完全加工的重组KRAS4b：法尼基化与甲基化蛋白的分离与表征

本方案可实现高得率地分离和纯化经过正确加工的KRAS。所获得的KRAS具有真实的法尼基化和羧甲基化修饰，使其能够像在哺乳动物细胞膜中一样定位于膜结构，从而可用于相关实验研究。本方案的高得率特性使其显著优于以往的方法。

我们通常每升表达材料可纯化出三至五毫克的蛋白质，这使我们能够开展多种生物物理和结构生物学实验。KRAS 在 20% 的癌症中发生突变，在胰腺癌中突变率高达 90%。

因此，建立一种能够产生真实加工后蛋白的实验方案，对于药物筛选的开发非常有用，因为它使你能够研究在癌细胞膜上实际存在的蛋白形式。该方案也十分适用于研究其他在细胞内经过法尼基化并完全加工的蛋白。只需将KRAS替换为目标蛋白，并将其插入杆状病毒中即可。

关键步骤集中在阳离子交换层析环节。使用正确的层析柱，并尽量缩短蛋白在低盐缓冲液中的停留时间，对实验成功至关重要。理解沉淀过程并非类似“雪景球”那样的现象，有助于指导初次操作该方案的研究人员。

通过将阳离子交换柱上样量分为多个较小上样量的必要性进一步证实了这一点。裂解细胞后，澄清裂解液，并通过IMAC纯化目标蛋白，随后使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析蛋白组分。合并峰值组分，并在4°C条件下，用两升缓冲液D对合并液透析过夜。

次日，从透析袋中取出样品，以 4,000 × g 离心 10 分钟，以去除任何沉淀物。最终透析并澄清的样品通常仍略显浑浊，但可直接上样至阳离子交换柱，无需进一步处理。用三倍柱体积的缓冲液 G 冲洗 20 毫升阳离子交换柱，随后用三倍柱体积的缓冲液 F 冲洗。接着，向 20 毫升透析后的样品中加入 20 毫升缓冲液 E，将样品稀释至终浓度为 100 毫摩尔的氯化钠，然后将样品上样至交换柱。

必须将样品少量多次稀释，而不是一次性全部稀释，并且稀释后的样品应在稀释后立即上样至层析柱，以减少蛋白质沉淀。当前一次稀释的样品即将完成上样时，继续加载新稀释的样品。随后用缓冲液 F 洗脱层析柱，直至 280 nm 处的吸光度回到基线水平，通常需要三个柱体积的缓冲液。

用400毫升从缓冲液F到65%缓冲液G的梯度洗脱柱上的蛋白，以6毫升组分收集洗脱液。梯度洗脱完成后，继续用1.5个柱体积的65%缓冲液G洗涤柱子。根据SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析结果以及色谱图的紫外吸收曲线检查情况，选择阳性组分。然后合并蛋白样品，并根据文献所述方法用His6 TEV蛋白酶进行消化。

消化并透析后，将蛋白质以每分钟3毫升的流速上样至已用缓冲液A平衡的20毫升IMAC柱。在此层析过程中收集每份7毫升的组分，并用总共三个柱体积的缓冲液A洗涤柱子，直至吸光度达到基线水平。用缓冲液C从0%到10%的五个柱体积梯度洗脱目标蛋白，并收集每份7毫升的组分。

然后通过SDS-PAGE鉴定阳性组分。在进行SDS-PAGE分析时，澄清裂解液中应出现一条迁移至约65千道尔顿的深染条带，对应于融合蛋白His6-MBP-tev-KRAS4b。共表达的FNTAb迁移至48千道尔顿。

纯化过程中的CEX步骤至关重要，因为它能够减少蛋白水解的程度，并富集完全加工的蛋白，但也是该实验方案中最复杂的部分。此步骤的典型结果是KRAS4b-FMe出现明显的第三峰，但洗脱谱图可能具有变异性。采用ESIMS进行完整质谱分析可确认蛋白质的精确分子量，从而确定法尼基化或羧甲基化的相对比例。

尽管典型的终产物中均含有可检测到的KRAS4b-FARN，但根据本分析，其比例在峰高上低于15%。采用原生质谱分析法测定与GDP结合的KRAS4b的分子量。将样品溶剂置换为乙酸铵，以确保更温和的离子化过程，从而使原生复合物保持完整。

通过表面等离子共振技术检测了KRAS4b-FMe与脂质体的相互作用，以验证法尼基化和羧甲基化是KRAS4b-FMe结合膜所必需的。正如预期，KRAS4b-FMe能够结合脂质体，而未经修饰的KRAS4b则不能。尽量缩短蛋白质暴露于低盐环境的时间是影响产率的最关键步骤。

在缓冲液E中稀释后，蛋白质仅短暂处于这种低盐浓度环境中。该蛋白质可用于多种生物物理实验，这些实验使用脂质体或纳米盘等膜模拟物来研究KRAS与哪些脂质发生相互作用。利用这些数据，我们可以开始推断KRAS如何与细胞质膜相互作用。利用纯化的KRAS-FMe，我们的同事成功解析了KRAS与一种特异性识别该蛋白法呢基化和甲基化形式的分子伴侣所形成的复合物的X射线晶体结构。