澄清与成像 白色念珠菌 生物膜

白色念珠菌生物膜与许多生物样本类似，在天然状态下具有高度半透明至不透明的特性。在本实验方案中，我们展示了通过透明化方法，可利用光学切片显微技术对固定且完整的生物膜内部结构进行成像。通过简单、廉价且相对快速的处理步骤，可使固定完整的生物膜变得透明，从而适用于共聚焦扫描荧光显微镜的三维成像。

今天由本实验室的博士后研究员Katie Lagree和我来演示该实验步骤。要在12孔板中启动生物膜的生长，请按照文本方案所述准备该培养板。将培养板置于湿润、37摄氏度的空气培养箱中的60 RPM轨道摇床上，孵育90分钟，以允许细胞充分黏附。

孵育90分钟后，移除培养基及未贴壁的细胞，并用无菌培养基或PBS洗涤。将接种后的基质转移至另一含有预热的菌丝培养基的多孔板中。将该多孔板放回37摄氏度、湿度饱和的空气中培养箱，于60 RPM转速下进行圆周振荡以提供通气，培养生物膜至多48小时。

从培养箱中取出培养48小时的培养板，移除每个样本的培养基。用PBS替换培养基，并孵育数分钟以稀释去除血清蛋白。移除PBS后，向各孔重新加入固定剂。

应向每个培养皿中加入足量的固定液，以完全浸没所有生物膜生长物，包括培养皿内壁上的生物膜。将盖好的培养皿置于缓慢旋转的摇床上，混合20分钟。按照文本方案所述去除固定液后，通过吸除PBS并迅速用含有PBS和所需染料的溶液重新填充各孔，进行染色前的准备。

不要让生物膜排干或干燥超过几秒钟。将染料加入培养皿中。所需染料的量取决于生物膜的量。

然后将盖好的培养皿置于慢速旋转混合仪上过夜，并用铝箔或一张黑色纸张遮光保护。使用镊子将固定染色后的生物膜从 PBS 转移至 20 毫升玻璃小瓶中的 5 毫升 50/50 PBS-甲醇溶液中，使生物膜面朝上。以手动方式做圆周运动混合，每分钟混合一次，持续 5 分钟。

将溶剂移至废液瓶中，注意避免移液管与生物膜接触，或生物膜与小瓶接触。轻轻加入三毫升纯甲醇，随后以手动方式每隔一分钟进行一次圆周运动混合，持续三分钟。

现在将溶剂移至废液瓶中，并立即重新加入五毫升甲醇。以手动方式每隔一分钟进行圆周振荡混合，持续五到十分钟后，将溶剂移至废液瓶中。立即重新加入三毫升甲醇。

此时，生物膜通常比初始状态显得更不透明。将溶剂移至废液瓶中，并立即用五毫升50/50甲醇-水杨酸甲酯重新填充小瓶。每隔一分钟手动以旋转方式混合，持续五到十分钟。

在该混合溶剂中，生物膜应呈半透明状。将溶剂移除至废液瓶后，轻轻向小瓶中重新加入三毫升纯水杨酸甲酯。以手动方式每隔一分钟进行一次圆周运动混合，持续三分钟。

用 5 毫升纯水杨酸甲酯重复上述步骤，手动混合，每 1 分钟搅拌一次，持续 5 至 10 分钟。此时，生物膜应呈透明状。将溶剂移至废液瓶中，并立即用 3 毫升纯水杨酸甲酯重新填充小瓶。

经处理的生物膜在此溶剂中保持稳定。若使用倒置显微镜，应使用带有盖玻片底部的耐溶剂培养皿，并为倒置样品准备支撑用的间隔片。此处的间隔片为13毫米的硅胶环，预先在水杨酸甲酯中浸泡一小时，以最大限度减少因膨胀引起的焦点漂移。

对于附着在医用级硅胶片上的生物膜，将硅胶片倒置并放置在培养皿中水杨酸甲酯液体内的支架上。确保标本下方无任何气泡。将培养皿牢固地固定在显微镜载物台上，并使物镜与浸油接触。

调整培养皿中水杨酸甲酯的量，使弯月面通过表面张力将样品牢固地压在间隔物上。在倒置的方形基质顶部滴加一滴水杨酸甲酯，以减少哑光表面引起的光散射。然后用玻璃盖板覆盖培养皿，以限制蒸发。

在成像前等待数分钟，使样品沉降到垫片上。现在，按照文本方案中所述进行共聚焦显微镜成像。为处理图像，请打开 ImageJ 或 Fiji。

检查以确保程序已分配足够的内存来处理数据。处理一个两吉字节的数据集至少需要八吉字节的专用内存，以保证操作流畅。打开待处理的连续平面图像文件。

如果计算机的内存不足以处理整个图像栈，可以先处理子栈，然后将子栈重新组合成一个完整的图像栈。使用图像菜单中的“类型”功能，将数据转换为32位格式，以支持浮点运算。此操作将使文件大小增加一倍。

减去平滑背景以增强合焦特征的对比度。通过导航至“处理”菜单中的“减去背景”命令来处理整个图像栈。如有必要，调整滚球半径。

球体半径应显著大于需要保留的在焦特征的最大尺寸。为将所有负像素设置为零，需将每幅图像与其绝对值相加。首先，使用图像菜单中的“复制”功能，复制整个图像栈。

然后使用“处理”菜单中的“数学”功能，取复制数据的绝对值。通过导航至“处理”菜单中的“图像计算器”，选择“相加”以合并两个图像栈。要对图像栈进行轴向重切片，请使用“图像”菜单中的“栈”功能，选择“重切片”。

然后选择输出间距为1.0，从顶部开始并避免插值。此时，焦点轴即为堆栈中的垂直轴。重切片后堆栈的Y维等于焦点平面的数量。

要对部分或全部图像层创建侧视图投影，请导航至图像菜单中的“堆栈”选项，然后选择“Z 投影”。设置起始切片和终止切片，以包含部分或全部侧视图平面。为获得最佳效果，请选择“最大强度”投影模式。

通过进入图像菜单中的“比例”选项，校正侧视图投影的轴向比例。必须使用轴向比例因子对投影进行校正，以补偿图像平面像素不均和焦距增量的差异。将X轴比例设为1，将Y轴比例设为轴向比例因子。

选择双三次插值。选择创建新窗口。调整亮度和对比度。

然后转换为8位格式以供显示。或者，应用颜色查找表并保存为RGB或8位彩色图像。通过使用折射率逐步升高的可混溶溶剂，可快速估计透明度的最佳值。

通过传统的相差显微镜进一步观察，以确定对比度最低的点。一个生物膜在二甲苯和该范围内的一组窄幅参考液体之间依次交替转移。每次交换后，重新定位同一视野，并通过盖玻片进行观察。

随着折射率增加，当细胞壁的 n 值达到 1.530 时首先出现对比度反转，随后当 n 值达到 1.535 时胞质出现对比度反转。此处展示了突变型与野生型白色念珠菌（C.albicans）生物膜的深层成像结果。从 538 平面共聚焦图像堆栈的侧面投影可见，野生型生物膜生长至 502 微米的厚度。

从顶端到基部的轴向投影显示了生物膜中细胞类型和不同层次的分布变化。此例展示了典型的野生型结构。突变体生物膜的厚度达到500微米，如556平面图像堆栈的侧面投影所示。

这种已知在缺乏诱导性应激因子时仍能进行丝状生长的突变体，呈现出截然不同的结构形态。从侧面视图和轴向投影均可观察到，许多分支细胞产生了辐射状的外生突起。这是一种高折射率深度成像方案。

理想情况下，样品的折射率应与浸油的折射率相匹配。因此在本实验中，我们使用油镜物镜。我们的大多数研究均采用细胞壁标记物对生物膜进行结构成像，但任何适用于固定样品的荧光方法均可使用，包括免疫荧光、荧光原位杂交以及报告基因表达。

这种生物体——白色念珠菌——在健康人体内属于共生菌，但也是一种机会性病原体，可引起黏膜或全身性的酵母菌感染。在某些机构中，需要采用生物安全二级（BSL II）的防护措施和操作规程。此外，甲醛和戊二醛固定剂具有挥发性和危害性。

它们是已知的致癌物。在通风橱中配制固定剂的稀释液。盛有稀释固定剂的器皿应保持加盖，且不得将含有此类固定剂的容器放入生物安全柜或细胞培养孵育箱中。