下离心 30 分钟，以去除可能存在的大颗粒聚集体。</li>
		<li>可选：使用动态光散射（DLS）测定脂质体的粒径和均一性。取 30 μL 脂质体样品加入 384 孔板中，在 1,000 x g 条件下离心 30 分钟。将板放入酶标仪中，采集 10 次光散射测量数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过表面等离子共振（SPR）表征 KRAS4b-FMe 与脂质体的结合
	<ol>
		<li>准备所需材料：SPR 仪器、L1 传感器芯片、7 x 14 mm 小瓶管和 CHAPS。</li>
		<li>配制含 20 mM HEPES（pH = 7.3）、150 mM NaCl 和 1 mM TCEP 的缓冲液。将 KRAS4b-FMe 从 60 μM 至 0.06 μM 进行 2:1 系列稀释，共 10 个浓度点，每份总体积为 200 μL。将稀释后的样品转移至小瓶管中（见材料表），放入样品架，并插入 SPR 仪器中。</li>
		<li>将 L1 传感器芯片插入 SPR 仪器中。连接缓冲液管路，并以缓冲液冲洗系统 7 分钟。</li>
		<li>设置自动化程序如下：
		<ol>
			<li>将仪器温度设定为 25 °C。</li>
			<li>以 30 μL/min 的流速，注入两次、每次 1 分钟、溶于水的 20 mM CHAPS 溶液，以活化 L1 传感器芯片。</li>
			<li>执行启动循环：以运行缓冲液连续注入 10 次，每次 1 分钟，以水合芯片表面。
			<ol>
				<li>将脂质体以 5 μL/min 的流速注入 L1 芯片的流通池（FC）-2，持续 2 分钟，使脂质体固定于芯片表面。目标捕获量至少达到约 3,000 响应单位（RUs）。 
				注意：若未达到理想捕获水平，可延长注入时间直至满足要求。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>以 30 μL/min 的流速，在 FC-1 和 FC-2 上交替注入三次缓冲液，每次 1 分钟。
			<ol>
				<li>按浓度从低到高的顺序注入不同浓度的 KRAS4b-FMe 样品。在两个流通池上均以 30 μL/min 的流速进行结合相注入 1 分钟，解离相注入 2 分钟。</li>
				<li>以 30 μL/min 的流速，注入两次、每次 1 分钟的 20 mM CHAPS 溶液，对 L1 传感器芯片进行再生清洗。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 SPR 分析软件，采用单一位点结合模型拟合数据，获得表观结合亲和力（数据拟合方法详见讨论部分）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

如代表性结果部分所述，纯化过程中最关键的步骤是在低盐条件下对样品的处理。限制样品暴露于低于 200 mM NaCl 条件下的时间，有助于减少沉淀并提高样品得率。如果阳离子交换层析（CEX）的结果图谱与预期不符，则结果的解读可能较为困难（见图 2）。在该方案尚未成为常规操作之前，建议将未继续使用的 CEX 洗脱组分保存于 -80 °C，直至完成完整分子量分析，以确保选择了正确的组分进行后续实验。除上述 CEX 步骤的参数外，本方案在裂解和固定金属离子亲和层析（IMAC）步骤中相对容易修改。值得注意的是，本方案中未包含尺寸排阻层析（SEX）分离步骤。省略该步骤的原因是在早期方法开发过程中观察到了样品损失（未发表结果）。值得注意的是，当蛋白质处于纳米盘（nanodiscs）复合物中时，不会观察到此类损失，表明在缺乏脂质的情况下发生的损失可能是由于蛋白质与层析树脂之间的疏水相互作用所致。
该方法在产量（&#62;10倍以上）和质量（相较于在人源细胞中表达的真实加工型KRAS4b）方面均实现了显著提升，此前文献中尚未见类似报道<su...

翻译后修饰在决定蛋白质功能活性方面起着关键作用。磷酸化和糖基化等修饰已被广泛研究。然而，脂质修饰的特征仍相对不明确。据估计，多达0.5%的细胞内蛋白质可能发生法尼基化1。法尼基化是指将一个15碳的法尼基或20碳的香叶基香叶基脂链转移至含有CAAX基序的受体蛋白上2。已有研究表明，法尼基化蛋白参与多种人类疾病的发展过程，包括早衰症3、阿尔茨海默病4、心脏功能障碍5、脉络膜缺失症6和癌症7。在基础状态下，小GTP酶HRAS、NRAS和KRAS1、核层蛋白以及动粒蛋白CENP-E和F属于法尼基化蛋白。其他一些小GTP酶，如RhoA、RhoC、Rac1、cdc-42和RRAS则发生香叶基香叶基化8，而RhoB既可被法尼基化，也可被香叶基香叶基化9。
小GTP酶KRAS4b作为一种分子开关，主要通过多种蛋白质-蛋白质相互作用，将细胞外的生长因子信号传递至细胞内信号转导通路，从而促进细胞生长与增殖。KRAS4b生物化学特性的两个关键方面对其活性至关重要：第一，该蛋白在与GDP结合的非活性状态和与GTP结合的活性状态之间循环转换，从而能够主动与下游效应分子相互作用；第二，其C末端的多聚赖氨酸区域以及法尼基化并羧甲基化的半胱氨酸残基可引导蛋白定位于质膜，进而招募并激活下游效应分子。突变型KRAS4b是胰腺癌、结直肠癌和肺癌中的致癌驱动因子10，因此，针对其的治疗干预将具有重大的临床价值。制备经过真实修饰的重组蛋白（即法尼基化且羧甲基化的KRAS4b），将有助于利用脂质体或脂质纳米盘等膜模拟系统，开展基于KRAS4b的生化筛选研究11,12。
法尼基转移酶（FNT）催化法尼基焦磷酸与KRAS4b蛋白CAAX基序中C末端半胱氨酸的结合。在法尼基化修饰后，该蛋白被转运至内质网（ER），由Ras转化酶（RCE1）切除其三个C末端氨基酸残基。加工过程的最后一步是由内质网膜蛋白异戊二烯半胱氨酸羧基甲基转移酶（ICMT）对新生成的C末端法尼基半胱氨酸残基进行甲基化修饰。在大肠杆菌（E. coli）中表达重组KRAS4b蛋白通常只能产生未修饰的蛋白形式。以往尝试制备经过完整加工的KRAS4b蛋白均受到产量不足的限制，难以满足结构研究或药物筛选实验的需求，或未能成功重现天然全长成熟蛋白的结构特征13,14。本文所述方案采用经过工程化改造的基于杆状病毒的昆虫细胞表达系统及纯化方法，可获得高纯度、完全加工修饰的KRAS4b蛋白，产量达每升细胞培养物5 mg。
在开展结构生物学或药物筛选研究之前，对蛋白质进行细致的表征对于验证重组蛋白的质量至关重要。完全加工的KRAS4b有两个关键参数需要确认：一是正确的异戊二烯化修饰，二是法呢基化及羧甲基化的C末端（FMe）是否可用于与膜模拟物或脂质发生相互作用。采用电喷雾电离质谱法（ESI-MS）测定KRAS4b-FMe的分子量，以确认法呢基和羧甲基修饰的存在。使用天然质谱法（样品以非变性溶剂喷雾）证明KRAS4b-FMe还结合了其GDP辅因子。最后，采用表面等离子体共振光谱法检测KRAS4b-FMe与固定化脂质体的直接结合能力。

<table><tbody><tr><td>1.8 mL 安全锁扣管，本色</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>11 mm 带锁不锈钢自动进样瓶插件小瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>30211SS-1232</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酰胆碱（POPC）</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>850457</td><td>以氯仿溶液形式购买</td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酰-L-丝氨酸（POPS）</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>840034</td><td>以氯仿溶液形式购买</td></tr><tr><td>5427R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈，HPLC 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A998-1 1L</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250g</td><td></td></tr><tr><td>氩气</td><td>Airgas</td><td>ARUP</td><td></td></tr><tr><td>384 孔检测板</td><td>CORNING</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 仪器</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓝色 Snap-It 密封盖，T/S 型</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-54B</td><td></td></tr><tr><td>Branson 超声波清洗仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-336-1000</td><td></td></tr><tr><td>阳离子交换色谱柱（CEX）</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29018183</td><td>HiPrep SP Sepharose High Performance</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Dyna Pro 微孔板读数仪</td><td>Wyatt Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exactive Plus EMR 质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500Ml</td><td>使用试剂级或更高级别</td></tr><tr><td>Gilson 7x14 mm 小瓶</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-12</td><td></td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯泡沫衬垫的螺纹玻璃小瓶</td><td>Scientific Specialities</td><td>B69302</td><td></td></tr><tr><td>高速/台式离心机</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-112-114D</td><td>最高可达 4,000 ×g</td></tr><tr><td>His6-烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶</td><td>Addgene</td><td>92414</td><td>根据 Raran-Kurussi 等（2017）方法纯化：TEV 蛋白酶去除亲和标签。见：Burgess-Brown N.（编），大肠杆菌中异源基因表达。《分子生物学方法》，第 1586 卷。纽约，Humana Press</td></tr><tr><td>固定化金属亲和色谱柱（IMAC）</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9365-51</td><td>HisPrep FF 16/10</td></tr><tr><td>内部供水系统，Arium Advance</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>电阻率为 18 M&amp;Omega;·cm</td></tr><tr><td>脂质挤出器套装（含支架）</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>Airgas</td><td>NI-DEWAR</td><td></td></tr><tr><td>M110-EH 微流体处理器</td><td>Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MabPac RP UHPLC 色谱柱，4 µm，3.0 × 50 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>088645</td><td></td></tr><tr><td>MabPac SEC-1 色谱柱，5 µm，300 &amp;Aring;，2.1 × 150 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>088790</td><td></td></tr><tr><td>MagTran 软件</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇，HPLC 级</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>NGC 色谱系统</td><td>BioRad</td><td>78880002</td><td>NGC QuestTM 100 色谱系统</td></tr><tr><td>不含 EDTA 或其他螯合剂的蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>3 型橡胶盖</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-02</td><td></td></tr><tr><td>Series S L1 传感器芯片</td><td>GE Healthcare</td><td>29104993</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>13-400-519</td><td>280 nm 处吸光度</td></tr><tr><td>Ultra-15 离心过滤单元，10K NMWL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>PES 膜</td></tr><tr><td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 离心过滤器</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima - L80K</td><td>最高可达 100,000 ×g</td></tr><tr><td>Vanquish UHPLC（泵、柱温箱和液相系统）</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 涡旋振荡器</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>水，HPLC 级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-1L</td><td>可使用内部水源（见下文）</td></tr><tr><td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm 注射器滤器</td><td>GE Healthcare - Whatman</td><td>6994-2504</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur QualBrowser</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>蛋白质组学软件</td></tr></tbody></table>

完全加工的重组kras4b：法尼基化与甲基化蛋白的分离与表征

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

蛋白质预nylation是一种关键的修饰，负责将蛋白质靶向至细胞内膜。KRAS4b在22%的人类癌症中发生突变，由于其C末端存在“CAAX”盒基序，因此会经历法尼基化和羧甲基化加工。此前已有研究描述，利用经过改造的杆状病毒系统在昆虫细胞中表达法尼基化和羧甲基化的KRAS4b。本文中，我们详细描述了该蛋白的实用纯化方法及其生化表征。具体而言，采用亲和层析和离子交换层析将蛋白纯化至均一。通过完整质谱和天然质谱验证KRAS4b的正确修饰状态，并确认其与核苷酸的结合能力。最后，利用表面等离子共振光谱法检测法尼基化和羧甲基化的KRAS4b与脂质体的膜结合特性。

该实验方案中最大的变量之一是目标蛋白（His6-MBP-tev-KRAS4b）的表达量。本方案所使用的蛋白来源于一种Trichoplusia ni细胞系Tni-FNL17，该细胞系已适应悬浮培养并实现无血清培养。鉴于不同昆虫细胞系在杆状病毒表达系统中报告的结果差异较大，建议至少在初期使用Tni-FNL细胞系来生产KRAS4b-FMe。
在澄清的裂解液以及洗脱组分中，应能明显观察到一条迁移至约65 kDa的深色蛋白条带（图1A）。该融合蛋白应是裂解液中两条最显著染色条带之一，另一条为共表达的FNTA/B，其共迁移至约48 kDa处。
在纯化过程中，阳离子交换层析（CEX）步骤至关重要，原因有两点：1）该步骤有助于减少蛋白水解程度，因为高变区（HVR）极易发生降解；2）如本方案该步骤的注释所述，该步骤可富集完全加工成熟的蛋白。然而，这也是整个方案中最复杂的部分。其复杂性在于...

预nylation是外周膜结合蛋白上的一种重要修饰。通过改造昆虫细胞，可大量生产法呢基化并羧甲基化的KRAS4b，从而支持对蛋白质-蛋白质及蛋白质-脂质相互作用进行生物物理测量。

完全加工的重组KRAS4b：法尼基化与甲基化蛋白的分离与表征

蛋白质预nylation是一种关键的修饰，负责将蛋白质靶向至细胞内膜。KRAS4b在22%的人类...

本方案可实现高得率地分离和纯化经过正确加工的KRAS。所获得的KRAS具有真实的法尼基化和羧甲基化修饰，使其能够像在哺乳动物细胞膜中一样定位于膜结构，从而可用于相关实验研究。本方案的高得率特性使其显著优于以往的方法。我们通常每升表达材料可纯化出三至五毫克的蛋白质，这使我们能够开展多种生物物理和结构生物学实验。KRAS 在 20% 的癌症中发生突变，在胰腺癌中突变率高达 90%。因此，建立一种能够产生真实加工后蛋白的实验方案，对于药物筛选的开发非常有用，因为它使你能够研究在癌细胞膜上实际存在的蛋白形式。该方案也十分适用于研究其他在细胞内经过法尼基化并完全加工的蛋白。只需将KRAS替换为目标蛋白，并将其插入杆状病毒中即可。关键步骤集中在阳离子交换层析环节。使用正确的层析柱，并尽量缩短蛋白在低盐缓冲液中的停留时间，对实验成功至关重要。理解沉淀过程并非类似“雪景球”那样的现象，有助于指导初次操作该方案的研究人员。通过将阳离子交换柱上样量分为多个较小上样量的必要性进一步证实了这一点。裂解细胞后，澄清裂解液，并通过IMAC纯化目标蛋白，随后使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析蛋白组分。合并峰值组分，并在4°C条件下，用两升缓冲液D对合并液透析过夜。次日，从透析袋中取出样品，以 4,000 × g 离心 10 分钟，以去除任何沉淀物。最终透析并澄清的样品通常仍略显浑浊，但可直接上样至阳离子交换柱，无需进一步处理。用三倍柱体积的缓冲液 G 冲洗 20 毫升阳离子交换柱，随后用三倍柱体积的缓冲液 F 冲洗。接着，向 20 毫升透析后的样品中加入 20 毫升缓冲液 E，将样品稀释至终浓度为 100 毫摩尔的氯化钠，然后将样品上样至交换柱。必须将样品少量多次稀释，而不是一次性全部稀释，并且稀释后的样品应在稀释后立即上样至层析柱，以减少蛋白质沉淀。当前一次稀释的样品即将完成上样时，继续加载新稀释的样品。随后用缓冲液 F 洗脱层析柱，直至 280 nm 处的吸光度回到基线水平，通常需要三个柱体积的缓冲液。用400毫升从缓冲液F到65%缓冲液G的梯度洗脱柱上的蛋白，以6毫升组分收集洗脱液。梯度洗脱完成后，继续用1.5个柱体积的65%缓冲液G洗涤柱子。根据SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析结果以及色谱图的紫外吸收曲线检查情况，选择阳性组分。然后合并蛋白样品，并根据文献所述方法用His6 TEV蛋白酶进行消化。消化并透析后，将蛋白质以每分钟3毫升的流速上样至已用缓冲液A平衡的20毫升IMAC柱。在此层析过程中收集每份7毫升的组分，并用总共三个柱体积的缓冲液A洗涤柱子，直至吸光度达到基线水平。用缓冲液C从0%到10%的五个柱体积梯度洗脱目标蛋白，并收集每份7毫升的组分。然后通过SDS-PAGE鉴定阳性组分。在进行SDS-PAGE分析时，澄清裂解液中应出现一条迁移至约65千道尔顿的深染条带，对应于融合蛋白His6-MBP-tev-KRAS4b。共表达的FNTAb迁移至48千道尔顿。纯化过程中的CEX步骤至关重要，因为它能够减少蛋白水解的程度，并富集完全加工的蛋白，但也是该实验方案中最复杂的部分。此步骤的典型结果是KRAS4b-FMe出现明显的第三峰，但洗脱谱图可能具有变异性。采用ESIMS进行完整质谱分析可确认蛋白质的精确分子量，从而确定法尼基化或羧甲基化的相对比例。尽管典型的终产物中均含有可检测到的KRAS4b-FARN，但根据本分析，其比例在峰高上低于15%。采用原生质谱分析法测定与GDP结合的KRAS4b的分子量。将样品溶剂置换为乙酸铵，以确保更温和的离子化过程，从而使原生复合物保持完整。通过表面等离子共振技术检测了KRAS4b-FMe与脂质体的相互作用，以验证法尼基化和羧甲基化是KRAS4b-FMe结合膜所必需的。正如预期，KRAS4b-FMe能够结合脂质体，而未经修饰的KRAS4b则不能。尽量缩短蛋白质暴露于低盐环境的时间是影响产率的最关键步骤。在缓冲液E中稀释后，蛋白质仅短暂处于这种低盐浓度环境中。该蛋白质可用于多种生物物理实验，这些实验使用脂质体或纳米盘等膜模拟物来研究KRAS与哪些脂质发生相互作用。利用这些数据，我们可以开始推断KRAS如何与细胞质膜相互作用。利用纯化的KRAS-FMe，我们的同事成功解析了KRAS与一种特异性识别该蛋白法呢基化和甲基化形式的分子伴侣所形成的复合物的X射线晶体结构。

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