Name: 使用亲脂荧光染料的果蝇胚胎运动神经元的逆行追踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学习使用亲脂荧光染料对果蝇胚胎运动神经元进行逆行追踪的技术。该方法利用显微注射将染料导入轴突末梢，实现神经元形态发生和连接性的高分辨率可视化，为神经发育生物学研究提供可靠工具。

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感谢神山实验室成员对本文稿的评论。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 NS107558 项目资助（资助对象：M.I.、K.B. 和 D.K.）。

1. 仪器与耗材
<ol>
	<li>收集胚胎和训练成虫产卵的材料
	<ol>
		<li>通过截断一个50 mL离心管，并在管盖上切开一个孔，将孔径为100 µm的筛网滤器（材料表）置于管体与管盖之间，制备过滤装置。 
		注意：也可使用孔径为100 µm的细胞筛（材料表）进行胚胎收集时的过滤步骤。</li>
		<li>根据说明书使用葡萄糖琼脂预混粉（材料表）制备琼脂平板。简要步骤如下：将1包粉末轻轻搅拌加入500 mL室温（RT，23 °C）去离子水（dH2O）中，微波加热至剧烈沸腾。冷却至70−75 °C后，将混合物倒入培养皿（60 mm）。琼脂凝固后，于4 °C保存备用。</li>
		<li>将活性干酵母（材料表）与水混合成糊状，制备酵母糊，并于4 °C保存。</li>
		<li>使用适用于60 mm培养皿的产卵笼（材料表），以保证充足的空气流通。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖针和染料注射微毛细管的制备
	<ol>
		<li>使用内径0.6 mm、外径1.2 mm的同一类型毛细管（材料表）制备染料注射微毛细管和解剖针。用微毛细管拉制仪（材料表）在最大输出电压170 V下以7%的拉力拉制毛细管，形成尖端长度约0.4 cm的锐利针头。</li>
		<li>对于染料注射，使用微毛细管斜面仪（材料表）按照仪器手册中所述的气泡斜面技术对微毛细管进行修整。
		<ol>
			<li>简要步骤：用润湿剂（材料表）浸湿磨具，防止水“拖拽”针尖。将针头固定在微毛细管夹具上，角度为25−30°，并将针尖置于斜面表面距中心约三分之二半径处。在用连接管路的注射器向针内持续通入空气的同时进行研磨，以确保微毛细管内部无玻璃碎屑堵塞。</li>
			<li>使用细头永久性记号笔在微毛细管上标记斜面处理后尖端开口的位置，因为该开口以一定角度形成，难以直接观察其狭窄的开口位置。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胚胎收集的准备工作
<ol>
	<li>为了获得理想的卵收集效果，需确保成年果蝇（20−40只野生型Canton-S或white果蝇，雌雄均有）处于年轻（&#60;7天）且健康的状态。 
	注意：为了促进产卵，应在卵收集前数天将果蝇置于卵收集笼中进行训练，每天至少在涂有酵母糊的琼脂平板上放置一次。</li>
</ol>
3. 胚胎分期
<ol>
	<li>让果蝇在室温下产卵过夜（或至少15小时），以收集15小时龄胚胎（AEL），即16期18，用于观察aCC和RP3运动神经元的树突发育。早晨时，收集带有卵的培养皿。 
	注意：15小时龄的胚胎将具有明显的四腔肠道18。如需观察不同发育阶段，请依据其特定的形态学标准和培养条件进行。</li>
	<li>为收集胚胎，使用50%次氯酸钠溶液对培养皿上的卵处理5分钟以去除卵壳。</li>
	<li>一旦卵壳被清除，将培养皿中的内容物倒入过滤装置或细胞筛中，以分离胚胎。使用洗瓶中的水稀释残留于培养皿中的次氯酸钠，并通过倾倒混合液至滤膜上，尽可能多地收集胚胎。</li>
	<li>在滤膜上用清水冲洗胚胎3–4次，或直至次氯酸钠气味完全消失。将滤膜从装置上取下，用水将胚胎冲洗至另一干净培养皿中。倾去盛有胚胎的新培养皿中的水分。</li>
	<li>准备一块载玻片，在其中心覆盖两层乙烯基胶带，形成一个矩形区域。用刀片在胶带上切割出一个矩形凹槽。在凹槽的上端贴一条细的双面胶带，胚胎将被放置于此处，如图1所示。</li>
	<li>使用精细镊子，单独挑选5–10个15小时龄的胚胎，将其背侧朝上放置于双面胶带上。向解剖凹槽中加入昆虫林格氏液19，以防止胚胎干燥（图1）。</li>
</ol>
4. 解剖与染色
<ol>
	<li>在解剖显微镜下（材料表），使用玻璃针从胚胎后端至前端沿其表面中线切开。然后将胚胎从胶带上的卵黄膜中拉出并置于载玻片上（图1 中标出区域）。注意不要损伤胚胎内部组织。</li>
	<li>将上皮组织从中部翻起，并将表皮边缘贴附于载玻片表面（图1，插图）。</li>
	<li>使用连接毛细管、尖端开口约 300 µm 的针头（通过折断解剖针的细尖端制备），吸取或吹入空气以分离并移除背侧纵行气管干及任何残留的肠道组织。</li>
	<li>用含 4% 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下固定胚胎 5 分钟。随后用 PBS 洗涤胚胎 3 次。</li>
	<li>将 1 µL 与 Cy3 染料偶联的抗辣根过氧化物酶抗体（anti-HRP Cy3）（材料表）加入 200 µL PBS 中，孵育胚胎 1 小时进行染色。染色后用 PBS 洗涤 3 次。 
	注意：可根据所选用的脂溶性染料种类调整 anti-HRP 所使用的荧光染料。</li>
</ol>
5. 注射微量移液管的填充
<ol>
	<li>使用前，将亲脂性染料（DiO 或 DiD，5 mg/mL，材料表）在乙醇与植物油按 1:10 混合的溶液中加热至 60 °C。</li>
	<li>准备用于注射移液管的溶于油的染料载玻片。将移液管放入毛细管固定器中（图 2，#1）。使用显微操作器（Table of Materials），调节移液管位置使其位于染料载玻片上方。然后调节载物台，将移液管置于染料上（图 2，#2）。</li>
	<li>使用显微注射仪（Table of Materials）（图 2，#3）填充移液管。通过设定 Pi（注射压力）为 200−500 hPa（百帕），Ti（注射时间）为 0.1−0.5 s，Pc（补偿压力）为 0 hPa，持续 5 分钟，使染料进入移液管（图 2，#4）。</li>
	<li>染料吸入完成后，移除染料载玻片，并将样品放置于显微镜载物台上。随后，在将移液管插入样品前，将 Pc 提高至 20−60 hPa，以防止毛细作用导致 PBS 被污染。</li>
</ol>
6. 神经元染料注射
<ol>
	<li>使用10倍物镜的显微镜（材料表）将胚胎置于视野中央，并使微量移液管与胚胎对齐。 
	注意：染料液滴的大小可通过调节Pi或微量移液管尖端开口的尺寸来控制。液滴直径应为10−20 µm，约等于一条肌肉的宽度。</li>
	<li>将物镜更换为水浸式40倍物镜（材料表），并将镜头浸入PBS中以观察胚胎。
	<ol>
		<li>使用荧光显微镜观察由抗-HRP Cy3标记的神经元形态，并确定注射位点。</li>
		<li>注射过程中使用明场显微镜观察染料液滴。当胚胎处于清晰对焦状态时，调整微量移液管的位置，使其尖端轻柔接触目标轴突（例如aCC、RP3）。</li>
		<li>在aCC或RP3神经肌肉接头处的右侧腹段（A2−A6）半节段，使用DiD或DiO染料进行染料滴注（图3），并依据抗-HRP Cy3标记的神经元定位。通过手控装置（鼠标；图2，5）释放染料，在滴注完成后利用显微操作器移开微量移液管，然后进入下一个注射位点。 
		注意：与其他可通过缝隙连接扩散至邻近细胞的染料（如荧光黄、钙黄绿素）不同，脂溶性染料会结合于细胞膜，不会转移至相邻细胞。然而，由于染料液滴相对较大，该技术也会导致配对肌肉被标记（图3A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染料滴注后，在室温下孵育样品1小时再进行成像。 
	注意：在封片前可在此处暂停实验流程，样品可在4 °C下保存过夜。如有现成的细胞内直流（DC）放大器，也可采用电泳法递送脂溶性染料20。</li>
</ol>
7. 使用共聚焦显微镜进行成像
<ol>
	<li>使用镊子将玻璃载玻片上的双面胶带和乙烯基胶带移除。</li>
	<li>准备盖玻片（22 × 22 mm2，No.1 盖玻片），在四个角上涂抹少量真空脂（材料表），然后小心地将其放置在样品上，避免产生气泡。使用擦拭纸去除多余的 PBS。</li>
	<li>轻压盖玻片，以调节物镜与样品之间的工作距离。用指甲油完全密封盖玻片的边缘。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜在 10 倍和 100 倍放大倍数下进行成像。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件处理显微镜获取的原始图像（材料表）。 
	注意：为获得最佳图像，必须在封片后 10 分钟内开始观察。否则，在室温下，染料会扩散至注射部位邻近区域，导致成像背景干扰。为减缓染料扩散，样品可在 4 °C 下保存数小时。</li>
</ol>

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<li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+a+motor+system%3A+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41(2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与基因细胞标记技术相比，使用染料标记研究神经元形态具有多项优势。染料标记技术可最大限度地缩短标记和成像运动神经元形态所需的时间。该染料标记过程非常快速，耗时不到2小时，即可清晰界定神经元投射的轮廓。作为替代方法，可选择在aCC中表达酵母GAL4转录因子的GAL4品系，并将其与受上游激活序列（UAS）调控的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因品系进行杂交，从而实现aCC运动神经元的可视化21。此类GFP标记技术需要进行遗传杂交，因此需额外耗费数天时间。
染料标记的另一个优势是能够以极高的密度对质膜进行标记。脂溶性染料可以在膜的每一部分达到足够高的密度，从而使我们能够分辨出标记结构的精细细节。相比之下，GFP分子的密度通常取决于UAS-GAL4系统启动后的等待时间。例如，aCC从孵化后10小时开始表达GFP，而在孵化后15小时我们观察时，GFP分子的密度仍不足以覆盖整个细胞膜，导致神经元精细突起的标记不充分（D.K.，未发表数据）。
尽管该技术具有多项优势，但在运动轴突投射出现明显错误的情...

Drosophila 的胚胎运动神经元系统为研究中枢神经系统（CNS）发育机制提供了一个强大的实验模型1,2,3。该运动神经元系统适用于生化、遗传、成像和电生理学技术，利用这些技术可在单个运动神经元水平上进行遗传操作和功能分析2,4,5,6。
在神经系统早期发育过程中，神经母细胞通过分裂产生大量胶质细胞和神经元。此前已对神经母细胞的去层化过程与其基因表达谱之间的时空关系进行了深入研究7,8,9。以运动神经元系统为例，胚胎期神经肌肉接头（NMJ）的形成已利用aCC（anterior corner cell）、RP2（raw prawn 2）和RP5运动神经元进行了广泛研究2,10。例如，当RP5运动神经元形成新生突触连接时，突触前和突触后的丝状伪足会相互交错11,12,13。这种直接的细胞间通讯对于启动NMJ的形成至关重要。然而，与我们对周围神经分支的了解相反，关于运动神经元树突如何在中枢神经系统（CNS）内启动突触连接的知识仍十分有限。
本报告中，我们介绍了一种通过微毛细管递送脂溶性染料对胚胎中的运动神经元进行逆行标记的技术。该技术使我们能够追踪产卵后15小时（AEL）每个半体节中支配30块体壁肌肉的38个运动神经元14。利用该技术，我们的研究团队已系统研究了多种功能获得性/功能缺失性等位基因15,16,17。我们近期揭示了驱动运动神经元树突连接起始的分子机制，并证明Dscam1-Dock-Pak相互作用决定了aCC运动神经元树突发育的位点17。总体而言，该技术适用于对野生型或突变型品系中任何胚胎期运动神经元进行表型分析，有助于深入理解黑腹果蝇（Drosophila）神经系统的功能结构设计。

<table><tbody><tr><td>10倍物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan</td></tr><tr><td>40倍水浸物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>NIR Apo</td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>Frederick Haer&amp;Co</td><td>27-31-1</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td>Dragonfly Spinning disk 共聚焦成像系统</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Corning</td><td></td><td>22x22 mm 方形 #1</td></tr><tr><td>DiD</td><td>ThermoFisher</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>ThermoFisher</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>ThermoFisher</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>SMZ-U</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>道康宁高真空润滑脂</td><td>Fisher Sci.</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>果蝇产卵笼</td><td>FlyStuff</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 5247</td><td>Eppendorf</td><td>已停产</td><td>FemtoJet 4i (货号 5252000021)</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>图像处理软件</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>微电极斜面抛光仪</td><td>Sutter</td><td>BV-10-B</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>果蝇营养培养基（葡萄糖琼脂预混粉）</td><td>FlyStuff</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>尼龙网滤膜</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛溶液，电镜级</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>任何电镜级产品均可</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td>可在 sigmaaldrich 购买，盒装 10x 溶液</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>146 4510</td><td>润湿剂</td></tr><tr><td>正置荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Eclipse Ci 配备 LED 光源</td></tr><tr><td>乙烯基电工胶带</td><td>Scotch</td><td>6143</td><td></td></tr><tr><td>VWR 细胞筛</td><td>VWR</td><td>10199-659</td><td></td></tr><tr><td>酵母粉</td><td>FlyStuff</td><td>62-103</td><td>活性干酵母（RED STAR）</td></tr></tbody></table>

逆行示踪 果蝇 使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

我们介绍一种逆行标记运动神经元的技术 果蝇我们使用溶解于油中的脂溶性染料，通过显微注射器将微小液滴递送至胚胎肌片标本。凡接触该液滴的运动神经元膜均可被快速标记。单个运动神经元可实现持续标记，从而清晰显示其精细结构。由于脂溶性染料具有多种颜色，该技术还可实现相邻神经元的多色标记。因此，该示踪技术适用于研究运动神经系统中的神经元形态发生及突触连接性 黑腹果蝇.

aCC和RP3运动神经元的代表性图像如图所示 图3C 用于展示15小时AEL时运动神经元的多色标记。胚胎间的树突形态基本一致。抗HRP抗体的染色模式以灰色显示。分别在肌肉1或肌肉6/7的神经肌肉接头处沉积少量DiO或DiD染料。 图4 展示了定量测量目标表型的能力。我们统计了野生型与突变型（例如， dscam1-/-).
<img alt="胚胎解剖装置；乙烯基胶带；双面胶带；已解剖胚胎；玻璃载片；实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60716/60716fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：解剖槽的装置示意图。 玻璃载片上所见的蓝色区域由乙烯基胶...

我们描述了一种逆行示踪的方法 果蝇 使用脂溶性荧光染料标记胚胎运动神经元。

我们介绍一种用于逆行标记果蝇中运动神经元的技术。我们使用溶解于油中的脂溶性染料，并将少量液滴递送至……

本方案中描述的示踪技术有助于我们研究神经元的形态发生，并捕捉果蝇运动神经元系统的连接性。脂溶性染料能够以极高的密度迅速扩散至细胞膜的各个部分，这正是本方案能够高效解析标记神经元结构的原因。如果轴突末梢可通过注射微移液管触及，则该技术可应用于果蝇幼虫和成虫阶段的任何神经元，或其他生物体中的神经元。如果您没有解剖或使用显微注射仪的经验，对样本进行精确操作可能会具有挑战性。了解胚胎的解剖结构将有助于指导正确使用工具，以完成解剖或显微注射操作。首先，准备好所有用于收集胚胎的材料并摆放整齐。通过截断一个50毫升离心管，并在管盖上切开一个孔，制备过滤装置。然后将孔径为100微米的网筛滤膜置于离心管和管盖之间。使用内径为1.2毫米的同一根毛细管制备染料注射微针和解剖针。用微电极拉制仪在最大输出电压170伏的7%条件下拉制毛细管，以制备尖端长度约0.4厘米的锐利针头。制备染料注射微针时，先将磨针器用润湿剂浸泡，然后将针头以25至30度的角度固定在微电极夹持器上。然后将尖端放至从磨削面中心向外三分之二半径处的位置。在研磨针头的同时，使用带管路的注射器向其内推动空气。使用细头永久性记号笔在微电极上标记，以指示研磨后尖端开口的位置，因为以一定角度形成的狭窄开口较难定位。让果蝇在室温下过夜产卵，并于次日早晨收集带有卵的管道。为收集胚胎，将培养皿中的卵用50%次氯酸钠溶液脱氯处理五分钟。待卵壳表面的氯离子清除后，将培养皿中的内容物倒入过滤装置或细胞筛中，以分离出胚胎。使用装有水的洗瓶稀释残留于培养皿上的次氯酸钠，并通过倾倒混合液将尽可能多的胚胎收集至滤膜上。用水清洗胚胎三到四次，直至次氯酸钠的气味消失。从装置上取下滤膜，用水将胚胎冲洗至另一干净的培养皿中。然后将胚胎所在新培养皿中的水倒出。用精细镊子挑选产卵后15小时的5至10个胚胎，将其背侧朝上放置于双面胶带上。向解剖液池中加入昆虫林格氏液，以防止胚胎干燥。在解剖显微镜下，使用玻璃针将胚胎从胶带上的中层膜中拖出至载玻片表面，注意避免损伤胚胎内部组织。随后，沿单个胚胎表面的中线，从后端至前端将其切开。将上皮组织从中部翻起，并将表皮边缘贴附于载玻片表面。使用带有约300微米开口的连接针头的移液管，通过吸取或吹气去除背侧纵行气管干及任何残留的肠道组织。在旋转摇床上，用4%多聚甲醛（PFA）和磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下固定胚胎5分钟，然后用PBS洗涤3次。将一微升与Cy3染料偶联的抗辣根过氧化物酶抗体和200微升PBS加入胚胎中，在摇床上孵育一小时。随后用PBS重复洗涤。为填充注射用微量移液管，请将其放入毛细管支架中。接下来将染料载玻片放置在载物台上，并使用显微操作器将其定位在载玻片上方。然后调节载物台，使微移液管对准染料。通过设定注射压力为200至500百帕、注射时间为0.1至0.5秒、补偿压力为零，持续五分钟，使微移液管吸取染料。收集染料后，移除染料载玻片，将样品置于显微镜载物台上。随后将补偿压力增加至30至60百帕的范围，并将微量移液管插入样品中。使用10倍物镜定位胚胎，并将微量移液管与胚胎对齐。将物镜更换为40倍水浸物镜，并将物镜浸入PBS中。使用荧光显微镜观察由抗-HRP Cy3标记的神经元形态，并确定注射位点。当胚胎处于焦点时，调整微移液管的位置，使其轻轻接触目标轴突的末端。然后在注射过程中使用明场显微镜观察染料液滴。将DiD或DiO染料滴加至aCC或RP3神经肌肉接头所在的右侧腹部半节段处。使用手动控制器释放染料并移出微量移液器，然后转移到下一个注射位点。成像前将样品置于摇床中，在室温下孵育一小时。使用精细镊子从载玻片上取下胶带。为固定样品，准备一个盖玻片，并在四角涂少量真空脂。小心地将其放置在样品上，注意避免产生气泡。将盖玻片轻轻下压，以调节样本与盖玻片之间的空间，确保物镜与载玻片之间留有足够的工作距离。用纸巾吸除多余的PBS。用指甲油将盖玻片边缘完全密封。使用共聚焦显微镜以10倍和100倍放大倍数成像，并利用ImageJ软件处理图像。本实验方案用于逆行标记支配肌肉1的aCC运动神经元以及支配肌肉6和7的RP3运动神经元。aCC和RP3运动神经元的树突分支显示出广泛的重叠。这两种神经元均为双极性，形成两组不同的树突群体。为了展示该方法的定量能力，对野生型和 Dscam1 突变体中的树突末端总数进行了统计。野生型中显示了 aCC 神经元的同侧树突，但在 Dscam1 突变体中观察到的同侧树突极少。进行此操作时，需注意染料液滴的大小至关重要，约为10至20微米。应先在双面胶带上测试液滴大小，然后将其应用于注射位点。通过此方法，可利用DiD探针的光可切换特性，获得细胞质膜的超分辨率图像。通过这种方法，我们可以研究神经肌肉接头处突触膜的超微结构特征。我们进行了点击化学反应。我们对突变品系中aCC树突进行了表型分析，发现Dscam1-Dock-Pak信号通路决定了aCC树突生长的起始位点。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用亲脂荧光染料的果蝇胚胎运动神经元的逆行追踪

我们利用共聚焦显微镜结合荧光染料，在一种新型的活体果蝇幼虫“内向外”组织制备中，描述了胶质细胞-神经肌肉突触的结构特征。我们使用标记荧光的抗辣根过氧化物酶（HRP）一抗对活神经元末梢进行标记，同时利用荧光葡聚糖对突触周围间隙进行可视化观察。...

实时成像 黑腹果蝇 荧光染料标记的胶质细胞-神经肌肉接头

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。...

电生理记录在 果蝇 胚胎

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在体 突触小泡的可视化 果蝇 幼虫节段性轴突

本视频演示了一种利用荧光染料研究表达光敏通道蛋白的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头处突触小泡循环的实验方案。蓝光激活光敏通道蛋白，引发钙离子内流及突触小泡的胞吐作用。荧光染料嵌入神经元膜中，并在内吞过程中被摄入，导致荧光增强。随后的蓝光刺激诱导胞吐作用并释放染料，表现为荧光信号减弱。...

分析突触小泡循环与荧光染料摄取 黑腹果蝇 幼虫

来源：Inal, M. A. 等人， 逆行示踪 果蝇 使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元。 视频实验杂志...

使用荧光脂溶性染料对 Drosophila 运动神经元进行逆行标记

来源： 关 W. 等. 可视化 果蝇 成年果蝇角质层中的腿部运动神经元轴突 视频实验杂志. (2018)...

成年个体中荧光标记运动神经元的成像 果蝇 腿

本研究详细介绍了一种标准的免疫组织化学方法，用于观察晚期16阶段黑腹果蝇（Drosophila...

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体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

本文介绍一种通过固定、封片、成像及成像后处理等步骤，在成年黑腹果蝇（Drosophila）腿部中利用荧光蛋白可视化轴突投射的实验方案。...

可视化 果蝇 成年果蝇角质层中的腿部运动神经元轴突

在早期 果蝇 胚胎中许多细胞器具有运动性。原则上，可对它们进行活体成像 通过 特异性荧光探针，但卵壳阻碍了其对胚胎的直接应用。本方案描述了如何将此类探针引入胚胎 通过 显微注射，然后分析细胞器的大规模运动 通过...

可视化细胞骨架依赖性脂质囊泡在 Drosophila 胚胎中的运输

本文介绍了利用eGFP荧光在黑腹果蝇（Drosophila）复眼中对光感受器膜蛋白进行定位以及评估视网膜变性的非侵入性方法。...

使用 eGFP 标记蛋白在 Drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

学习使用亲脂荧光染料对果蝇胚胎运动神经元进行逆行追踪的技术。该方法利用显微注射将染料导入轴突末梢，实现神经元形态发生和连接性的高分辨率可视化，为神经发育生物学研究提供可靠工具。

逆行示踪果蝇使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元

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