Name: 荧光钙成像及其后续原位杂交，用于异种性前体特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 学习荧光钙成像与原位杂交联合技术，用于单细胞水平关联钙活性与基因表达。该方法可揭示神经发育中钙信号与基因表达的细胞自主关系。

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感谢Wendy Herbst和Lindsay Schleifer在本实验方案开发过程中所做的贡献。本研究工作获得了美国国立卫生研究院基金（1R15NS067566-01、1R15HD077624-01和1R15HD096415-01）对MSS的资助。

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无利益冲突声明。

在构成发育中神经系统的细胞中，已观察到特征性的钙活动模式，特定类型的活动与不同的神经发育过程相关联。然而，要深入理解这些富含信息的活动模式如何转化为转录响应的机制，需要在单细胞分辨率下同时获取钙活动和基因表达的数据。尽管对于钙活动较为刻板的系统（如成熟神经元）可以在群体水平上进行合理检测，但胚胎神经系统所特有的不规则活动模式却容易被精度较低的记录方法所掩盖。
本方案中建立的实验框架可轻松适用于多种细胞类型和荧光报告系统。可从目标模式生物中分离出包含几乎任何单一细胞类型或多种细胞组合的组织，并进行单细胞成像培养。原代细胞培养方法不仅有助于细胞鉴定并分离细胞自主性过程的影响，还允许实验者根据需要确定培养基的组分。例如，已有研究通过比较神经元前体细胞在 2 mM Ca2+ 溶液中的活性，来探究在无细胞间相互作用影响的情况下，是否能够重现胚胎脊髓中动作电位频率与神经递质表型之间的关系13,20。
尽管本实验方案利用荧光标记物Fluo4-AM检测细胞内钙离子活性，但根据选择标准，使用者也可选择其他市售的标记物21，包括基因编码的钙离子指示剂。类似地，也可采用其他标记物来监测目标离子（包括K+、Na+和Zn2+）浓度、膜电位或细胞pH值的动态变化。成像参数和成像时长可根据需要进行调整。
尽管我们将钙活性与神经元表型的相关性作为一个具体应用进行了研究，但该方法也可适用于多种其他细胞特性。例如，可使用针对任何目的基因的探针进行荧光原位杂交（FISH），包括神经元标记物 ChAT 或转录因子 Engrailed，从而实现对可定制的一组 mRNA 分子的高灵敏度检测。这些探针可设计为特异性识别特定剪接异构体，以在需要时提供更高的靶标特异性。通过使用偶联了两种不同荧光染料的探针，可进行双重 FISH 实验，从而同时评估多个基因的表达情况。然而，此类实验所需的额外洗涤步骤会增加细胞丢失或移位的风险，因此需要操作者具备一定的经验与精细的操作技巧。
无论对该方案进行何种实验特异性的修改，都有几个关键步骤需要特别注意。解剖时应小心操作，以彻底清除所有污染组织或细胞群体；由于当外植体被解离后其空间分布模式将丧失，任何残留的邻近组织细胞都会与目标细胞混杂在一起而无法区分。细胞接种后，应尽可能轻柔地处理样品，以防止细胞脱落。最重要的是，所有溶液更换操作都应缓慢而谨慎地进行，移液时将移液器置于培养板边缘以添加或移除溶液。这将确保在钙成像和FISH图像中均能明确识别细胞。若在处理过程中细胞受到扰动，则可能无法在两幅图像之间识别出部分或全部对应的细胞。我们建议在进行细胞匹配时采取保守策略，仅使用那些能够明确对应的细胞进行后续分析。
根据所研究的生物学问题，可采用多种分析方法。时间序列的钙活动可通过多种方式进行处理和量化，实验者可灵活选择去趋势参数、分析指标和分析参数（例如，用于定义钙峰的基线百分比阈值）。通过将基因表达分析为从FISH图像中提取的绝对或相对荧光值，可以建立钙活动与基因表达水平之间的相关性。或者，通过设定阳性基因表达信号的荧光阈值，并为单个细胞分配“有”或“无”的标识，也可分析钙活动与基因表达（存在/缺失）之间的相关性。总体而言，该实验方案提供了一个极为灵活的流程，可用于结合单细胞匹配的基因表达数据进行时间序列数据的采集和初步分析。此类实验对于深入理解细胞动态与转录变化之间的复杂关系至关重要，例如在胚胎期非洲爪蟾（Xenopus laevis）神经前体细胞中鉴定出抑制性命运和兴奋性命运特征性的钙活动模式。

游离胞质钙对多种生物过程至关重要，从细胞增殖和迁移到凋亡和自噬均依赖其调控1,2,3在这些通路中，钙离子可通过与钙结合结构域相互作用，诱导蛋白质构象改变，从而调控蛋白质活性及相互作用，进而对基因表达产生下游效应。例如，一种称为下游调节元件拮抗性调节因子（DREAM）的神经元钙感应蛋白，在与钙离子结合时会维持在未折叠的中间构象状态，从而阻止其与靶蛋白及DNA靶点发生相互作用。4然而，除了作为简单的信号分子外，细胞内钙瞬变的动态特性使得这些活动模式能够编码更复杂的基于幅度或频率的信号5,6转录因子活化T细胞核因子（NFAT）的核转位受钙振荡频率调控：高频钙振荡促进其核转位，而低频钙振荡则抑制该过程7值得注意的是，最近的研究表明，NFAT 可能实际上响应于钙的累积暴露8. 钙调磷酸酶和Ca2+/钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）也对特定频率、持续时间或幅度的钙瞬变表现出不同的响应9为了增加调控的复杂性，计算模型表明，许多下游钙结合蛋白在结合竞争者存在或缺失的情况下，其对频率的依赖性会相应增强或减弱。10,11.
在发育中的神经系统内，已定义出两类主要的钙活动行为，并将其与特定的生物学过程相关联。如果钙内流发生在单个细胞内，钙信号在五秒内达到约基础水平强度的400%，并呈现双指数衰减，则被归类为&#34;尖峰&#34;12。此类信号主要与神经递质表型的确定相关13。相比之下，&#34;钙波&#34;被定义为较慢且幅度较低的钙瞬变，其特征是细胞内钙浓度在30秒或更长时间内上升至约基础水平的200%，随后在数分钟内逐渐衰减12。这类信号常在多个相邻细胞间传播，其存在与神经突起生长及细胞增殖相关14,15。然而，尽管这两类活动是基于其特征性的动力学谱型所定义，但目前尚不明确细胞究竟识别这些模式中的哪些具体特征，并由下游效应分子进行转导。 
理解细胞内钙振荡与基因表达之间的关系，将有助于深入认识确保神经系统适当发育和模式形成的调控机制之一。为此，对胚胎脊髓的研究表明，发育过程中钙峰活动的增加与抑制性神经元水平升高相关，而钙峰活动的减少则与兴奋性神经元水平升高相关13。然而，这些基于群体水平的检测尚未被用于在单细胞水平上将钙活动与基因表达关联起来。
在单细胞水平上研究这些问题，相较于以往的工作具有若干显著优势。首先，能够对大量细胞中的钙活动和基因表达进行单个评估，从而观察到完整的不同活动模式，而不会因群体水平的测量而被掩盖。此外，在单细胞原代培养中研究这些关系，可保持钙活动与基因表达之间的细胞自主性关联，同时消除依赖细胞间通讯的相互作用。因此，该方法可将这些细胞自主性机制独立出来进行研究。然而，该方法也允许阐明和探究非细胞自主性钙活动的作用。例如，可在神经板阶段从胚胎中分离细胞，培养至其同胞对照组达到神经管阶段，然后与从神经管阶段胚胎中 freshly 分离的细胞进行比较。这使得能够直接比较在关键发育时期保留了细胞间通讯的细胞与细胞间通讯被阻断的细胞。
为了克服以往实验方法的局限性，我们开发了一种实验方案，可同时评估单个神经前体细胞中的钙活动与基因表达，从而将特定的活动模式与后续的分化程序相关联。在非洲爪蟾（Xenopus laevis）神经发育的不同阶段分离神经组织，将其解离为单细胞，并在荧光钙指示剂存在下通过共聚焦显微镜进行成像。活细胞成像完成后，样品经固定处理，随后采用荧光原位杂交（FISH）检测目标基因或剪接异构体的表达水平。重要的是，可在两次成像实验之间对同一单个细胞进行追踪，从而将细胞的钙活动特征与其基因表达水平相互关联（图1）。本文所报道的实验方案旨在探究非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎神经发育过程中钙活动模式与基因表达之间的关系。然而，该实验的整体框架（单细胞时间序列成像，随后进行FISH检测及图像共定位）可经适当修改后广泛应用于几乎所有细胞类型、荧光报告分子以及目标基因的研究。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;动物饲养 &amp;与细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHORULON（绒毛膜促性腺激素）</td><td>默克动物保健</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素盐</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 培养皿，100 mm × 20 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3160102</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip 组织培养皿，35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip 组织培养皿，60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 标准组织培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>赛默飞世尔 Nunc 细胞培养/培养皿，35×10 mm 培养皿，Nunclon Delta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 标准一次性移液管，无刻度；长度：5.875 英寸；容量：7.7 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>甲磺酸三卡因</td><td>Millipore Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶B</td><td>Millipore Sigma</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子，Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子，Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Cellattice 微刻线细胞培养表面</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CLS5-25D-050</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于钙成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, 细胞渗透性</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0.2 &amp;micro;m 过滤（水中 10% 溶液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P6866</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于RNA探针制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureYield 质粒小提系统</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>rATP</td><td>Promega</td><td>P1132</td><td></td></tr><tr><td>rCTP</td><td>Promega</td><td>P1142</td><td></td></tr><tr><td>rGTP</td><td>Promega</td><td>P1152</td><td></td></tr><tr><td>rUTP</td><td>Promega</td><td>P1162</td><td></td></tr><tr><td>地高辛-11-UTP</td><td>Millipore Sigma</td><td>3359247910</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA聚合酶</td><td>Promega</td><td>P2083</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶</td><td>Promega</td><td>P1085</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 无RNase的DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>LiCl 沉淀溶液（7.5 M）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9480</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于荧光原位杂交&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>封闭试剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>抗地高辛-POD，Fab片段</td><td>Millipore Sigma</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Cy3单反应性NHS酯</td><td>Millipore Sigma</td><td>GEPA13105</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;溶液组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙，96% 超纯，粉末，无水，ACROS Organixs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC349610</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 水合物</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt's 溶液（50X）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>DTT，分子级（DL-二硫苏糖醇）</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺（去离子）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>猪肠黏膜来源肝素钠盐</td><td>默克生命科学</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（超纯）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Millipore Sigma</td><td>H1109</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁，纯品，ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁，97% 纯度，ACROS Organixs，无水</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC413480050</td><td></td></tr><tr><td>马来酸，99%，ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS125231000</td><td></td></tr><tr><td>MOPS（细白晶体/分子生物学级），Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>默克生命科学</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>酿酒酵母核糖核酸，IX型</td><td>Millipore Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>默克生命科学</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺</td><td>Millipore Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>默克生命科学</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>首选模型</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>首选模型</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>尼康</td><td>TE200</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 成像软件</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>首选模型</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td>首选模型</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 瓶顶式真空过滤系统，0.22 &amp;mu;m孔，500 mL瓶容量</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr></tbody></table>

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

多种细胞类型中均可观察到自发性细胞内钙活动，且据推测其在多种生理过程中发挥关键作用。特别是在脊椎动物神经发育过程中，胚胎发生期钙活动模式的适当调控对于多种神经发育事件至关重要，包括神经管的正常闭合、突触形成以及神经递质表型的确定。尽管钙活动模式在频率和振幅上的差异提示了一种潜在的机制，即这些钙流可能以编码信号的形式传递给下游效应分子并调控基因表达，但现有的群体水平研究方法尚缺乏深入探索这一可能性所需的精确度。此外，这些方法因无法检测在无细胞间接触条件下神经元命运决定的状态，从而限制了对细胞间相互作用作用的研究。因此，我们建立了一种实验流程，将分离的神经组织外植体的钙活动延时成像与荧光原位杂交检测相结合，从而在单细胞水平上实现钙活动模式与分子表型的明确关联。我们已成功利用该方法区分并表征了与分化中的神经细胞及神经前体细胞各自相关的特定钙活动模式；除此之外，本文所述的实验框架亦可便捷地适用于研究任何时间序列活动模式与目的基因或基因群表达之间的相关性。

可用于钙成像的分离细胞制备成功的示例如图2A所示。细胞接种密度较高，可在每张图像中获取尽可能多的信息，但又不至于过于密集而无法明确区分单个细胞。在2小时的成像过程中，每个确定的细胞均检测到荧光信号。可视化显示实验中记录的所有细胞轨迹的复合图，可揭示总体或群体测量可能掩盖更细微的放电行为模式的程度（图2B）。当单独分析单个细胞的记录曲线时，可清晰识别出神经前体细胞特征性的不规则放电活动。与成熟神经元不同，胚胎神经细胞表现出不规则、高度可变且复杂的钙活动特性（图2B）。为了量化这种复杂性，已应用多种数据分析方法17,18，包括采用多种参数来定义一个钙峰（图2C）。
通过将实验组与使用非结合性正义RNA对照的背景对照组进行比较，可以评估荧光原位杂交是否成功，包括反义mRNA探针的设计与合成是否成功（图3A,B）。此外，还可通过处理已知在可检测水平表达目标mRNA的细胞类型，进行阳性探针对照实验。
在钙成像和FISH成像之间识别相同的细胞，要求细胞在探针杂交和处理过程中基本保持相同的位置。如果培养板操作不当或洗涤过程过于剧烈，细胞可能从板表面脱落，在溶液弃去时丢失，或重新沉积在板上的其他位置，从而导致无法在不同图像间匹配同一细胞（图4A）。如果这种干扰仅影响视野中的部分细胞，则仍有可能检测并匹配图像中的部分细胞（图4B）。然而，当FISH操作谨慎进行，且细胞在成像间几乎无丢失或移位时，实验可获得最大量的数据（图4C）。
在收集到足够数量的细胞在特定发育阶段的钙活动和基因表达数据后，可进一步分析这两者特征之间的相关性（图1）。已有多种指标用于量化钙活动模式，包括脉冲计数/频率、平均功率、Hurst指数估计以及马尔可夫熵测量17,18。基因表达可根据具体科学问题，通过绝对荧光强度进行定量，或以二元（有/无）方式分级。
将钙活动与神经前体细胞标志基因表达进行关联的实验结果揭示了特定钙活动模式与神经递质表型之间的多种关联。在神经板阶段（14期），表达抑制性神经元标志基因gad1.1的GABA能细胞表现出比不表达gad1.1的细胞更为规律且振幅更高的钙活动（图5A）。此外，表达gad1.1的细胞更多地与高频高振幅簇状放电相关，而低振幅放电则更频繁地出现在表达兴奋性神经元标志基因slc17a7的谷氨酸能细胞中。
<img alt="神经组织解剖与FISH流程；单细胞Ca²⁺活性；叠加图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：实验流程示意图。 比例尺 = 100 μm。第3-5个图板中的图像引自Paudel等（2019）17。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用光谱数据分析和图表结果进行细胞活性研究的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：钙成像及典型活性曲线示例。（A）Fluo4-AM 报告的细胞内钙离子活性。每幅 2 小时的图像由 901 个帧组成，此处展示其中一个代表性帧。（B）成像视野内所有细胞随时间变化的荧光强度复合图。曲线清晰显示了指示剂染料（Fluo4）随时间推移发生的光漂白现象。左上角的点阵图展示了应用 Eilers 和 Boelen19 开发的去趋势算法后典型的钙活性轨迹，此处显示的细胞表现出多样化的簇发放电行为。（C）应用不同阈值（基线的 150% 和 200%，其中基线为去趋势后荧光强度的平均值）来定义一个尖峰（绿色和蓝色箭头）。比例尺 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较细胞样本A和B的荧光显微镜图像，显示蛋白质表达差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：FISH成像。（A）使用不结合的正义RNA探针进行FISH实验作为阴性对照。成像参数已调整至无细胞呈现荧光信号。某些视野中可能存在非细胞碎片发出微弱荧光，如（A）图右上角和右下角所示；这些信号在背景设定时可忽略不计。（B）采用相同的成像参数对实验组样本（反义RNA探针）进行成像。在此条件下观察到的荧光信号代表高于背景水平的基因表达。比例尺 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静力学平衡示意图，包含绿色圆圈和红色轮廓；视觉实验对比 A-C。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：图像叠加与共定位。 对同一样本进行钙活性成像（细胞以实心绿色圆圈表示）和荧光原位杂交（FISH）后成像（细胞以阴影红色圆圈表示）的示意图。(A) 在样本处理和制备过程中发生显著位移的细胞，无法在两幅图像之间可靠地识别。(B) 细胞破坏可能仅影响视野中的部分细胞；一些细胞在两幅图像中均可明确识别，而另一些则无法可靠匹配。(C) 若样本处理得当，大多数细胞将保持稳定，可在两幅图像中被准确识别。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="马尔可夫熵，脉冲频率箱线图，GABA与谷氨酸，统计比较，神经科学分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图5：本方法应用示例，箱线图显示钙活动与基因表达（基因 GABA 和 Glut）之间的关联 gad1.1 和 slc17a7 分别在神经板期的非洲爪蟾（Xenopus laevis）中。 在14期，gad1.1阳性细胞（GABA）表现出更高振幅且更规律的钙活动，其定义依据为（A马尔可夫熵18 和（B) 使用去趋势荧光强度（基线）平均值的125%、150%、200%和300%作为阈值进行尖峰计数17 比 slc17a7 阳性细胞（Glut）。星号表示根据Bonferroni校正的双样本Kolmogorov–Smirnov检验（p &lt; 0.05）以及效应量的Cohen's d统计（n = 5个培养样本及 &gt;100 个细胞；* 0.2 ≤ |d| &lt; 0.5)。该图根据Paudel等人获得的数据集重新绘制并改编。17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

可在多种细胞类型中观察到自发性细胞内钙活动，该活动被认为在多种生理过程中发挥关键作用……

该方案可用于在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达相关联，使研究人员能够探究这两个特征之间关系的新问题。与以往通常研究整个组织的方法相比，我们的技术聚焦于单细胞水平，从而能够评估钙活动与基因表达之间的细胞自主性关系。首先，使用紫外光对两个35毫米塑料培养皿和一个35毫米细胞培养皿进行消毒，时间约为30分钟。在超净工作台中操作，向两个50毫升塑料锥形管、一个经紫外灭菌的培养皿以及经紫外灭菌的细胞培养皿中各加入10毫升2毫摩尔的氯化钙溶液。向另一个经紫外灭菌的培养皿中加入2毫升无钙无镁溶液，并用添加了庆大霉素的0.1倍浓度MMR溶液填充两个100毫米塑料培养皿和一个35毫米塑料培养皿。然后用70%乙醇填充一个60毫米塑料培养皿。解剖前立即取0.01克胶原酶B，加入一管钙溶液中充分混匀。将该溶液转移至一个新的60毫米塑料培养皿中，使用解剖显微镜鉴定处于所需发育阶段的胚胎。用无菌移液管将至少六个合适的胚胎转移至一个含有MMR加庆大霉素的100毫米培养皿中。然后将一个胚胎从 holding plate 转移至含有庆大霉素的第二个 100 毫米 MMR 培养皿中，并将此解剖培养皿置于显微镜下。使用一对钝头镊子固定胚胎，再用一对精细镊子小心剥离围绕胚胎的卵黄膜。当全部膜结构被去除后，使用精细镊子沿胚胎的前后轴轻轻夹压，以分离背侧和腹侧区域。使用新的无菌移液管将背侧部分转移到含有胶原溶液的60毫米培养皿中，孵育1至2分钟，然后小心地将样本重新转移回解剖培养皿。为完成解剖，仔细去除外胚层中预定神经组织上残留的所有内胚层和中胚层污染，并轻柔地将外植体转移至含有钙溶液的35毫米培养皿中。当再收集到三个外植体后，使用P1000微量移液器将全部四个外植体转移至不含钙和镁离子的溶液的35毫米培养皿中，注意避免外植体与空气-水界面接触。然后轻轻晃动培养皿，使所有外植体聚集在培养皿中央，并在室温下孵育1小时，以使组织充分解离。在孵育期间，将最后两个胚胎转移至含庆大霉素的第二皿MMR溶液中，并盖上培养皿，使其不受干扰地继续发育。孵育结束后，使用超级胶水将带有显微刻度的盖玻片固定在35毫米细胞培养皿底部，然后用P100移液器收集解离的外植体。将移液器以接近培养皿表面的浅角度持握，将移液器吸头置于网格内侧角落，用力将细胞悬液均匀吹过有网格的区域。理想情况下，细胞会形成紧密且密集的细胞团。室温下静置一小时，使细胞贴附于培养板表面。在细胞沉降的同时，确定并记录同胞对照胚胎的发育阶段。孵育结束后，将样品皿转移至避光处，从皿边缘吸取100 µL溶液。用移液器上下吹打，将该溶液与7 µL新配制的Fluo-4 AM Pluronic F127酸溶液充分混匀，然后将全部液体重新加回样品皿中。轻轻混匀，并用铝箔覆盖培养皿。室温孵育一小时后，将外植体培养皿中的上清液取出1毫升，加入3毫升新鲜的2毫摩尔钙溶液。随后再重复两次，每次均取出3毫升上清液，替换为3毫升新鲜钙溶液。对于外植体中的钙活性成像，将样品板放置在避光的倒置共聚焦显微镜载物台上，并使用记号笔标记板的前端位置，以便在后续成像过程中能够找到相同的视野。使用10倍和20倍物镜在显微镜下定位样品，选择一个细胞密度适中、但不过于密集导致细胞成团或难以单独区分的合适视野。调节显微镜焦距，使带网格刻度的盖玻片可见，并根据需要调整初始视野，直至视野中出现可识别的编号。获取选定视野的明场图像，先将带网格的盖玻片调至清晰对焦，再将细胞调至清晰对焦。若无法清晰看到网格盖玻片及观察视野，则后续无法将细胞与生成的鱼类图像中的细胞进行共定位。然后使用488纳米激光照射样品。对于两小时的成像，需调整成像配置，以在每次扫描间隔八秒的情况下记录901帧，每帧扫描时间为3.93秒，然后运行该配置以获取图像。成像完成后，将培养板从显微镜载物台上取下，并用一毫升1X MEMFA替换培养上清液，在室温下孵育两小时，注意在孵育开始时记录同胞对照胚胎的发育阶段。可视化包含实验中所有记录细胞轨迹的复合图，可揭示总体或群体测量在多大程度上掩盖了更为精细的放电行为模式。当分离单个细胞的记录曲线时，可清晰识别出神经前体细胞特征性的不规则放电活动。为了量化这种复杂性，可采用不同的数据分析方法，包括使用多种参数来定义一次放电事件。如果在荧光原位杂交过程中培养板受到剧烈震荡，或洗涤操作过于剧烈，细胞可能从培养板表面脱落，导致无法在不同图像间对同一细胞进行匹配。如果这种干扰仅影响视野中的部分细胞，则仍有可能检测并识别图像中的部分细胞。然而，当杂交过程操作谨慎，且图像之间仅有少量细胞丢失或移位时，实验可获得最大量的数据。通过整合钙活性与神经前体细胞标志基因表达的实验结果，可以揭示特定模式的钙活性与神经递质表型之间的多种关联。利用这些数据，研究人员可以深入探究这些动态钙信号模式的更复杂特征及其与基因表达的关系，而不局限于简单的峰电位计数。

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