骨肉瘤来源细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1甲基化分析

DNA甲基化是最受关注的表观遗传标志之一。多种癌症的特征是DNA甲基化水平发生变化，这些变化与异常的基因表达及其他基因组异常相关。长散在核元件是一类重复的可移动基因组序列，通常具有较高的甲基化水平。

然而，这些序列在癌症中常常发生高甲基化，导致其被激活并引发染色体不稳定性。在本研究中，我们用骨肉瘤来源的细胞外囊泡处理间充质干细胞，以观察癌症来源的EVs是否能够影响MECs中LINE-1的甲基化状态。胎牛血清是哺乳动物细胞培养基的重要组成部分，其中含有大量牛源性的EVs。

这些细胞外囊泡（Evs）会干扰我们所关注的细胞来源的Evs的分析，因此在培养用于Evs分离的细胞时，使用去除Evs的胎牛血清（FBS）至关重要。将FBS加入超速离心管中，并放入超速离心机的转子吊桶内。在将吊桶装载到摆动转子上之前，需将其平衡至相互之间重量差异不超过10毫克。

将转子放入超速离心机中，在 4°C 条件下以 100,000 G 离心 19 小时。离心结束后，小心收集上清液中颜色较浅的上层部分，并转移至 50 毫升离心管中。切勿扰动或吸取深棕色沉淀物，因其含有来自 FBS 的细胞外囊泡（EVs）。

将上清液通过0.22微米滤器过滤至新的50毫升离心管中。此经过滤除菌、去除了细胞外囊泡（EV）的胎牛血清（FBS）现在可用于细胞培养，以培养用于EV分离的细胞。收集在去除了EV的培养基中培养的骨肉瘤细胞的条件培养基。

为去除细胞及细胞碎片，将条件培养基在 4°C 下以 2500 G 离心 20 分钟。将上清液转移至超速离心管中，并像之前一样进行平衡。在 4°C 下以 100,000 G 离心 2 小时。

小心弃去上清液，底部保留约1毫升。向管中加入约20毫升PBS，轻轻吹打以洗涤并重新悬浮EV沉淀。平衡试管后，使用相同设置进行另一轮超速离心。

小心移除上清液，并通过轻柔吹打，将EV沉淀重悬于200 µL PBS中。将EV储存于低吸附性离心管中。纯化的EV通过蛋白质印迹、纳米颗粒追踪分析和透射电子显微镜进行表征。

将15,000个MSCs每孔接种于24孔板中。24小时后，弃去旧培养基，用PBS洗涤细胞，并更换为无EV培养基。在预定时间点用OS-EVs处理细胞。

停止EV处理后，使用适当的方法从细胞中提取DNA。对于甲基化分析，我们采用了一种定制的甲基化特异性探针扩增方法。按照Pavicic等人先前的方法设计定制的LINE-1探针。

对于甲基化探针，选择三个在启动子区域内含有HhaI限制性酶切位点的序列。对于对照探针，从LINE-1序列的其余部分选择七个不含HhaI限制性酶切位点的序列。将70纳克DNA样本用TE缓冲液稀释至5微升。

将样品在 98 摄氏度下加热 10 分钟，然后冷却至 25 摄氏度。向每个样品中加入 3 微升探针杂交混合液，并运行 PCR 仪，使探针与 DNA 杂交。在室温下，向每个样品中加入 30 微升杂交后混合液。

取10 µL转移至第二个试管中。将两组试管均放入热循环仪，于48 °C孵育至少1分钟。当样品处于48 °C时，向第一组试管中加入10 µL连接反应混合液，向第二组试管中加入10 µL连接-消化反应混合液。

运行下一个热循环程序。然后离心收集管内液体，并同时将热循环仪预热至72摄氏度。向每根管中加入5 µL聚合酶混合液，然后将各管放入热循环仪中。

运行PCR程序。在PCR程序运行的同时，准备含有2.5微升分子量标准品的1毫升甲酰胺溶液。用移液器将10微升该溶液加入光学96孔板的每一孔中。

PCR结束后，将未消化的样品用超纯水稀释至1:100，将消化后的样品用超纯水稀释至1:200。取2微升稀释后的PCR产物加入96孔板中。以200 ×g离心15至20秒，以去除气泡。

通过毛细管电泳对样本进行片段分析。在电泳图分析软件中打开毛细管电泳结果。选择一个样本，并从菜单中将面板设置为 MLPA。

单击面板并按 Ctrl+D，将此设置应用于所有样本。以类似方式，将所有样本的分析方法设置为微卫星默认方法。选择所有样本，然后单击绿色播放按钮以运行分析，接着再次选择所有样本，单击图形按钮以可视化探针峰。

放大峰区域以获得更高分辨率的各个峰。确保标记了与 LINE-1 探针混合物中探针相对应的全部 10 个峰。在基因型标签页中，以 CSV 格式导出结果。

在数据分析软件中打开 CSV 文件，并将数据整理成列。根据三个甲基化位点峰的大小对其进行标注。其余七个峰对应于对照探针。

此处我们使用长度约为117个碱基对的LINE-1 2M探针峰。对于每个样本，计算全部七个对照峰的峰面积总和，并将每个LINE-1探针的峰面积除以该总和。

对于每个样本，将消化后样本的数值除以未消化样本的数值，以获得甲基化剂量比。Western印迹分析证实了骨肉瘤细胞外囊泡（OS-EVs）的存在，检测到TSG101、HSP70和CD63的信号。Calnexin信号的缺失表明EV样本纯度较高。

通过透射电子显微镜（TEM）观察到OS-EV样本中存在不同大小的完整囊泡，进一步表明其纯度。采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定OS-EV的粒子浓度和粒径分布，80%的EVs粒径分布在50至200纳米范围内。

在此图中，我们可以观察到间充质干细胞（MSCs）在不同时间点接受细胞外囊泡（EV）处理后的LINE-1甲基化剂量比。灰色线条代表时间点零时的基线甲基化水平。在时间点三，给予EVs后，平均甲基化剂量比下降，表明发生了高甲基化。

在第七个时间点，EVs 的这种高甲基化效应较不明显。本文展示了一种简单、高灵敏度且稳健的甲基化分析技术。该方法仅需少量 DNA，无需亚硫酸氢盐转化步骤，且适用于从石蜡包埋样品中提取的 DNA。

整个方法包括实验和分析部分，大约需要两天时间。由于基因组中 LINE-1 的拷贝数较高，正常样本中 LINE-1 的基础甲基化水平也较高。因此，通过该方法观察到的样本间甲基化水平的差异可能较为细微。