逆行示踪 果蝇 使用亲脂性荧光染料标记胚胎运动神经元

本方案中描述的示踪技术有助于我们研究神经元的形态发生，并捕捉果蝇运动神经元系统的连接性。脂溶性染料能够以极高的密度迅速扩散至细胞膜的各个部分，这正是本方案能够高效解析标记神经元结构的原因。

如果轴突末梢可通过注射微移液管触及，则该技术可应用于果蝇幼虫和成虫阶段的任何神经元，或其他生物体中的神经元。如果您没有解剖或使用显微注射仪的经验，对样本进行精确操作可能会具有挑战性。了解胚胎的解剖结构将有助于指导正确使用工具，以完成解剖或显微注射操作。

首先，准备好所有用于收集胚胎的材料并摆放整齐。通过截断一个50毫升离心管，并在管盖上切开一个孔，制备过滤装置。然后将孔径为100微米的网筛滤膜置于离心管和管盖之间。

使用内径为1.2毫米的同一根毛细管制备染料注射微针和解剖针。用微电极拉制仪在最大输出电压170伏的7%条件下拉制毛细管，以制备尖端长度约0.4厘米的锐利针头。制备染料注射微针时，先将磨针器用润湿剂浸泡，然后将针头以25至30度的角度固定在微电极夹持器上。

然后将尖端放至从磨削面中心向外三分之二半径处的位置。在研磨针头的同时，使用带管路的注射器向其内推动空气。使用细头永久性记号笔在微电极上标记，以指示研磨后尖端开口的位置，因为以一定角度形成的狭窄开口较难定位。

让果蝇在室温下过夜产卵，并于次日早晨收集带有卵的管道。为收集胚胎，将培养皿中的卵用50%次氯酸钠溶液脱氯处理五分钟。待卵壳表面的氯离子清除后，将培养皿中的内容物倒入过滤装置或细胞筛中，以分离出胚胎。

使用装有水的洗瓶稀释残留于培养皿上的次氯酸钠，并通过倾倒混合液将尽可能多的胚胎收集至滤膜上。用水清洗胚胎三到四次，直至次氯酸钠的气味消失。从装置上取下滤膜，用水将胚胎冲洗至另一干净的培养皿中。

然后将胚胎所在新培养皿中的水倒出。用精细镊子挑选产卵后15小时的5至10个胚胎，将其背侧朝上放置于双面胶带上。向解剖液池中加入昆虫林格氏液，以防止胚胎干燥。

在解剖显微镜下，使用玻璃针将胚胎从胶带上的中层膜中拖出至载玻片表面，注意避免损伤胚胎内部组织。随后，沿单个胚胎表面的中线，从后端至前端将其切开。将上皮组织从中部翻起，并将表皮边缘贴附于载玻片表面。

使用带有约300微米开口的连接针头的移液管，通过吸取或吹气去除背侧纵行气管干及任何残留的肠道组织。在旋转摇床上，用4%多聚甲醛（PFA）和磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下固定胚胎5分钟，然后用PBS洗涤3次。

将一微升与Cy3染料偶联的抗辣根过氧化物酶抗体和200微升PBS加入胚胎中，在摇床上孵育一小时。随后用PBS重复洗涤。为填充注射用微量移液管，请将其放入毛细管支架中。

接下来将染料载玻片放置在载物台上，并使用显微操作器将其定位在载玻片上方。然后调节载物台，使微移液管对准染料。通过设定注射压力为200至500百帕、注射时间为0.1至0.5秒、补偿压力为零，持续五分钟，使微移液管吸取染料。

收集染料后，移除染料载玻片，将样品置于显微镜载物台上。随后将补偿压力增加至30至60百帕的范围，并将微量移液管插入样品中。使用10倍物镜定位胚胎，并将微量移液管与胚胎对齐。

将物镜更换为40倍水浸物镜，并将物镜浸入PBS中。使用荧光显微镜观察由抗-HRP Cy3标记的神经元形态，并确定注射位点。

当胚胎处于焦点时，调整微移液管的位置，使其轻轻接触目标轴突的末端。然后在注射过程中使用明场显微镜观察染料液滴。将DiD或DiO染料滴加至aCC或RP3神经肌肉接头所在的右侧腹部半节段处。

使用手动控制器释放染料并移出微量移液器，然后转移到下一个注射位点。成像前将样品置于摇床中，在室温下孵育一小时。

使用精细镊子从载玻片上取下胶带。为固定样品，准备一个盖玻片，并在四角涂少量真空脂。小心地将其放置在样品上，注意避免产生气泡。

将盖玻片轻轻下压，以调节样本与盖玻片之间的空间，确保物镜与载玻片之间留有足够的工作距离。用纸巾吸除多余的PBS。用指甲油将盖玻片边缘完全密封。

使用共聚焦显微镜以10倍和100倍放大倍数成像，并利用ImageJ软件处理图像。本实验方案用于逆行标记支配肌肉1的aCC运动神经元以及支配肌肉6和7的RP3运动神经元。aCC和RP3运动神经元的树突分支显示出广泛的重叠。

这两种神经元均为双极性，形成两组不同的树突群体。为了展示该方法的定量能力，对野生型和 Dscam1 突变体中的树突末端总数进行了统计。野生型中显示了 aCC 神经元的同侧树突，但在 Dscam1 突变体中观察到的同侧树突极少。

进行此操作时，需注意染料液滴的大小至关重要，约为10至20微米。应先在双面胶带上测试液滴大小，然后将其应用于注射位点。通过此方法，可利用DiD探针的光可切换特性，获得细胞质膜的超分辨率图像。

通过这种方法，我们可以研究神经肌肉接头处突触膜的超微结构特征。我们进行了点击化学反应。我们对突变品系中aCC树突进行了表型分析，发现Dscam1-Dock-Pak信号通路决定了aCC树突生长的起始位点。