完全加工重组KRAS4b:分离和描述脱脂和甲基化蛋白
2020年1月16日
前膜化是外周膜结合蛋白的重要修饰。昆虫细胞可以纵产生脱脂和甲苯甲酸化 KRAS4b 的数量，使生物物理测量蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - 脂质相互作用
我们的协议允许在高产量下分离和分离正确处理的KRAS。正宗法化和碳化 KRAS 的生产使得可以像在哺乳动物细胞中一样进行膜中包含 KRAS 的实验。该协议的高产量使它与以前的工作不同。
我们通常每升表达材料纯化三到五毫克蛋白质。这使我们能够进行各种生物物理和结构生物学实验。KRAS在20%的癌症和90%的胰腺癌中发生变异。
因此，有一个协议，以产生真正的加工蛋白质是相当有用的开发药物屏幕，以便你可以研究实际蛋白质，因为它将在癌细胞的膜上。该协议对于研究其他在细胞中被法化和完全加工的蛋白质也非常有用。因此，所有你需要做的是交换出KRAS与感兴趣的蛋白质，并把它放在杆菌病毒。
关键步骤是围绕阳离子交换色谱的。使用适当的列并限制蛋白质在低盐缓冲液中的时间是成功的关键。了解降水不是雪球类型的事件有助于指导那些新到协议。
这通过显示需要将阳十一交换柱负载划分为多个较小的负载而得到加强。在细胞分解后，澄清乳酸，通过IMAC纯化目标蛋白质，使用SDS页面和库马西染色分析蛋白质分数。将峰值分数池池，在四摄氏度下将池对两升缓冲 D 进行一夜。
第二天，从透析中取出样品，以4000次g离心10分钟，取出任何沉淀物。最终的拨号和澄清样本通常仍然模糊不清，但可以应用于 CEX 列，而无需进一步处理。用三列缓冲液G洗涤20毫升阳离子交换柱，然后用三列缓冲液F.Next，通过加入20毫升缓冲器E，将透析样品的20毫升稀释到100毫升的氯化钠浓度，最后为100毫升的氯化钠浓度，然后将样品应用到交换柱上。
稀释少量样品而不是一次全部稀释至关重要，稀释后的样品应立即应用于柱，以限制蛋白质的沉淀。继续用刚稀释的样品加载柱，因为之前的稀释接近负载的末尾。然后用缓冲 F 将柱洗到基线吸收度 280，这通常需要三个列卷。
从柱中用400毫升梯度从缓冲液F到65%缓冲G的蛋白质，以6毫升分数收集埃卢因。梯度完成后，继续清洗列，以增加 1.5 列卷 65%缓冲 G. 选择基于 SDS 页面和 Coomassie Blue 污渍分析的正分数，以及检查色谱图的 UV 轨迹。然后根据手稿指示将蛋白质汇集并与 His6 TEV 蛋白酶一起消化。
消化和透析后，将蛋白质加载到20毫升的IMAC柱上，以每分钟3毫升的速度与缓冲液 A进行平衡。在此色谱中收集七毫升分数，用三列缓冲器 A 或直到达到基线吸收度之前清洗柱。用缓冲液C的五列体积梯度从0%至10%将目标蛋白从0%至10%，并收集7毫升分数。
然后使用 SDS 页确定正分数。当使用SDS页面分析时，澄清的芦酸应包含一个暗带，该暗带会迁移到约65千吨，与融合蛋白 His6-MBP-tev-KRAS4b 相对应。共同表达的FNTAb迁移到48千吨。
纯化中的 CEX 步骤至关重要，因为它可降低蛋白解的程度并丰富完全加工的蛋白质，但却是协议中最复杂的部分。此步骤的典型结果具有 KRAS4b-FMe 的突出峰值三，但洗脱配置文件可以是可变的。使用ESIMS进行的完整性质量分析证实了蛋白质的精确分子质量，从而确认了远尼化或碳甲基化的相对比例。
虽然典型的最终地段包含一些可检测的KRAS4b-FARN，但根据此分析，这一比例在峰值高度方面低于15%。原生质量分析用于确定与 GDP 绑定的 KRAS4b 的质量。将样品溶剂交换为醋酸铵，以确保更柔和的电离，使原生复合物保持完好无损。
用表面质膜共振测量了KRAS4b-FMe和脂质体之间的相互作用，以验证KRAS4b-FMe与膜结合所需的法尼化和碳氧甲基化。正如所料，KRAS4b-FMe 绑定到脂质体，而未处理的 KRAS4b 没有。尽量减少蛋白质暴露于低盐的时间是协议中影响产量的单一最重要的方面。
在缓冲液E稀释后，该蛋白的盐浓度仅处于这种低盐浓度，该蛋白可用于各种生物物理实验，这些实验使用脂质体或纳米光片等膜仿生学来研究KRAS与哪些脂质相互作用。利用这些数据，我们可以开始推断KRAS如何与细胞的等离子膜相互作用。使用纯化的KRAS-FMe，我们的同事能够解决KRAS的X射线晶体结构在复杂的陪护，这是特定于这种蛋白质的法尼化和甲基化形式。
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概述
本研究提出了一种高产量生产法，用于生产法尼基化和羧基甲基化KRAS，从而实现蛋白质相互作用的生物物理测量。该方法能够分离出经过适当加工的KRAS，便于模拟哺乳动物细胞条件的实验。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 结构生物学
- 细胞生物学
背景
- KRAS是参与细胞信号传导的关键蛋白。
- KRAS的突变在多种癌症中普遍存在，特别是胰腺癌。
- 法尼基化对于KRAS的膜定位和功能至关重要。
- 现有的KRAS生产方法在产量和真实性方面存在局限。
研究目的
- 开发一种生产高产量法尼基化和羧基甲基化KRAS的协议。
- 在类似膜的环境中使用KRAS进行生物物理和结构生物学实验。
- 改进先前的KRAS生产方法。
所用方法
- 从昆虫细胞中分离和纯化KRAS。
- 蛋白质修饰的表征。
- 蛋白质产量的定量测量。
- 用于研究蛋白质相互作用的生物物理分析。
主要结果
- 该协议每升表达材料产生三到五毫克的KRAS。
- 成功生产出适合实验的真实修饰的KRAS。
- 证明了能够进行各种生物物理实验的能力。
- 突出了KRAS在癌症研究中的重要性。
结论
- 开发的协议提供了一种可靠的KRAS生产方法。
- 高产量促进了广泛的实验应用。
- 这项工作有助于理解KRAS在癌症生物学中的作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Producing authentically processed KRAS4b enables physiologically relevant studies of oncogenic signaling and membrane interactions. High-yield purification supports scalable biophysical and structural assays for target validation. This approach de-risks downstream drug discovery by providing a disease-relevant system that mimics native KRAS membrane localization and function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of KRAS4b membrane association and effector binding in a fully processed state.
- Operational Value: Provides homogeneous protein for consistent biophysical readouts in target engagement studies.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by validating farnesylation and carboxymethylation as prerequisites for plasma membrane localization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated KRAS4b-FMe for liposome-based binding assays using surface plasmon resonance.
- Operational Value: Delivers milligram-scale yields suitable for high-throughput screening campaign inputs.
- Scientific Value: Enables preparation of membrane mimetics to study lipid specificity and compound effects on KRAS-membrane interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates structural biology efforts, such as X-ray crystallography of KRAS4b in complex with farnesylation-specific chaperones.
- Operational Value: Yields nucleotide-bound KRAS4b-GDP complexes confirmed by native mass spectrometry for mechanistic studies.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by linking post-translational processing to oncogenic signaling competence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by supplying authentic KRAS4b for hypothesis testing, assay development, and structural validation.
- Discovery Biology: Supports functional validation of KRAS4b effectors and GTPase cycling in a membrane-competent format.
- Screening: Enables liposome-based SPR assays to measure compound-induced changes in KRAS-membrane affinity.
- Analytics: Uses intact and native mass spectrometry to confirm farnesylation, carboxymethylation, and nucleotide binding status.
- Translational Research: Connects post-translational processing to membrane localization, a key determinant of KRAS signaling output.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other CAAX-box proteins via baculovirus swap, enabling platform-wide application across prenylated target families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target behavior through physiologically accurate post-translational modification.
- Operational Value: High-yield purification (3–5 mg/L) reduces material bottlenecks for extensive experimental campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false negatives in membrane-dependent assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of KRAS-targeted modalities based on authentic target engagement data.
Implementation Considerations
- Expertise in baculovirus expression and insect cell culture is required for recombinant protein production.
- Cation exchange chromatography demands precise buffer gradients and split-loading to prevent precipitation and proteolysis.
- Standardization across teams relies on consistent dialysis, clarification, and fraction analysis via SDS-PAGE and UV tracing.
- Adaptation to other prenylated proteins requires optimization of IMAC and CEX conditions based on protein-specific properties.
- Practical limitations include sensitivity to low-salt exposure during purification, which impacts yield and necessitates rapid processing.
