靶性抗原特异性治疗抗体的肿瘤及组织分布分析
2020年5月16日
在这里，我们提出了一个方案，研究小鼠肿瘤异种移植模型中抗体的体内定位。
该协议演示抗体的表达和纯化，以及肿瘤和组织抗体分布的实时监测。使用所述方案筛选抗体将有助于选择非特异性组织分布有限的抗体，并丰富肿瘤定位。所述技术快速且经济高效。
其他技术，如单光子发射计算机断层扫描和正电子发射断层扫描，非常昂贵，需要放射性和其他精密的示踪剂。该技术不限于针对癌症的抗体。它可以应用于任何其他疾病，如肺或心脏病，用于分析体内的抗体分布。
演示这个程序的将是杰里米盖茨曼，一个兽医技术员从我大学。在德隆，埃伦迈尔的200毫升介质中，生CHO细胞的烧瓶是迷惑不解的。将5毫升CHO自由式介质与50微克的可变重克隆DNA相结合，在15毫升管中结合75微克的可变轻克隆DNA。
然后，旋转管子。将混合物留在室温下五分钟。将750微升（每毫升聚乙胺胺1毫克）添加到DNA溶液中，并积极旋转30秒。
将混合物留在室温下再多五分钟。将整个混合物添加到CHO细胞中，同时手动摇动烧瓶。立即在37摄氏度下孵育细胞，同时在130 RPM下摇晃。
第二天，向细胞添加两毫升100 X抗皱液，加入两毫升100 X抗菌抗菌抗肿瘤溶液。在32至34摄氏度下孵育烧瓶，在130 RPM时摇晃。继续培养细胞10至11天，每五天加入10毫升的 Trypton N1 饲料，每五天加入两毫升 100 X 谷氨酰胺补充剂。
每三天对细胞进行计数，以确保细胞生存能力在第10天或第11天保持80%以上，通过将培养基在3000倍G和4摄氏度（4摄氏度）的40至60分钟内离心，收获抗体纯化的培养基。然后，使用 0.22 微米瓶过滤器过滤透明介质。为了净化抗体，用两列结合缓冲液平衡蛋白质 A 列。
以每分钟一毫升的流速通过柱形过滤介质。然后用两列卷绑定缓冲区清洗列。使用五毫升洗脱缓冲液将抗体洗成500微升分数。
通过加入10微升中和缓冲液进行分馏，中和所暗示抗体的pH值。使用 IgG 的默认协议使用分光光度计测量纯化抗体的浓度。透析 0.5 毫升抗体使用透析盒在一升结合缓冲液中。
四个小时后，将透析盒转移到新鲜的缓冲液和透析过夜。为了建立结合反应，每一毫克抗体加入0.03微克的 IRR 染料 800 CWU，总体积为 500 微升。在20摄氏度下孵育混合物两小时，然后通过对PBS进行广泛透析来净化标记的结合体。
通过测量染料780纳米的吸收度和280纳米的蛋白质的吸收度来估计标记的程度。要开发小鼠异种图，请轻轻抬起动物的皮肤，将其从底层肌肉层分离。用26针在皮肤下缓慢注射100微升细胞悬浮液。
等待几秒钟，然后拿出针头，使地下室基质介质与皮肤下的细胞一起为半固体凝胶状结构提供信息，从而防止混合物从注射部位出来。要进行体内成像，请通过尾静脉注射标有抗体的染料。麻醉鼠标后，检查踏板反射反应不足，通过应用温水扩张静脉。
使用 1cc 胰岛素注射器与 26 量针注射 25 微克标记的抗体在 100 微升的体积。作为负对，标记和注射非特异性IgG等型抗体，不针对癌细胞。在抗体注射后8、24和48小时进行体内成像。
在成像软件中，单击初始化。确认舞台温度为 37 摄氏度。在控制面板中，通过成像向导设置荧光成像，将激发设置为 773 纳米，发射到 792 纳米。
将麻醉小鼠转移到成像室。使用鼻锥将它放在成像场上。准备就绪后，单击用于图像采集的控制面板上的"获取"，然后单击"自动公开"。
生成的图像是荧光覆盖在摄影图像上，以计数或光子单位显示光学荧光和密度。具有可变重域和可变光域的正 cDNA 克隆用聚落 PCR 得到确认。在非还原和减少 SDS 页面上运行的纯化 farletuzumab 的代表性结果如下所示。
重链和轻链在减少后产生50和25千吨带。细胞表面抗体与原生蛋白质的结合也得到确认。荧光标记的抗体被注入尾静脉，移植到小鼠与完整的R1表达肿瘤。
使用 IVIS 的动物在多个时间点被活图像。数据对肿瘤中完全R1和BaCa抗体的选择性富集。在尝试此协议时，请记住，保持CHO细胞对抗体产生至关重要。
具有类似程度的荧光染料结合对于竞争性肿瘤定位具有十分重要。按照这个程序，其他方法，如组织免疫组织化学和组织或肿瘤特异性ELISA可以执行，以支持活鼠成像数据。
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概述
该协议展示了抗体的表达和纯化以及实时监测抗体在肿瘤和组织中的分布。它旨在帮助选择具有有限非特异性组织分布的抗体，丰富肿瘤定位。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 免疫学
背景
- 抗体定位对于靶向治疗至关重要。
- 当前的成像技术可能昂贵且复杂。
- 该协议提供了一种经济有效的替代方案。
- 适用于癌症以外的各种疾病。
研究目的
- 提供一个研究体内抗体分布的协议。
- 增强治疗用抗体的选择。
- 促进癌症和其他疾病的研究。
使用的方法
- 抗体的表达和纯化。
- 实时监测抗体分布。
- 筛选非特异性组织分布。
- 应用于各种疾病模型。
主要结果
- 在肿瘤异种移植模型中成功定位抗体。
- 识别具有最小非特异性结合的抗体。
- 展示了该技术的成本效益。
- 可能应用于其他疾病如肺病和心脏病。
结论
- 该协议是抗体研究的有价值工具。
- 它可以改善治疗抗体的选择。
- 提供了一种快速有效的方法来研究抗体分布。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of therapeutic antibody distribution in tumor versus non-tumor tissues is critical for de-risking oncology portfolios and optimizing candidate selection. This protocol enables rapid, cost-effective in vivo evaluation of antibody localization, directly informing target engagement and off-target risk in preclinical models. Such distribution data are essential for advancing antibodies with favorable tumor enrichment and minimal non-specific tissue exposure toward clinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of antibody targeting and tumor localization in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying non-specific tissue distribution.
- Facilitates prioritization of candidates with optimal biodistribution profiles.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized workflow for screening antibody candidates for tissue selectivity.
- Generates quantitative imaging outputs to compare tumor versus off-target accumulation.
- Enables reproducible assessment of labeling and imaging parameters across candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical antibody distribution data with translational biomarker strategies.
- Supports continuity from discovery through preclinical safety and efficacy evaluation.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on in vivo localization evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early antibody screening with translational in vivo validation.
- Discovery Biology: Provides direct evidence of target engagement and tissue selectivity in animal models.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging data for candidate comparison.
- Analytics: Enables measurement of fluorescence intensity and spatial distribution to inform selection.
- Translational Research: Supports alignment of preclinical distribution with clinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for evaluating diverse antibody formats and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in candidate selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes in vivo distribution assessment and improves reproducibility.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and enhances capital efficiency by focusing on candidates with optimal profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antibody therapeutics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody engineering, labeling, and small animal imaging.
- Needs access to fluorescence imaging instrumentation and analytical software.
- Demands cross-team standardization of labeling and imaging protocols for comparability.
- Adaptable to various antibody formats and disease models with appropriate controls.
- Dependent on maintaining cell viability and consistent labeling for reliable results.
