荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

该方案可用于在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达相关联，使研究人员能够探究这两个特征之间关系的新问题。与以往通常研究整个组织的方法相比，我们的技术聚焦于单细胞水平，从而能够评估钙活动与基因表达之间的细胞自主性关系。首先，使用紫外光对两个35毫米塑料培养皿和一个35毫米细胞培养皿进行消毒，时间约为30分钟。

在超净工作台中操作，向两个50毫升塑料锥形管、一个经紫外灭菌的培养皿以及经紫外灭菌的细胞培养皿中各加入10毫升2毫摩尔的氯化钙溶液。向另一个经紫外灭菌的培养皿中加入2毫升无钙无镁溶液，并用添加了庆大霉素的0.1倍浓度MMR溶液填充两个100毫米塑料培养皿和一个35毫米塑料培养皿。然后用70%乙醇填充一个60毫米塑料培养皿。

解剖前立即取0.01克胶原酶B，加入一管钙溶液中充分混匀。将该溶液转移至一个新的60毫米塑料培养皿中，使用解剖显微镜鉴定处于所需发育阶段的胚胎。用无菌移液管将至少六个合适的胚胎转移至一个含有MMR加庆大霉素的100毫米培养皿中。

然后将一个胚胎从 holding plate 转移至含有庆大霉素的第二个 100 毫米 MMR 培养皿中，并将此解剖培养皿置于显微镜下。使用一对钝头镊子固定胚胎，再用一对精细镊子小心剥离围绕胚胎的卵黄膜。当全部膜结构被去除后，使用精细镊子沿胚胎的前后轴轻轻夹压，以分离背侧和腹侧区域。

使用新的无菌移液管将背侧部分转移到含有胶原溶液的60毫米培养皿中，孵育1至2分钟，然后小心地将样本重新转移回解剖培养皿。为完成解剖，仔细去除外胚层中预定神经组织上残留的所有内胚层和中胚层污染，并轻柔地将外植体转移至含有钙溶液的35毫米培养皿中。当再收集到三个外植体后，使用P1000微量移液器将全部四个外植体转移至不含钙和镁离子的溶液的35毫米培养皿中，注意避免外植体与空气-水界面接触。

然后轻轻晃动培养皿，使所有外植体聚集在培养皿中央，并在室温下孵育1小时，以使组织充分解离。在孵育期间，将最后两个胚胎转移至含庆大霉素的第二皿MMR溶液中，并盖上培养皿，使其不受干扰地继续发育。孵育结束后，使用超级胶水将带有显微刻度的盖玻片固定在35毫米细胞培养皿底部，然后用P100移液器收集解离的外植体。

将移液器以接近培养皿表面的浅角度持握，将移液器吸头置于网格内侧角落，用力将细胞悬液均匀吹过有网格的区域。理想情况下，细胞会形成紧密且密集的细胞团。室温下静置一小时，使细胞贴附于培养板表面。

在细胞沉降的同时，确定并记录同胞对照胚胎的发育阶段。孵育结束后，将样品皿转移至避光处，从皿边缘吸取100 µL溶液。用移液器上下吹打，将该溶液与7 µL新配制的Fluo-4 AM Pluronic F127酸溶液充分混匀，然后将全部液体重新加回样品皿中。

轻轻混匀，并用铝箔覆盖培养皿。室温孵育一小时后，将外植体培养皿中的上清液取出1毫升，加入3毫升新鲜的2毫摩尔钙溶液。随后再重复两次，每次均取出3毫升上清液，替换为3毫升新鲜钙溶液。

对于外植体中的钙活性成像，将样品板放置在避光的倒置共聚焦显微镜载物台上，并使用记号笔标记板的前端位置，以便在后续成像过程中能够找到相同的视野。使用10倍和20倍物镜在显微镜下定位样品，选择一个细胞密度适中、但不过于密集导致细胞成团或难以单独区分的合适视野。调节显微镜焦距，使带网格刻度的盖玻片可见，并根据需要调整初始视野，直至视野中出现可识别的编号。

获取选定视野的明场图像，先将带网格的盖玻片调至清晰对焦，再将细胞调至清晰对焦。若无法清晰看到网格盖玻片及观察视野，则后续无法将细胞与生成的鱼类图像中的细胞进行共定位。然后使用488纳米激光照射样品。

对于两小时的成像，需调整成像配置，以在每次扫描间隔八秒的情况下记录901帧，每帧扫描时间为3.93秒，然后运行该配置以获取图像。成像完成后，将培养板从显微镜载物台上取下，并用一毫升1X MEMFA替换培养上清液，在室温下孵育两小时，注意在孵育开始时记录同胞对照胚胎的发育阶段。可视化包含实验中所有记录细胞轨迹的复合图，可揭示总体或群体测量在多大程度上掩盖了更为精细的放电行为模式。

当分离单个细胞的记录曲线时，可清晰识别出神经前体细胞特征性的不规则放电活动。为了量化这种复杂性，可采用不同的数据分析方法，包括使用多种参数来定义一次放电事件。如果在荧光原位杂交过程中培养板受到剧烈震荡，或洗涤操作过于剧烈，细胞可能从培养板表面脱落，导致无法在不同图像间对同一细胞进行匹配。

如果这种干扰仅影响视野中的部分细胞，则仍有可能检测并识别图像中的部分细胞。然而，当杂交过程操作谨慎，且图像之间仅有少量细胞丢失或移位时，实验可获得最大量的数据。通过整合钙活性与神经前体细胞标志基因表达的实验结果，可以揭示特定模式的钙活性与神经递质表型之间的多种关联。

利用这些数据，研究人员可以深入探究这些动态钙信号模式的更复杂特征及其与基因表达的关系，而不局限于简单的峰电位计数。