Name: 单个细胞分辨率三维成像的有机体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 了解单细胞分辨率三维成像技术，通过光学透明化和共聚焦显微镜实现类器官结构可视化。该方法可在三天内完成样本制备，适用于发育生物学和疾病建模研究。

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我们非常感谢儿科肿瘤学公主玛克西玛中心提供的技术支持，以及乌得勒支休伯列希特研究所和蔡司公司在成像方面的支持与合作。所有成像工作均在儿科肿瘤学公主玛克西玛成像中心完成。本研究由儿科肿瘤学公主玛克西玛中心提供资金支持。JFD 获得了玛丽·居里全球奖学金以及荷兰科学研究组织（NWO）VENI 项目资助。ACR 获得了欧洲研究理事会（ERC）启动基金的支持。

使用小鼠来源的类器官符合监管标准，并已获得沃尔特与伊丽莎·霍尔研究所（WEHI）动物伦理委员会的批准。所有人源类器官样本均通过Hubrecht类器官技术中心（HUB，www.hub4organoids.nl）从生物样本库中获取。HUB已向乌得勒支大学医学中心（UMC Utrecht）医学伦理委员会（METC UMCU）申请并获得授权，以确保符合荷兰《涉及人类受试者的医学研究法案》的要求，并在适当情况下获得了供体的知情同意。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>配制 4% (w/v) 多聚甲醛（PFA）溶液：将 400 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）置于水浴中加热至接近 60 °C，加入 20 g PFA 粉末，使用搅拌器溶解。
	<ol>
		<li>随后加入几滴 10 M NaOH。冰上冷却后，加入几滴 10 M HCl 调节 pH 至 7.4。用 PBS 定容至 500 mL，分装（于 -20 °C 保存，最长 2 个月）。 
		注意：加热温度不得超过 60 °C，以免 PFA 降解。制备时间 = 4 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制含 Tween-20 的 PBS 缓冲液（PBT，0.1% v/v）：向 1 L PBS 中加入 1 mL Tween-20（4 °C 保存，最长 4 周）。 
	注意：制备时间 = 10 分钟。</li>
	<li>配制 100 mL 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液：将 18.6 g EDTA 和 2.5 g NaOH 加入 80 mL 去离子水（dH2O）中，用 1 M NaOH 调节 pH 至 8，再用去离子水定容至 100 mL。</li>
	<li>配制 500 mL 1 M Tris 缓冲液：将 60.55 g Tris 溶于 300 mL 去离子水（dH2O）中，加入 42 mL 浓盐酸（36−38%），调节 pH 至 8，再定容至 500 mL。</li>
	<li>配制类器官洗涤缓冲液（OWB）：向 1 L PBS 中加入 1 mL Triton X-100、2 mL 10% (w/v) SDS 和 2 g 牛血清白蛋白（BSA）（4 °C 保存，最长 2 周）。 
	注意：制备时间 = 10 分钟。</li>
	<li>配制 220 mL FUnGI 溶液：将 110 mL 甘油与 20 mL 去离子水（dH2O）、2.2 mL Tris 缓冲液（1 M，pH 8.0）和 440 µL EDTA（0.5 M）混合。加入 50 g 果糖，在室温（RT）避光条件下搅拌至完全溶解。溶液澄清后，再加入 49 g 果糖，搅拌至溶解。随后加入 33.1 g 尿素，搅拌至完全溶解（4 °C 避光保存）。 
	注意：不可加热，因果糖在高温下易发生焦糖化。FUnGI 溶液组成为：50% (v/v) 甘油、9.4% (v/v) dH2O、10.6 mM Tris 碱、1.1 mM EDTA、2.5 M 果糖和 2.5 M 尿素。制备时间 = 1 天。</li>
	<li>配制 PBS-BSA（1% w/v）溶液：将 1 g BSA 溶于 100 mL PBS 中（4 °C 保存，最长 2 周）。 
	注意：制备时间 = 10 分钟。</li>
</ol>
2. 类器官回收
注意：以下步骤适用于在基底膜提取物（BME）中培养、于24孔板中生长且大小为100−500 µm 的类器官。
<ol>
	<li>吸去培养基，用预冷的 PBS 洗涤 1 次。避免破坏 3D 基质。</li>
	<li>将培养板置于冰上，每孔加入 1 mL 预冷的细胞回收溶液（材料表），在 4 °C 条件下于水平摇床（40 rpm）孵育 30−60 分钟。 
	注意：3D 基质液滴应完全溶解。</li>
	<li>将 1 mL 枪头浸入 1% PBS-BSA 溶液中并反复吹吸 2 次，使其内壁包被 BSA。该包被可防止类器官黏附枪头。为包被 15 mL 圆底离心管内壁，可加入 5 mL 1% PBS-BSA 溶液，倒置 2−3 次后弃去 PBS-BSA 溶液。 
	注意：在固定前（步骤 3.3）的所有塑料耗材均需进行此包被处理。</li>
	<li>使用已包被的枪头，轻柔吹打每孔内容物 5−10 次，将类器官转移至已包被的 15 mL 离心管中。相同类型的类器官可从不同孔合并至同一离心管。</li>
	<li>向每孔加入 1 mL 预冷的 1% PBS-BSA 溶液，冲洗并收集残留的类器官。</li>
	<li>加入预冷 PBS 至总体积 10 mL，于 4 °C 以 70 × g 离心 3 分钟，获得紧实的沉淀，且无可见的 3D 基质层。小心吸除上清液。</li>
</ol>
3. 固定与封闭
<ol>
	<li>使用经包被的1 mL枪头，将类器官在1 mL预冷的PFA中轻轻重悬。</li>
	<li>在4 °C固定45分钟，固定过程中途使用经包被的1 mL枪头轻轻重悬类器官，以确保所有类器官固定均匀。</li>
	<li>向离心管中加入10 mL预冷的PBT，轻轻颠倒混匀，于4 °C孵育10分钟，然后在4 °C以70 × g离心沉淀。 
	注意：从本步骤开始，大多数类器官类型在固定后不再黏附枪头，因此通常无需再使用包被枪头。但某些类器官即使在固定后仍需使用包被耗材。</li>
	<li>将沉淀重悬于预冷的OWB中（每孔至少200 μL OWB）以进行封闭，并将类器官转移至24孔悬浮培养板。 
	注意：一个较大沉淀中的类器官可分装至多个孔中，以进行不同的染色处理。</li>
	<li>在4 °C孵育至少15分钟。</li>
</ol>
4. 免疫标记
<ol>
	<li>用移液器将 200 μL OWB 加入空孔中，作为空白对照孔。 
	注意：免疫标记也可在 48 孔板或 96 孔板中进行，以减少抗体用量。但需注意，由于体积较小，染色和洗涤效果可能会降低。</li>
	<li>让类器官在培养板底部自然沉降。 
	注意：可通过体视显微镜观察确认，使用深色背景可使观察更清晰。</li>
	<li>将培养板倾斜 45°，吸除上清液，保留 200 μL OWB 中的类器官（可使用对照孔来估测 200 μL 体积）。</li>
	<li>加入含 2 倍浓缩的一抗的 200 μL OWB（例如，用于图 1结果的 E-cadherin [1:400] 和 Ki67 [1:200]；用于图 2结果的 keratin 5 [1:500]、keratin 8/18 [1:200]、MRP2 [1:50] 和 Ki67 [1:200]），在 4 °C 下轻轻振荡/摇动（水平摇床 40 rpm）孵育过夜。</li>
	<li>次日，加入 1 mL OWB。</li>
	<li>让类器官在培养板底部沉降 3 分钟。吸除上清液，保留 200 μL OWB。再加入 1 mL OWB，并在轻微振荡/摇动下洗涤 2 小时。</li>
	<li>重复步骤 4.6 两次。</li>
	<li>让类器官在培养板底部沉降 3 分钟。吸除上清液，保留 200 μL OWB 在孔中。</li>
	<li>加入含 2 倍浓缩的二抗、偶联抗体和染料的 200 μL OWB（例如，用于图 1结果的 DAPI [1:1000]、rat-AF488 [1:500]、mouse-AF555 [1:500]、phalloidin-AF647 [1:100]；用于图 2结果的 DAPI [1:1000]、rat-AF488 [1:500]、rabbit-AF555 [1:500]、mouse-AF555 [1:500]、phalloidin-AF647 [1:100]；用于图 3结果的 DAPI [1:1000]、phalloidin-AF647 [1:100]），在 4 °C 下轻轻振荡/摇动孵育过夜。</li>
	<li>次日，重复步骤 4.5−4.7。</li>
	<li>将类器官转移至 1.5 mL 离心管中，在 70 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
</ol>
5. 类器官的光学透明化
<ol>
	<li>用移液器尽可能吸除旧培养基，注意不要破坏类器官。</li>
	<li>使用剪去末端的200 μL枪头加入FUnGI（至少50 μL，室温），轻轻重悬以避免产生气泡。室温孵育20分钟。 
	注意：FUnGI的光学透明化处理可能导致轻微的组织收缩。这不会影响单层和多层类器官的整体形态；然而，具有大腔的球形单层类器官可能会塌陷。此步骤可暂停，样品可在4 °C保存（至少1周）或在-20 °C保存（至少6个月）。</li>
</ol>
6. 共聚焦成像用玻片的制备
<ol>
	<li>使用带硅胶密封剂的10 mL注射器（材料表）。连接一个200 μL吸头，并剪去其末端，以便按压注射器时硅胶能够缓慢均匀地流出。用该注射器在载玻片中央绘制一个1 cm × 2 cm的矩形区域。</li>
	<li>剪去一个200 μL吸头的末端，将FUnGI中的类器官转移至矩形区域中央。</li>
	<li>盖上盖玻片。为尽量减少气泡残留，先将盖玻片左侧边缘接触液滴，再缓慢从左向右放下盖玻片，直至无气泡残留，然后松开盖玻片。 
	注意：可使用与类器官大小相近的间隔物，以防止类器官受损。</li>
	<li>轻轻按压盖玻片的所有边缘，使其牢固粘附于硅胶密封剂上。载玻片现已准备好用于成像。 
	注意：此步骤可暂停，样品可在4 °C下保存（至少1周）或在-20 °C下保存（至少6个月）。</li>
</ol>
7. 图像采集与处理
<ol>
	<li>使用共聚焦激光扫描显微镜（材料表），采用多介质浸没式25倍或油浸式40倍物镜对载玻片进行共聚焦成像。
	<ol>
		<li>25倍物镜的采集参数设置如下：扫描模式为帧扫描，帧尺寸为1024 × 1024，体素尺寸为332 nm × 332 nm × 1.2 µm，像素驻留时间&#60;2 µs，双向扫描，平均次数为1，位深度为8。为减少光漂白，应使用低激光功率（通常&#60;5%，弱染色时&#60;10%）。</li>
		<li>使用Z轴堆栈模式定义上下边界，并将Z步进大小设置为最优值。在对大型类器官结构或多个类器官同时成像时，使用拼接模式，重叠率为10%，并标明感兴趣区域。 
		注意：采用上述设置时，直径&#60;300 µm的典型类器官所生成的数据大小通常&#60;1 GB。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于拼接扫描数据集，在显微镜配套软件（材料表）中对图像文件进行拼接。在处理选项中选择拼接作为方法，在参数下选择新建输出，并选择待拼接的文件。点击应用开始拼接。</li>
	<li>在成像软件（材料表）的3D视图选项卡下获取图像的三维渲染图像，随后优化亮度、对比度及三维渲染属性。将结果以RGB快照形式导出为TIFF文件。</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshot%3A+Growing+Organoids+from+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Bartfeld, S., Stem Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Science Translational Medicine. 8 (344), 84(2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Multipotent+Luminal+Progenitor+Cells+in+Human+Prostate+Organoid+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Nanki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Routes+toward+Wnt+and+R-spondin+Niche+Independency+during+Human+Gastric+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis.</a> Cell. 174 (4), 856-869 (2018).</li>
<li>Jamieson, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+a+robust+mouse+mammary+organoid+system+for+studying+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics.</a> Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+In+vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-+or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
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<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
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<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提出了一种对完整类器官进行单细胞分辨率三维成像的详细方案。要成功实施该方案，必须注意若干关键步骤。本节将重点说明这些步骤，并提供相应的故障排除建议。
第一个关键步骤是去除三维基质。大多数类器官在体外培养时依赖于模拟体内细胞外环境的基质，以促进形成具有良好极性的三维结构。虽然可以在三维基质内直接进行固定和后续染色，但这可能不利于抗体的渗透，或导致较高的背景信号（数据未显示）。基质的有效去除受基质类型、类器官的数量与大小以及培养时间长短的影响，因此在不同培养条件下可能需要优化。对于在Matrigel或BME中培养的类器官，使用冰冻的细胞回收溶液处理30−60分钟即可充分溶解基质，同时不损伤类器官。此外，去除支撑性的三维基质可能导致天然结构的丢失，以及类器官与其他细胞类型（例如与成纤维细胞或免疫细胞共培养时）之间接触的破坏。同时，理想的类器官固定对于维持三维组织结构、蛋白质抗原性以及最小化自发荧光至关重要。通常，在4 °C条件下使用4%多聚甲醛（PFA）固定45分钟，足以满足多种类器官和抗原的标记需求。然而，对于表达荧光报告蛋白的类器官，通常需要更长的固定时间（最长可达4小时），但需根据不同荧光染料进行优化。少于20分钟的固定时间不足以使用鬼笔环肽探针有效标记F-肌动蛋白。另一个常见问题是实验过程中类器官的丢失。因此，必须注意以下几点：（i）在处理未固定的类器官时，应按照说明小心地用1% BSA-PBS预包被移液枪头和离心管，以防止类器官粘附在塑料表面；（ii）使用低吸附性或悬浮培养板，避免样本粘附在培养板上；（iii）在小心吸除缓冲液前，给予足够时间让类器官沉降到培养板底部。移取黏稠的FUnGI时可能引入气泡。将透明化后的样本在室温下操作可降低黏度，提高操作便利性，从而减少类器官的损失。尽管大多数类器官易于操作，但具有扩大腔室的囊状类器官在使用4% PFA固定或FUnGI透明化时极易塌陷。使用其他固定剂（如福尔马林或PFA-戊二醛）可在一定程度上减轻该现象，但无法完全避免，且可能影响自发荧光、抗体渗透性及表位可及性。当囊状类器官在透明化后出现折叠现象时，建议跳过透明化步骤，改用多光子显微镜成像，因其受光散射的影响较小。最后，获取完整的类器官三维结构具有挑战性，要求盖玻片与类器官之间的距离尽可能小。此外，若类器官在其封片剂中有移动空间，则在Z轴深度采集数据时可能发生X轴和Y轴方向的偏移。在载玻片制备过程中减少硅胶密封剂的用量，可解决盖玻片与显微镜载玻片之间封片不理想的问题。然而，硅胶用量过少可能导致类器官受压，从而丧失其固有的三维结构。FUnGI因其较高的黏度，可改善载玻片封片过程中的操作性，并在成像过程中增强类器官的稳定性。
尽管该方案可用于广泛的应用，以深入研究完整类器官的细胞内容和三维结构，但仍需考虑某些局限性。该方法通量较低且耗时较长。实际上，使用者应注意到，对较大的完整类器官进行三维成像需要同时进行图像拼接和Z轴采样，导致成像时间延长。通过使用具备共振扫描或转盘扫描功能的显微镜设备，或采用光片显微镜技术26，可实现更快的成像速度。另一个需要注意的问题是，来自同一样本的不同类器官之间，标记物的表达可能存在异质性。因此，应采集多个类器官，以更全面地反映培养过程中类器官的异质性。最后，尽管完整的湿实验流程较为简单，但数据的后期处理需要具备使用图像分析软件进行三维可视化和定量分析的能力，以及运用统计学方法挖掘数据集中全部信息的能力。
在过去十年中，得益于多种光学透明剂的开发以及显微镜技术和计算技术的进步，体积成像领域取得了显著进展27,30,31。过去大多数研究集中于器官或相关肿瘤的大体积成像，而近年来已发展出适用于更小且更脆弱组织（包括类器官结构）的成像方法36,37,38。我们近期发表了一种简单、快速的方法，可用于对不同来源、大小和形状的完整类器官进行单细胞水平的全装片成像，并实现后续的三维重建与图像分析26，本文在此基础上进行了若干改进（例如FUnGI、硅胶封片），并配套提供了视频实验方案。与传统的基于二维切片的成像方法相比，该方法在解析复杂细胞形态和组织结构方面具有明显优势（图2），且在配备共聚焦显微镜的实验室中易于实施。通过对该方案进行轻微调整，样本还可适用于超分辨率共聚焦、多光子以及光片成像等多种成像模式，因而本方案具有广泛的适用性，为研究人员提供了一种强大的工具，以更深入地理解类器官模型所呈现的多维复杂性。

新型培养方法（如类器官技术）的进步使得在培养皿中培养器官成为可能1。类器官可发育为三维（3D）结构，与其来源组织在形态和功能特征上高度相似。目前，类器官在回答基础生物学问题2、模拟包括癌症在内的各类疾病3，以及开发个体化治疗策略4,5,6,7等方面发挥着关键作用。自首个由肠道成体干细胞衍生类器官的培养方案建立以来8，类器官技术已拓展至多种来源于前列腺9、脑10、肝11,12、胃13、乳腺14,15、子宫内膜16、唾液腺17、味蕾18、胰腺19和肾脏20的正常及癌变组织。
类器官的发展与新型三维显微成像技术的进步同步，后者能够对完整组织样本进行三维结构的可视化观察21,22,23,243D成像在可视化生物样本复杂结构方面优于传统的2D组织切片成像。3D信息对于理解完整生物样本中的细胞组成、细胞形态、细胞命运决定及细胞间相互作用至关重要。如今，非破坏性光学切片技术，如共聚焦或多光子激光扫描显微镜（CLSM和MLSM）以及光片荧光显微镜（LSFM），能够在一个生物样本内同时实现精细结构与整体组织架构的联合可视化。这种强大的成像方法为研究可由类器官建模的结构复杂性提供了机会。25 并绘制构成这些三维结构的所有单个细胞的空间分布、表型特征及细胞状态。
近期，我们发表了一项用于固定并透明化类器官高分辨率三维成像的详细实验方案26。该方案专为处理精细的类器官结构而设计和优化，不同于用于大型完整组织的透明化方法，如DISCO27,28、CUBIC29,30,31和CLARITY32,33。因此，该方法普遍适用于来源、大小、形状及细胞组成各异的多种类器官。此外，与其他通常耗时耗力的三维成像方案相比，本方案操作简便，可在3天内完成。我们已将该三维成像方案应用于可视化多种新开发的来源于不同组织的类器官系统的结构和细胞组成，包括人呼吸道34、肾脏20、肝脏11以及人乳腺癌类器官15。结合多色荧光谱系示踪技术，该方法还被用于揭示小鼠乳腺类器官中基底细胞的生物学潜能14。
本文通过引入无毒透明剂FUnGI35对实验方案进行了优化。FUnGI透明化仅需一步孵育，因其具有适当黏度而更易于封片，并且在储存过程中能更好地保持荧光信号。此外，我们在洗涤缓冲液中添加了十二烷基硫酸钠（SDS），以增强细胞核染色效果，并采用基于硅胶的封片方法，便于显微镜观察前的载玻片制备。图1展示了本方案的流程示意图（图1A）以及三维成像类器官的示例（图1B−D）。简而言之，类器官从三维基质中回收后，经过固定和免疫标记，进行光学透明化处理，随后利用共聚焦显微镜成像，最后通过可视化软件进行三维重建。&#160;

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 安全锁离心管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 安全锁离心管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>细胞回收溶液</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜软件 ZEN</td><td>Zeiss</td><td>ZEN black/blue</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 #1.5 24×60 mm</td><td>Menzel-Glazer</td><td>G418-15</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 #1.5 48×60 mm</td><td>ProSciTech</td><td>G425-4860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>解剖体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带 12.7 mm × 6.35 m</td><td>Scotch 3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1×</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Focus Clear</td><td>CelExplorer</td><td>FC-101</td><td></td></tr><tr><td>果糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Boom</td><td>76050771.0500</td><td></td></tr><tr><td>刻度移液管</td><td>Samco</td><td>222-15</td><td></td></tr><tr><td>水平摇床</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Ajax Firechem.</td><td>265.2.5L-PL</td><td>10 M 储存液，具有腐蚀性</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 显微镜载玻片</td><td>ThermoFisher</td><td>10143352</td><td>磨边，90 度，26 mm～76 mm</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td>危险品</td></tr><tr><td>鬼笔环肽 Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A22287</td><td>稀释比例 1:100–200</td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白</td><td>ThermoFisher</td><td>13-1900</td><td>稀释比例 1:400</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>B56</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>角蛋白 5</td><td>BioLegend</td><td>905501</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>角蛋白 8/18</td><td>DSHB（爱荷华大学）</td><td></td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>MRP2</td><td>Abcam</td><td>ab3373</td><td>稀释比例 1:50</td></tr><tr><td>二抗 大鼠 IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21208</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>二抗 小鼠 IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher</td><td>A-31570</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>二抗 兔 IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher</td><td>A-31572</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>硅酮密封胶</td><td>Griffon</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>ThermoFisher</td><td>28312</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）颗粒</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td>10 M 储存液，具有腐蚀性</td></tr><tr><td>悬浮细胞培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24 孔</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>11486631</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8532</td><td>危险品</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 低熔点琼脂糖</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>工作站</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

单细胞分辨率下完整类器官的三维成像

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

类器官技术，即微型组织的体外三维培养，为研究调控器官发育、功能及疾病发生的细胞过程开辟了新的实验窗口. 荧光显微镜在详细表征类器官的细胞组成以及证明其与来源组织的相似性方面发挥了重要作用。本文中，我们提供了一套完整的方案，用于在免疫荧光标记后对整个类器官进行高分辨率三维成像。该方法广泛适用于不同来源、大小和形状的类器官成像。迄今为止，我们已将该方法应用于来源于健康人组织的气道、结肠、肾脏和肝脏类器官，以及人乳腺肿瘤类器官和小鼠乳腺类器官。我们使用一种光学透明剂FUnGI，可实现完整三维类器官的成像，并支持对标志物进行单细胞水平的定量分析。该方案从类器官收获到图像分析共需三天，已针对共聚焦显微镜的三维成像进行了优化。

关键词：荧光显微镜，类器官，三维成像，免疫荧光标记，光学透明，FUnGI，共聚焦显微镜，单细胞定量分析

对类器官进行三维成像能够详细地可视化其结构、细胞组成以及细胞内过程。本研究所介绍的技术操作简便，且可能适用于来源于不同器官或宿主物种的多种类器官体系。
与二维成像相比，三维成像的优势可通过小鼠乳腺类器官的图像加以说明，这些类器官是利用近期发表的方法生成的14。这些类器官的中央层由柱状K8/K18阳性腔面细胞构成，外层则包含细长的K5阳性基底细胞（图2A），再现了乳腺在体内的形态结构。而通过同一类器官的二维光学切片则难以清晰识别这种极性结构（图2B，中间图）。另一个若无三维信息便无法解读的复杂结构实例，是人肝类器官中MRP2阳性胆小管所形成的网络，该网络有助于胆汁的收集11（图2B）。这说明了我们的方法能够可视化类器官的关键结构特征。此外，所获得的图像质量和分辨率支持半自动化的图像分割与分析。因此，可在整个类器官中对特定细胞亚群的总细胞数量及标志物表达情况进行定量分析。我们通过分割一个包含140个细胞的完整类器官的细胞核对此进行演示，其中3个细胞对Ki67细胞周期标志物呈强阳性（图2C）。以DAPI通道作为源通道，通过设定强度阈值和10 µm的球体直径生成分割区域。相邻的区域通过从种子点进行区域生长实现分离。最后应用10个体素的大小滤波器，以去除由噪声引起的小片段。对于代表每个细胞核的分割区域，导出其Ki67通道的平均强度用于作图。
我们近期开发了光学透明剂FUnGI35，现将其整合到本方案中，以优化类器官的透明度。FUnGI使用简便，仅需在免疫荧光染色后进行一次孵育即可完成透明处理。该试剂的另一优势在于其黏度，有助于载玻片封片过程中样本的操作。在FUnGI中的荧光样本即使在-20 °C下保存数月，仍能保持其荧光信号。我们证明，与未透明处理及使用果糖-甘油处理的样本相比，FUnGI在类器官深层组织中的荧光信号质量更优（图3A,B），且经FUnGI透明处理的类器官整体荧光强度显著高于未透明处理的类器官（图3C）。
综上所述，我们介绍了一种简便且可重复的三维成像技术，用于获取免疫标记类器官的体积数据。该方案可直接用于成像多种类器官，包括来自健康和疾病模型的小鼠和人类类器官。这种简单的样品制备方法可适用于共聚焦显微镜、多光子显微镜和光片荧光显微镜，以实现对整个类器官从细胞水平到亚细胞水平的成像分辨率。
<img alt="类器官成像工作流程示意图；使用F-actin/E-cad/Ki67免疫标记的共聚焦显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：高分辨率3D成像方案的示意图概述。 从3D基质中回收类器官。在使用抗体和染料进行免疫标记之前，进行固定和封闭。使用FUnGI透明剂一步完成光学透明化处理。可通过成像软件进行图像的3D重建。（A）该流程的示意图概述。（B）经透明化处理的整体人结肠类器官3D共聚焦图像，经F-actin和E-钙黏蛋白（E-cad）免疫标记（25倍油镜）。比例尺 = 40 μm。（C）经透明化处理的整体3D共聚焦图像。比例尺 = 20 μm。（D）经F-actin、E-钙黏蛋白（E-cad）和Ki67免疫标记的人结肠类器官的放大光学切片图像（25倍油镜）。比例尺 = 5 μm。本图经Dekkers等26修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="三维细胞成像；F-肌动蛋白表达；荧光显微镜图示；细胞核分割；Ki67定量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：体积成像可视化复杂的三维结构。 共聚焦图像显示整体三维数据集（左图）、二维光学切片（中图）以及放大区域的三维视图（右图）。（A）源自小鼠乳腺基底细胞的类器官，展示围绕腔面细胞伸长的乳腺基底细胞的三维结构，标记物为K8/18、K5和F-肌动蛋白（果糖-甘油透明化处理；25倍油镜）。比例尺分别为55 μm（左图）和40 μm（中图和右图）。（B）人胎儿肝脏类器官，具有复杂的MRP2阳性毛细胆管三维网络，标记物为DAPI、MRP2和F-肌动蛋白（果糖-甘油透明化处理；40倍油镜）。比例尺分别为25 μm（左图）和8 μm（中图和右图）。（C）人胎儿肝脏类器官的共聚焦三维整体成像，标记物为DAPI和Ki67（左图），以及使用成像软件对DAPI通道进行分割后的图像（中图）。比例尺 = 15 μm。右图为整个类器官所有细胞（DAPI分割）中Ki67平均强度的统计图（共140个细胞）。本图改编自Dekkers等26。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织中F-Actin/DAPI的三维显微成像：透明化方法的影响、强度图与分析图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：使用FUnGI对类器官进行光学透明化处理。 (A代表性的人类结肠类器官图像，经F-actin（绿色）和DAPI（灰色）标记，分别在未透明化、经果糖-甘油透明化或经FUnGI透明化处理后成像（25倍油镜）。左图：类器官的三维重建图像；右图：类器官的光学切片图 150 μm 深度。对于“不透明化”条件，为了观察类器官，需相较于“果糖-甘油”和“FUnGI”条件增加图像亮度。比例尺 = 50 μm. (B非线性回归拟合显示不同光学透明化方法下DAPI荧光强度随Z轴深度增加而降低的趋势。数值代表通过DAPI分割检测到的单个细胞的荧光强度，并归一化至第一层的平均DAPI荧光强度 50 μm 类器官的。为避免因较亮的细胞导致对深层边缘和出芽结构处衰减程度的低估，仅分析了类器官的中心区域。C每种条件下选取三个大小相似且与盖玻片深度相近的类器官，使用相同的显微镜设置进行成像。基于DAPI信号对完整的三维数据集进行单细胞分割以用于比较。柱状图显示了不同透明化方法在完整分割数据集上的平均DAPI强度。数据以均值±标准差表示。数值为DAPI荧光强度值 &gt;通过DAPI分割检测到3800个单个细胞。**** = p &lt; 0.0001，采用双侧Dunn多重比较检验的Kruskal-Wallis检验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

利用此处所述的单细胞分辨率三维成像方案，可完整捕获类器官的整个三维结构、细胞组成及其与原始组织的表型相似性。该方案适用于来源、大小和形状各异的多种类器官。

类器官技术，即微型组织的体外三维培养，为研究调控器官发育的细胞过程开辟了新的实验窗口……

本方案可用于可视化类器官的结构复杂性，从而在单细胞分辨率下对这些三维结构中的细胞身份、硫酸化修饰及分布情况进行定位分析。我们这一快速三日方案已针对多种来源的类器官进行了全面优化，采用简便的样品制备流程，包括无毒的光学透明化步骤和基于硅胶的封片方法。尽管本方案操作简便，但某些步骤（如有序的操作流程或载玻片制备）尤为关键，通过可视化演示比单纯文字描述更易于理解。为了回收在24孔板的基底膜提取物中培养的直径为100至500微米的类器官，用PBS洗涤每个待收获的孔，注意不要破坏三维基质结构，并将培养板置于冰上。向每孔加入1毫升预冷的回收溶液，将培养板置于4°C的水平摇床上孵育30至60分钟。将1毫升移液枪头浸入含1% BSA的PBS溶液中，上下吹打两次，使枪头表面均匀包被BSA。接下来，每种条件各取一个15毫升离心管，每管加入5毫升1% PBS BSA溶液，轻轻倒置管体2至3次，使管内壁充分包被，然后弃去溶液。为收集类器官，使用经过包被的枪头轻柔地将孔内物质吹打重悬5至10次，并将每种条件下的所有类器官转移至同一个经过包被的15毫升离心管中。用1毫升预冷的1% PBS BSA溶液冲洗每个孔，以确保所有类器官均被收集，随后将冲洗液转移至相应的离心管中。用预冷的 PBS 将每管中的终体积补至 10 毫升，并通过离心沉淀类器官，以获得紧密的沉淀物，且无可见的三维基质层。固定类器官时，使用带涂层的 1 毫升移液枪头，将每个沉淀物小心地重悬于 1 毫升冰上预冷的多聚甲醛中，在 4 摄氏度下固定 45 分钟。在固定时间过半时，轻柔地重悬类器官一次。孵育45分钟后，向每根试管中加入10毫升预冷的含吐温20的磷酸盐缓冲液，轻轻颠倒混匀，随后将试管置于4°C环境中静置10分钟。为阻断类器官，在孵育结束时离心样品，并将沉淀物重悬于每孔至少200微升的预冷类器官洗涤缓冲液中，用于后续铺板。然后将类器官转移至24孔悬浮培养板的各个孔中，在4°C条件下孵育15分钟。进行免疫标记时，向一个空的参照孔中加入 200 微升类器官洗涤缓冲液，使类器官沉降至孔板底部。待类器官完全沉降后，将孔板倾斜约 45 度角，除去上清液，仅保留最后的 200 微升洗涤缓冲液。随后，加入含有目标一抗的 200 微升类器官洗涤缓冲液，将孔板置于 4 摄氏度环境中，以每分钟 40 转的轻微摇动速度孵育过夜。第二天早晨，向每个孔中加入1毫升类器官洗涤缓冲液，静置3分钟，使类器官沉降至孔板底部。待类器官完全沉降后，吸除各孔中除最后200微升以外的全部液体，随后用1毫升新鲜类器官洗涤缓冲液进行三次洗涤，每次洗涤持续两小时，并在每次洗涤过程中轻轻摇动和震荡。第三次洗涤结束后，再次静置3分钟，使类器官沉降至孔板底部，然后吸除各孔中除最后200微升以外的全部类器官洗涤缓冲液。每孔加入 200 微升含有适当二抗的类器官洗涤缓冲液，在 4 摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。次日早晨，如所示，用新鲜的类器官洗涤缓冲液每孔 1 毫升进行三次洗涤，每次洗涤 2 小时。最后一次洗涤后，将类器官转移至每孔一个 1.5 毫升离心管中，并通过离心收集类器官。为了对类器官进行光学透明化处理，尽可能吸除每根试管中的洗涤缓冲液，注意不要破坏类器官，然后使用经改造的200微升移液枪头向每个沉淀中加入至少50微升的FUnGI。在室温孵育20分钟后，类器官可在4摄氏度下保存长达一周，或在零下20摄氏度下保存长达六个月。为了制备用于共聚焦显微镜成像的类器官载玻片，用硅酮密封剂填充一支10毫升注射器，并将一个经改造的200微升移液枪头连接到注射器上。使用注射器在载玻片中央绘制一个 1 厘米 × 2 厘米的矩形区域，然后用第二个经过改造的 200 微升移液枪头将透明化的类器官放置在矩形区域中央。将盖玻片覆盖在类器官上时，先将盖玻片左侧边缘放下，再从左至右缓慢降低盖玻片，直至无气泡残留。随后轻轻按压盖玻片的所有边缘，使其牢固地粘附在硅胶密封剂上。为了对类器官进行成像，将载玻片放置在共聚焦激光扫描显微镜的载物台上，并选择25倍多介质浸润物镜用于共聚焦成像。将显微镜设置为适当的采集参数，选择较低的激光功率以减少光漂白。使用Z轴层扫模式定义上下边界，并将Z轴步进大小设置为最佳值。在对大型类器官结构或多个类器官同时成像时，使用拼接模式并设置10%的重叠区域，同时标明感兴趣的区域。当所有参数设置完成后，在成像软件中获取成像结果的3D渲染图像，并优化亮度、对比度及3D渲染属性。随后将结果的RGB图像快照导出为TIFF文件。与二维成像相比，三维成像的优势可通过这些小鼠乳腺类器官的图像得以展示，这些类器官的制备方法如前所述。这些代表性类器官的中心层由柱状的K8/K18阳性腔面细胞构成，外层则包含细长的K5阳性基底细胞，重现了体内乳腺组织的形态结构。这种极性排列方式在相同类器官的二维光学切片中难以清晰辨识。另一个若无三维信息便无法解读的复杂结构实例，是介导人肝类器官胆汁收集的 MRP2 阳性胆小管网络。此外，所获得的图像质量和分辨率可支持半自动化的分割与图像分析，从而能够在整个类器官中对特定细胞亚群的总细胞数量及标志物表达进行定量分析。通过对包含140个细胞的整个类器官中的细胞核进行分割，可以鉴定出三个对Ki67细胞周期标志物呈高阳性的细胞。光学透明剂FUnGI在类器官深层的荧光信号质量方面优于未透明处理以及经果糖-甘油透明处理的样本。与未透明处理的类器官相比，经FUnGI透明处理的类器官表现出整体增强的荧光强度。请注意，样品中残留的任何BME都可能导致抗体渗透性降低，并引起较高的背景信号。此外，若囊性类器官发生塌陷，则不应进行光学透明化处理。对本方案稍作调整后，样品可用于超分辨率共聚焦显微镜、多光子显微镜以及光片显微镜观察。

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生物学

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