Name: 靶性抗原特异性治疗抗体的肿瘤及组织分布分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学习抗体表达纯化与实时监测技术，用于肿瘤及组织分布分析。该方法可筛选非特异性分布有限的抗体，实现肿瘤富集定位，为靶向治疗研究提供快速经济的实验方案。

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我们感谢弗吉尼亚大学癌症中心核心影像设施、生物分子分析设施、先进显微镜设施以及核心动物实验设施提供的帮助。J. T-S 是卵巢癌学院（OCA-DoD）的早期职业研究者。本研究获得了美国国家癌症研究所/国立卫生研究院基金（R01CA233752）对 J. T-S 的资助、美国国防部乳腺癌研究计划（BCRP）突破性一级奖项对 J. T-S 的支持（BC17097）以及美国国防部卵巢癌研究计划（OCRP）对 J. T-S 的资助（OC180412）

所有涉及动物操作和肿瘤异种移植研究的实验程序均经弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准，并符合相关监管标准
1. 抗体的表达与纯化
<ol>
	<li>CHO 细胞的维持
	<ol>
		<li>在补充了市售 1x 谷氨酰胺添加剂的 FreeStyle CHO 培养基中，于 37 ˚C、5% CO2 条件下，使用 Delong 锥形瓶（玻璃或一次性）以 130 rpm 振荡培养 CHO 细胞。 
		注意：强烈建议使用带挡板和通气盖的锥形瓶，以增强搅拌并改善振荡过程中的气体交换。使用普通锥形瓶（无挡板）由于悬浮培养的搅拌受限，会导致抗体产量显著降低。</li>
		<li>将细胞密度维持在 1–5 × 106 个细胞/mL，细胞活力 >95%。若细胞密度超过 5 × 106 个细胞/mL，则需传代稀释。切勿使 CHO 细胞密度降至 0.2 × 106 个细胞/mL 以下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CHO 细胞的转染
	<ol>
		<li>在 200 mL 培养基（2 × 106 个细胞/mL）中，于 Delong 带挡板锥形瓶中培养 CHO 细胞。 
		注意：在带挡板锥形瓶中培养的悬浮细胞，其蛋白产量始终高于在无挡板瓶中培养的细胞。</li>
		<li>在 15 mL 离心管中，加入 5 mL CHO FreeStyle 培养基，再加入 50 μg VH 克隆 DNA 和 75 μg VL 克隆 DNA。涡旋混匀。</li>
		<li>将 DNA 混合物在室温下孵育 5 分钟。 
		注意：延长孵育时间会降低蛋白产量。</li>
		<li>向 DNA 溶液中加入 750 μL 1 mg/mL 聚乙烯亚胺（PEI）储备液，剧烈涡旋 30 秒。室温下再孵育 5 分钟。 
		注意：PEI 必须新鲜配制。多次冻融会显著降低整体产量。</li>
		<li>在手动摇动锥形瓶的同时，将 DNA 与 PEI 的全部混合物加入细胞中。立即将含细胞的 Delong 带挡板锥形瓶置于 37 ˚C、130 rpm 振荡条件下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表达 
	注意：该抗体在 N 末端设计有分泌信号肽，有助于抗体分泌至培养基中。
	<ol>
		<li>在第 1 天，将转染后的细胞在 37 ˚C、130 rpm 振荡条件下继续培养。</li>
		<li>第 2 天，加入 2 mL 100 倍抗聚集剂和 2 mL 100 倍抗菌-抗真菌溶液。将锥形瓶转移至较低温度（32–34 ˚C），继续以 130 rpm 振荡培养。</li>
		<li>每隔五天，加入 10 mL Tryptone N1 喂养液和 2 mL 100 倍谷氨酰胺补充剂。</li>
		<li>每隔三天使用血细胞计数板对台盼蓝染色后的细胞样品进行细胞计数，确保细胞活力保持在 80% 以上。</li>
		<li>第 10 或第 11 天，收集培养基用于抗体纯化。在 4 ˚C 条件下以 3000 x g 离心 40–60 分钟，然后使用 0.22 µm 瓶式滤器过滤上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化 
	注意：使用市售 Protein-A 柱（见材料表）并通过蠕动泵进行抗体纯化。
	<ol>
		<li>用两倍柱体积的结合缓冲液（pH 7.4 的 20 mM 磷酸钠）平衡层析柱。</li>
		<li>以 1 mL/min 的流速将含抗体的滤过培养基（来自步骤 1.3.5）通过层析柱。</li>
		<li>用两倍柱体积的结合缓冲液洗涤层析柱。</li>
		<li>使用 5 mL 洗脱缓冲液（pH 3.4 的 30 mM 醋酸钠）以 500 μL 分数收集洗脱抗体。</li>
		<li>通过每份洗脱液中加入 10 μL 中和缓冲液（pH 9 的 3 M 醋酸钠）来中和抗体的 pH。 
		注意：第 3 至第 6 个组分含有大部分抗体。建议保留所有组分，以防抗体洗脱晚于预期。</li>
		<li>使用分光光度计选择 IgG 默认程序测定纯化抗体的浓度。通过考虑分子量和吸光系数，获得以 mg/mL 表示的最终抗体浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 荧光标记
注意：抗体使用含有 NHS 酯反应基团的红外染料进行标记，该基团可与蛋白质结合形成稳定的共轭物。该反应对 pH 敏感，在 pH 8.5 时效果最佳。用该染料标记的荧光共轭物在 774 nm 处有最大吸收峰，在 789 nm 处有最大发射峰。pH 8.5 是实现有效共轭的关键条件。
<ol>
	<li>使用透析盒（0.1–0.5 mL）将0.5 mL抗体在1 L偶联缓冲液（pH 8.5的50 mM磷酸盐缓冲液）中透析。4小时后，将透析盒转移至新鲜缓冲液中，继续透析过夜。</li>
	<li>在500 μL反应体系中，按每1 mg抗体加入0.03 mg IRDye 800CW的比例建立偶联反应。 
	注意：IRDye 800CW以10 mg/mL浓度溶于DMSO中。</li>
	<li>在20 °C下进行标记反应2小时。 
	注意：反应时间超过2小时不会提高标记效率。</li>
	<li>通过在1× PBS中进行充分透析，纯化标记后的偶联物。</li>
	<li>通过测定染料在780 nm处的吸光度和蛋白质在280 nm处的吸光度，估算标记程度。染料在280 nm处的吸光度贡献为3%。</li>
	<li>使用以下公式计算染料/蛋白比（D/P）： 
	<img alt="染料/蛋白比公式，用于吸收光谱分析的D/P计算。" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	其中0.03为染料在280 nm处吸光度的校正因子（相当于其在780 nm处吸光度的3.0%），εDye和εProtein分别为染料和蛋白质（抗体）的摩尔消光系数。 
	注意：在PBS与甲醇1:1混合液中，εDye为270,000 M-1 cm-1，εProtein为203,000 M-1 cm-1（针对典型IgG）。非IgG类蛋白质的摩尔消光系数可能显著不同。为准确测定D/P比，必须使用目标蛋白质对应的正确消光系数。</li>
	<li>使用以下公式计算最终蛋白质浓度： 
	<img alt="基于吸光度定量的蛋白质浓度计算公式，用于光谱分析。" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
	注意：在开展体内研究之前，务必使用ELISA（酶联免疫吸附测定）或流式细胞术验证标记与未标记抗体的抗原结合活性。</li>
</ol>
3. 小鼠异种移植研究
<ol>
	<li>注射用肿瘤细胞的制备
	<ol>
		<li>在 RPMI-1640 培养基中培养 OVCAR-3 细胞，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1× 青霉素-链霉素。</li>
		<li>注射前一天，将细胞传代至新的 100 mm 培养皿中，每皿加入 10 mL 完全培养基，接种细胞数量为 0.5–1 × 106 个细胞/皿。</li>
		<li>将培养物置于 37 °C、95% 湿度和 5% CO2 条件下孵育 20–24 小时。</li>
		<li>在注射当天，从培养皿中移除生长培养基。用不含 Ca2+/Mg2+ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）彻底冲洗细胞层，以去除死细胞、细胞碎片及血清残留，避免其干扰胰蛋白酶的作用。</li>
		<li>向每皿中加入 1.0–1.5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液进行消化，并通过倾斜培养皿使溶液均匀分布，随后在 37 °C 下孵育 5–10 分钟。 
		注：应在倒置显微镜下观察细胞，以判断实际消化状态。消化不足会导致细胞从培养皿表面脱落不完全，而过度消化则会引起细胞应激。因此，适当的消化程度至关重要。</li>
		<li>每皿加入 1.0–1.5 mL 完全生长培养基以终止胰蛋白酶作用，随后轻轻吹打重悬细胞。 
		注：轻柔吹打对维持细胞活性非常重要。</li>
		<li>将细胞悬液收集至 15 mL 圆底离心管中，在室温下以 250 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液后收集细胞沉淀，并用 1× DPBS 重悬细胞进行洗涤。</li>
		<li>将细胞悬液在低速下以 250 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>加入 500 µL DPBS，通过轻柔吹打重悬细胞，获得单细胞悬液。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。 
		注：为提高准确性，建议重复计数三次并取平均值。</li>
		<li>调整体积，使最终细胞浓度达到 1 × 108 个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮下注射细胞以建立小鼠异种移植模型 
	注：所有操作均应在 BSL2 生物安全柜中进行。本研究使用了无胸腺裸鼠 Foxn1nu/Foxn1+。
	<ol>
		<li>取 50 µL 细胞悬液加入 1.5 mL 离心管中，与 50 µL 基底膜基质培养基混合。 
		注：基底膜基质培养基在室温下易形成凝胶状态，因此需将细胞与基质混合物小心置于冰上。建议将离心管、枪头和注射器先冷藏，使用前再转移至冰上。</li>
		<li>轻轻混匀混合物以避免细胞聚集。然后将含有 5 × 106 个细胞的 100 µL 细胞悬液-基质混合物吸入 1 cc 注射器中。</li>
		<li>轻轻提起动物皮肤，使其与下方肌肉层分离，使用 26 G 针头将细胞悬液（100 µL，含 5 × 106 个细胞）缓慢注入皮下。拔针前停留数秒，使基底膜基质能在皮下与细胞共同形成半固态凝胶结构，防止混合物从注射部位溢出。 
		注：注射前需检测细胞是否污染，以免对免疫缺陷小鼠造成伤害。注射时避免针头刺入过深，以防肿瘤形成位置过深。</li>
		<li>将动物置于无菌笼中，并观察约 20 分钟。</li>
		<li>观察小鼠 2–3 周，待肿瘤生长至约 500 mm3 大小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用活体成像系统进行抗体定位
注意：本实验中使用的活体成像设备（参见材料表）配备了一组高效率滤光片和光谱分离算法，可对活体生物内的细胞和基因活动进行无创、实时的可视化观察与追踪。该系统同时具备荧光和生物发光监测功能。
<ol>
	<li>通过尾静脉注射 25 μg 荧光标记抗体。
	<ol>
		<li>使用 2% 异氟烷麻醉荷瘤小鼠，并检查其足底反射是否消失。</li>
		<li>待小鼠停止活动后，用温水扩张尾部侧静脉。</li>
		<li>使用带 26 G 针头的 1 cc 胰岛素注射器，注射 25 μg（溶于 100 μL）标记抗体。</li>
		<li>同样地，作为阴性对照，标记并注射不靶向癌细胞的非特异性 IgG1 同型抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在抗体注射后 8、24、48 小时等时间点进行活体实时成像。
	<ol>
		<li>在配套软件中，点击控制面板中的 Initialize，并确认载物台温度为 37 °C。</li>
		<li>打开氧气供应，启动麻醉系统中的所有泵，接通麻醉室的异氟烷气体供应，并将异氟烷蒸发器阀门设置为 2%。</li>
		<li>将小鼠转移至麻醉室，等待其完全麻醉。涂抹眼用润滑软膏以防止眼睛干燥。</li>
		<li>进入 Control panel，通过 Imaging Wizard 选项设置荧光成像参数，选择激发波长为 773 nm，发射波长为 792 nm。 
		注：默认的自动曝光设置通常可获得良好的荧光图像。但可根据需要调整自动曝光参数。</li>
		<li>将麻醉后的小鼠转移至成像室，并通过鼻罩将其固定在成像区域。成像载物台可同时容纳最多 5 只小鼠。 
		注：分析时应同时对对照组小鼠和实验组小鼠进行成像，以确保曝光和其他设置条件一致。</li>
		<li>一切准备就绪后，在控制面板中选择 Acquire 选项以开始图像采集。</li>
		<li>在Autoexposure settings下，系统可在一分钟内生成图像。所生成的图像为荧光信号叠加在摄影图像上的融合图像，光学荧光强度以计数单位、光子数或效率形式显示。</li>
		<li>完成图像采集后，将小鼠从成像室转移回笼中，并观察其恢复情况 1 至 2 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用软件提供的工具和功能进一步优化图像，用于图像分析。图像分析工具位于菜单栏和工具面板中。
	<ol>
		<li>在 Image Adjust 下调整亮度、对比度或不透明度，并选择颜色标尺。</li>
		<li>使用 ROI Tools 在光学图像中划定感兴趣区域（ROI），并测量该区域内的信号强度。如有需要，可将定量信号数据导出至电子表格软件并进行绘图分析。</li>
		<li>对于后续研究，可并排分析不同组织（如肝、肺、心、肾、脾、脑等）的小鼠解剖样本，以详细评估荧光标记抗体的非特异性分布情况。 
		注：可通过使用抗原（本例中为 FOLR1）进行 96 孔 ELISA 检测，进一步验证组织特异性数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

选择性且肿瘤组织特异性的抗癌治疗药物递送是衡量靶向治疗疗效与安全性的关键13。本文介绍了一种快速且高效的方法，用于研究临床抗体farletuzumab及非临床抗体BaCa在组织和肿瘤中的详细分布情况。该方法适用于任何新开发的抗体，并可与具有理想特性的临床有效抗体并行使用，以评估其在肿瘤/器官中的分布特性。考虑到大多数抗体靶向的受体（如乳腺癌中的HER2）在肿瘤细胞（组织）中高度过表达，但在非肿瘤细胞类型的细胞中，其表达水平较低或功能异常同样具有重要意义14。例如，在结肠癌患者中，大量靶向EGFR的临床抗体会在皮肤组织中蓄积并引发毒性反应15，而皮肤是一种非癌组织，其生长与分化依赖于EGFR信号传导和功能。因此，我们坚信，将此类初步的组织分布研究与更大动物群体中的肝毒性及组织组织化学检测相结合，对于全面评估新开发抗体的安全性和治疗可行性至关重要。此外，若新开发的抗体对小鼠同源抗原/受体具有交叉反应性，则所述组织分布研究方法也可广泛应用于免疫功能健全小鼠的异种移植研究中。在同系动物研究中，除肿瘤分布...

美国食品药品监督管理局（FDA）于1986年批准了首个靶向CD3的单克隆抗体（OKT3，Muromonab）1,2。自此之后的二十年间，由于抗体在免疫检查点抑制剂领域取得了巨大成功，抗体工程领域迅速蓬勃发展3。除了间接激活免疫系统外，抗体还被设计用于直接标记癌细胞，以精确招募免疫效应细胞，通过死亡受体激动剂触发细胞毒性，阻断肿瘤细胞存活信号通路，抑制血管生成（血管生长），调控免疫检查点调节因子，并作为偶联载体递送放射性同位素、化疗药物和siRNA2。此外，将不同抗体的单链可变区片段（scFv）表达于患者来源的T细胞和NK细胞表面（即CAR-T和CAR-NK）的研究，已成为细胞治疗领域临床探索的快速发展方向4。
基于抗体的药物具有超高的亲和力，可选择性地靶向表达抗原的肿瘤细胞，因而成为一种极具吸引力的治疗剂。同样，治疗性抗体（或化学药物）的靶向递送及在肿瘤中的滞留是实现疗效与毒性之间平衡的关键。因此，目前正利用大量基于蛋白质工程的策略（包括但不限于双特异性5和三特异性抗体6），以显著增强静脉注射（IV）治疗药物在肿瘤中的亲和力优化滞留5,7。本文中，我们描述了一种简单的基于荧光的方法，用于研究潜在有效抗癌抗体在肿瘤和组织中的分布情况。
由于动物组织在可见光谱激发下具有自发荧光，因此最初使用近红外染料（如 IRDye 800CW）对抗体进行标记。在概念验证研究中，我们采用了靶向叶酸受体α-1（FOLR1）的抗体farletuzumab及其衍生的双特异性锚定细胞毒性激活剂（Bispecific anchor Cytotoxicity activator, BaCa）7抗体，后者是一种可同时靶向FOLR1和死亡受体-5（DR5）8的重组抗体。FOLR1是在卵巢癌和三阴性乳腺癌（TNBC）细胞、肿瘤异种移植模型及患者肿瘤组织中明确高表达的靶向受体9。值得注意的是，目前已有多种临床尝试利用基于抗体的策略，通过招募免疫效应细胞或使用抗体-药物偶联物（ADC），针对卵巢癌和乳腺癌中的FOLR1进行治疗10,11。
在本方法学论文中，我们利用CHO表达系统克隆、表达并纯化了临床用抗FOLR1抗体（farletuzumab）以及其他对照抗体。IgG1同型抗体以及一种临床抗独特型黏蛋白-16抗体abagovomab12被用作阴性对照。在经过蛋白A纯化后，将指定抗体用IRDye 800CW进行标记，并通过尾静脉注射至携带卵巢肿瘤异种移植瘤或稳定转染表达人FOLR1的鼠结肠癌异种移植瘤的裸鼠体内。通过活体成像系统在多个不同时间点对抗体的定位进行实时成像追踪7。该方法无需任何基因修饰或底物注射即可实现发光，显著更快速、经济且高效。下文所述的一般性克隆、表达、纯化及标记方案，只要已知重链和轻链序列，即可适用于任何临床或非临床抗体。

<table><tbody><tr><td>FreeStyle CHO 培养基</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 12651-014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>防结块剂</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 01-0057DG</td><td></td></tr><tr><td>BD 胰岛素注射器</td><td>BD BioSciences</td><td>Cat #329420</td><td></td></tr><tr><td>Caliper IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>Cat #124262</td><td></td></tr><tr><td>CHO CD EfficientFeed B</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat #A10240-01</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-13-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 标记的抗人 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Cat # 709-175-149</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HiPure 质粒大提试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # K21007</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat # 11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>Infusion</td><td>Takara BioScience</td><td>STO344</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW NHS 酯</td><td>LI-COR</td><td>Cat # 929-70020</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Covetrus</td><td>Cat # 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>润滑性眼膏</td><td>Refresh Lacri-Lube</td><td>Cat #4089</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354234</td><td></td></tr><tr><td>PEI 转染试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat # BMS1003A</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat # 66333</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 真空滤器</td><td>Millipore Express</td><td>Cat #S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15400-054</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验模型：细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人：OVCAR-3</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>ATCC HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>人：CHO-K 细胞</td><td>本实验室稳定转染获得</td><td>ATCC CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>小鼠：4T1</td><td>由弗吉尼亚大学 Dr. Chip Landen 惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠：MC38</td><td>由马里兰大学巴尔的摩县分校 Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg 惠赠</td><td>通过 STR 分型鉴定</td><td></td></tr><tr><td>小鼠：MC38 hFOLR1</td><td>本实验室构建（本文）</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验模型：动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠：裸鼠 Foxn1&lt;sup&gt;nu&lt;/sup&gt;/Foxn1&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Envigo</td><td>多次订购</td><td></td></tr><tr><td>小鼠：NOD.Cg Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt; Il2rg&lt;sup&gt;tm1Wjl&lt;/sup&gt;/SzJ</td><td>Jackson Laboratory</td><td>多次订购</td><td></td></tr></tbody></table>

分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤及组织中的分布

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

单克隆抗体是一类高亲和力的多功能药物，可通过多种不依赖于可变区的机制清除癌细胞。在过去几十年中，抗体-药物偶联物、双特异性抗体、嵌合抗原受体（CAR）以及癌症免疫治疗领域已成为基础研究和治疗探索中最具前景的方向。随着针对免疫检查点受体以及在白血病和黑色素瘤中应用CAR-T细胞的多项人类临床试验取得突破性进展，源自抗体工程技术的各种肿瘤治疗手段正处于令人振奋的发展阶段。然而遗憾的是，在实体瘤的人体试验中，大量基于抗体和CAR的治疗方法效果不佳，主要原因在于肿瘤微环境中免疫效应细胞的可及性有限。此外，治疗性抗体在非肿瘤组织中的非特异性分布也导致了临床疗效不足、相关毒性反应以及临床试验失败。由于临床前研究向人体临床试验的可靠转化在很大程度上依赖于小鼠肿瘤异种移植模型的疗效与安全性评估，本文重点介绍一种用于检测治疗性抗体在肿瘤及正常组织中分布情况的方法。该方法通过使用近红外荧光染料标记经蛋白A纯化的抗体，随后对荷瘤小鼠进行活体成像来实现。

在所述方法中，我们首先克隆了靶向叶酸受体α-1（FOLR1）的抗体farletuzumab，以及一种名为BaCa的双特异性抗体（由farletuzumab和lexatumumab组成），同时还包括abagovomab等对照抗体（序列见补充文件1）。DNA克隆中代表性重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的详细信息如图1A所示。为确认阳性克隆，我们采用信号肽前向引物（SP For）与CK Rev/CH3 Rev引物进行菌落PCR（引物序列见补充文件1）。菌落PCR的代表性结果证实了轻链和重链具有预期大小（图1C）。阳性抗体克隆还通过Sanger测序进一步验证。在确认完成pVH和pVL DNA克隆后，使用CHO悬浮培养系统进行转染，随后在4 °C条件下通过蛋白A亲和层析纯化抗体（详见图1B及实验方案中的具体步骤）。
纯化的farletuzum...

本文介绍了一种在小鼠肿瘤异种移植模型中研究抗体体内定位的实验方案。

单克隆抗体是一类高亲和力的多功能药物，通过可变区非依赖性机制发挥作用，以清除癌细胞。在过去的几年中……

本方案展示了抗体的表达与纯化，以及抗体在肿瘤和组织中分布的实时监测。采用所述方案筛选抗体将有助于选择非特异性组织分布有限且在肿瘤中富集的抗体。所述技术快速且成本效益高。其他技术，例如单光子发射计算机断层扫描和正电子发射断层扫描，成本高昂，且需要放射性及其他复杂的示踪剂。该技术不仅限于癌症靶向抗体，还可应用于其他任何疾病，如肺部或心脏疾病，用于分析抗体在体内的分布情况。演示该实验操作的是来自我校的兽医技术员 Jeremy Gatesman。将 200 毫升培养基中的原始 CHO 细胞置于 Delong 型带挡板的锥形瓶中。在 15 毫升离心管中，将 5 毫升 CHO FreeStyle 培养基与 50 微克的可变重链克隆 DNA 以及 75 微克的可变轻链克隆 DNA 混合。然后，涡旋混匀该离心管。将混合物在室温下静置5分钟。向DNA溶液中加入750 µL浓度为1 mg/mL的聚乙烯亚胺储备液，并剧烈涡旋混匀30秒。将混合物在室温下再放置五分钟。在手动摇动烧瓶的同时，将全部混合物加入CHO细胞中。立即于37摄氏度、130转/分钟摇动条件下培养细胞。第二天，向细胞中加入2毫升100倍浓度的防结块剂和2毫升100倍浓度的抗菌抗真菌溶液。将培养瓶置于32至34摄氏度条件下，以130转/分钟振荡培养。继续培养细胞10至11天，每隔5天添加10毫升胰蛋白胨N1培养液和2毫升100倍浓度的谷氨酰胺补充剂。每隔三天计数细胞，以确保细胞活力保持在80%以上。在第10天或第11天，通过在4°C条件下以3000 × g离心40至60分钟，收获培养基用于抗体纯化。随后，使用0.22微米的瓶式滤器过滤澄清的培养基。为纯化抗体，用两倍柱体积的结合缓冲液平衡蛋白A柱。以每分钟1毫升的流速将过滤后的上清液过柱。随后用两倍柱体积的结合缓冲液洗涤层析柱。用5毫升洗脱缓冲液将抗体洗脱至每管500微升的组分中。通过每份加入10微升中和缓冲液，中和上述抗体的pH值。使用IgG的默认方案，通过分光光度计测定纯化抗体的浓度。取0.5毫升抗体，使用透析盒在1升偶联缓冲液中进行透析。四小时后，将透析盒转移至新鲜缓冲液中，透析过夜。设置偶联反应时，在总共500微升的体积中，每1毫克抗体加入0.03微克的IRR染料800 CWU。在20摄氏度下孵育混合物2小时，然后通过在PBS中进行充分透析来纯化标记的偶联物。通过测量染料在780纳米处的吸光度以及蛋白质在280纳米处的吸光度，估算标记程度。为建立小鼠异种移植模型，轻轻提起动物的皮肤并将其与下方的肌肉层分离。使用26号针头将100微升细胞悬液缓慢皮下注射。拔出针头前等待几秒钟，使基底膜基质介质在皮下与细胞共同形成半固体凝胶状结构，以防止混合物从注射部位溢出。为进行活体成像，通过尾静脉注射标记染料的抗体。麻醉小鼠后，检查其足底反射是否消失，并通过应用温水使静脉扩张。使用带有26号针头的1毫升胰岛素注射器，在100微升体积中注射25微克标记抗体。作为阴性对照，使用不靶向癌细胞的非特异性IgG同型抗体进行标记并注射。在抗体注射后的8小时、24小时和48小时进行活体成像。在成像软件中，单击初始化。确认载物台温度为 37 摄氏度。在控制面板中，通过成像向导设置荧光成像，并将激发波长设为 773 纳米，发射波长设为 792 纳米。将麻醉后的小鼠转移至成像室中，使用鼻罩将其固定在成像区域。准备就绪后，点击控制面板上的“采集”按钮开始获取图像，然后点击“自动曝光”。生成的图像为荧光信号与光学照片的叠加，其中荧光强度和密度以计数或光子数为单位显示。通过菌落PCR确认了含有可变重链和可变轻链的阳性cDNA克隆。此处展示了纯化的farletuzumab在非还原和还原SDS-PAGE中的代表性结果。重链和轻链经还原后分别产生50和25千道尔顿的条带。还证实了抗体与细胞表面天然蛋白的结合。将荧光标记的抗体经尾静脉注射至移植有高表达R1肿瘤的小鼠体内。使用 IVIS 在多个时间点对动物进行活体成像。数据证实，完整的 R1 和 BaCa 抗体在肿瘤中具有选择性富集。在实施本方案时，需注意 CHO 细胞的培养维持对抗体产量至关重要。对于竞争性肿瘤定位而言，保持荧光染料偶联程度相近非常重要。通过该方法处理后，可进一步开展其他实验，如组织免疫组织化学、组织或肿瘤特异性ELISA，以支持活体小鼠成像数据。

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癌症研究

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