荧光钙成像及其后续原位杂交，用于异种性前体特征

该协议可用于将钙活性模式与单细胞水平的基因表达关联，使研究人员能够研究有关这两个特征之间关系的新问题。与以前通常研究整个组织的方法相比，我们的技术放大到单细胞水平，使我们能够评估钙活性和基因表达之间的细胞自主关系。首先由紫外线消毒两个35毫米塑料培养皿和一个35毫米细胞培养盘约30分钟。

在层流罩中工作，在两个50毫升塑料锥形管、一个紫外线灭菌培养皿和紫外线灭菌细胞培养皿中，每管加10毫升两毫升钙溶液。将两毫升无钙和无镁溶液添加到其他紫外线消毒的培养皿中，并填充两个 100 毫米塑料 Petri 盘和一个 35 毫米塑料 Petri 盘，配以 0.1X MMR 辅以根霉素。然后用70%乙醇填充60毫米塑料培养皿。

解剖前，将0.01克胶原蛋白彻底混合成一管钙溶液。将溶液添加到新的60毫米塑料培养皿中，并使用解剖显微镜识别所需发育阶段的胚胎。使用无菌转移移液器将至少六个合适的胚胎移动到一个包含MMR加根霉素的100毫米板中。

然后将一个胚胎从保持板移动到第二个 100 毫米的 MMR 加根霉素板中，然后将解剖板置于显微镜下。使用一对钝钳来稳定胚胎，用一对细钳小心地剥去胚胎周围的葡萄线膜。当所有膜被移除后，使用细钳沿前后轴捏胚胎以分离背和心区域。

使用新的无菌转移移液器将背部部分转移到 60 毫米的胶原液板中一至两分钟，然后小心地将标本移回解剖板。要完成解剖，请小心地去除外皮假定神经组织中所有残留的皮内皮和中皮污染，并轻轻地将外植转移到35毫米板的钙溶液中。当又收集了三个外植体时，使用 P1000 微管将所有四个外植转移到 35 毫米板的钙和镁无溶液中，注意避免外植体与空气水界面之间的任何接触。

然后轻轻旋转盘子，使所有外植植物聚集在盘子的中心，并在室温下孵育标本一小时，使组织分离。在孵育过程中，将最后两个胚胎移植到MMR的第二道菜中，并覆盖该培养皿，使这些标本不受干扰地发育。在孵化结束时，使用超级胶水将微裁定的盖玻片附在35毫米细胞培养盘的底部，并使用P100微管收集分离的外植。

将移液器以浅角靠近细胞培养盘的表面，将移液器尖端定位在向内向的网格角，并牢固地将移液器悬浮液穿过网格区域。理想情况下，细胞将定居在紧密、密集的聚类中。让细胞在室温下粘附在板上一小时。

当细胞沉淀时，确定并记录同级控制胚胎的发育阶段。在孵育结束时，将样品盘移动到受光保护的位置，从培养皿边缘吸入 100 微升溶液。将此溶液与新鲜制备的 Fluo-4 AM Pluronic F127 酸溶液的七微升混合，然后向上和向下移液，然后再将全部体积返回到样品盘。

轻轻旋转以用铝箔混合和盖住板。在室温下一小时后，用三毫升的新鲜两毫升钙溶液代替一毫升的外植培养盘上。然后用三毫升新鲜钙溶液再更换三毫升的上那液。

对于外植体内的钙活性成像，将样品板放在倒置共物显微镜的舞台上，防止环境光照射，并使用标记标记板的前点，以便在随后的成像会话中找到相同的视野。使用 10 倍和 20 倍目标在显微镜下定位样品，并选择细胞密集但密度不太高、细胞团块或难以单独区分的适当视场。调整显微镜对焦，使网格裁定的盖玻片可见，更改原始视点，直到根据需要在帧中显示可识别数字。

使用焦点中的网格裁定覆盖滑，获取所选视场的明亮字段图像，获取选定视场的亮场图像，以及具有焦点的选定视场的亮场图像。如果没有网格覆盖唇和视场的清晰图像，您将无法与稍后将生成鱼图像中的单元格共同注册单元格。然后用 488 纳米激光照亮样品。

对于两个小时的图像，修改映像配置以在运行配置以获取映像之前，以 8 秒的间隔以 3.93 秒的扫描时间录制 901 帧。成像完成后，从显微镜阶段取出板，用1X MEMFA的1毫升更换培养物，在室温下孵育两小时，注意记录同级控制胚胎在孵育开始时的发育阶段。包含实验中记录的所有细胞的轨迹的复合图的可视化揭示了体积或总体测量可以掩盖更细微的尖峰行为模式的程度。

当单个细胞的记录轮廓被分离时，可以清楚地识别神经祖细胞不规则尖峰活性特征的例子。为了量化这种复杂性，可以应用不同的数据分析方法，包括不同的参数来定义峰值。如果对板进行粗略处理，或在荧光原位杂交期间进行冲刷过于有力，则细胞可以从板表面脱落，使细胞无法跨图像进行匹配。

如果此中断仅影响视野中某些单元格，则仍可能检测和分配图像中某些单元格。但是，从一项实验中获得的最大数据量，在实验中，仔细执行杂交，并且很少在图像之间丢失或重新定位单元格。实验结果，计算钙活性与神经祖细胞标记基因的表达，可以揭示钙活性的特定模式和神经-发射机表型之间的许多关联。

有了这些数据，研究人员可以探索这些动态钙模式的更复杂的特征，以及与基因表达的关系，而不是局限于简单的尖峰计数。