Name: 通过旗-生物素串联纯化通过交叉链接和免疫沉淀对蛋白质-RNA相互作用进行转录组-全过程分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习Fbio CLIP-seq方法，利用FLAG-生物素串联纯化技术鉴定哺乳动物细胞中RNA结合蛋白的RNA靶标。该方法无需同位素和特异性抗体，可高效检测直接结合的蛋白-RNA相互作用。

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经费支持来自中国国家重点基础研究发展计划（2017YFA0504204、2018YFA0107604）、国家自然科学基金委员会（31630095）以及清华大学生命科学中心。

1. 细胞系构建
<ol>
	<li>将目的基因克隆到 PiggyBac 载体 pPiggyBac-FLAG-bio-[目的 cDNA]-(潮霉素抗性) 质粒中，该质粒携带 FLAG-生物素表位13,21，用于表达融合有 FLAG-生物素标签的 RNA 结合蛋白（FBRBP）。</li>
	<li>将表达FBRBP 的载体与 pBase 载体共转染至表达 BirA 酶的细胞系中22。 
	注意：本研究中，将FBRBP 基因转染至已整合 BirA 表达载体的小鼠胚胎干细胞（mESCs）中21。或者，也可将表达FBRBP 的载体与 pBase 和 pPiggyBac-BirA-V5 载体共同转染入细胞。</li>
	<li>将细胞接种于明胶包被的培养皿中，在 mESC 培养基（材料表）中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。使用潮霉素 B（100 µg/mL）筛选转染细胞，持续 1 周。</li>
	<li>药物筛选后，用 SDS 上样缓冲液（表 1）收集细胞，并通过 Western 印迹23 分别使用 FLAG 抗体和链霉亲和素-HRP 检测标签的连接情况及目的基因的表达水平。</li>
</ol>
2. 交联
<ol>
	<li>接种约 3 x 106 实验前一天在10 cm培养皿中接种mES细胞，使细胞在收获时达到70−90%汇合度（每样本约5−10×10⁶个细胞）。</li>
	<li>用真空泵吸去培养基。加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，在室温（RT）处理 2 分钟，随后加入 4 mL 新鲜 mESC 培养基终止胰蛋白酶反应。将细胞转移至 15 mL 离心管中。在 300 x g 4 °C下离心3分钟，弃上清液。</li>
	<li>用4 mL冷PBS重悬细胞，并将细胞重新接种至10 cm培养皿中用于交联。使用254 nm紫外光照射进行细胞交联（将紫外交联仪参数设置为400 mJ/cm²）。2). 
	注意：对于细胞单层，可在胰蛋白酶处理前直接在培养板上用紫外光进行交联。</li>
	<li>将交联的细胞转移至15 mL离心管中，以300 x g离心沉淀细胞。 g 4 °C下离心3分钟，弃去上清液。 
	注意：交联的细胞沉淀可在 -80 °C 保存至使用。</li>
</ol>
3. 细胞裂解液的制备
<ol>
	<li>用 500 µL 裂解缓冲液 A（表 1）重悬细胞，该缓冲液需新鲜添加 1 mM DTT、1 mM PMSF、1/500 蛋白酶抑制剂混合物和 400 U/mL RNase 抑制剂。将细胞转移至无 RNase 的 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 条件下于旋转仪上轻柔旋转孵育 30−60 分钟。</li>
	<li>加入 30 µL DNase I，在 37 °C 处理 10 分钟。加入 4 µL 0.5 M EDTA 终止反应。在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 20 分钟，沉淀不溶物，并将上清液转移至新的预冷 1.5 mL 离心管中。 
	注意：如需立即使用，请置于冰上；若不立即使用，应于 -80 °C 保存直至使用。</li>
</ol>
4. FLAG 磁珠的制备
<ol>
	<li>每个样品向新的 1.5 mL 离心管中加入 40 µL FLAG 磁珠悬液。</li>
	<li>用 0.5 mL 冰冷的洗涤缓冲液 A 快速洗涤磁珠，并在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 2 分钟。</li>
	<li>重复步骤 4.2 一次。在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 2 分钟，使磁珠沉淀。用细尖移液枪头小心吸除上清液，避免吸走磁珠。</li>
</ol>
5. 免疫沉淀
<ol>
	<li>将步骤 3.2 中的细胞裂解液转移至预先平衡的 FLAG 琼脂糖微珠中。将所有样品置于 4 °C 条件下，在旋转摇床上轻轻旋转孵育 2−4 小时或过夜。</li>
	<li>以 3,000 × g 离心 2 分钟，收集微珠并弃去上清液。</li>
	<li>加入 0.5 mL 预冷的洗涤缓冲液 A，在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育 5 分钟，随后以 3,000 × g 离心 2 分钟收集微珠，并弃去上清液。重复洗涤一次。</li>
	<li>按照步骤 5.3 的方法，使用 0.5 mL 预冷的洗涤缓冲液 B（表 1）重复洗涤两次。</li>
</ol>
6. 使用 3x FLAG 肽进行洗脱
<ol>
	<li>通过将1 mg的3x FLAG肽溶解于5 mL洗涤缓冲液A中，配制3x FLAG洗脱液，终浓度为200 ng/mL。</li>
	<li>在3,000 × g 条件下离心5.4步骤中的FLAG磁珠2分钟，小心去除上清液。使用细尖移液枪头确保尽可能去除全部上清液。</li>
	<li>向每个样品中加入200 µL 3x FLAG洗脱液，在4 °C下轻柔旋转孵育30分钟。在3,000 × g 条件下离心2分钟以沉淀FLAG磁珠，将上清液转移至新的离心管中。</li>
	<li>按照步骤6.2和6.3重复洗脱两次，并将所有洗脱液合并。保留5%的洗脱液用于Western blot分析或银染，以检测FLAG-IP的效率。</li>
</ol>
7. 链霉亲和素磁珠的制备
<ol>
	<li>为每个样品准备 50 µL 链霉亲和素磁珠悬液。将磁珠置于磁力架上静置 30 秒，用移液枪吸头吸除上清液。</li>
	<li>用 0.5 mL 冰冷的洗涤缓冲液 A 快速洗涤磁珠一次，并将磁珠置于磁力架上静置 30 秒。</li>
	<li>重复洗涤一次。洗涤后吸除上清液。</li>
</ol>
8. 生物素亲和纯化
<ol>
	<li>将步骤 6.4 中合并的洗脱液转移至步骤 7.3 的链霉亲和素磁珠中，4 °C 下轻轻旋转孵育 1−3 小时或过夜。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上静置 30 秒，吸除上清液。加入 500 µL 洗涤缓冲液 C（表 1），室温下轻轻旋转孵育 5 分钟，重复洗涤 2 次。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上，吸除上清液。加入 500 µL 洗涤缓冲液 D（表 1），室温下旋转孵育 5 分钟，重复洗涤 2 次。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上，吸除上清液。立即用 500 µL 冰冷的 PNK 缓冲液（表 1）快速洗涤 2 次。</li>
</ol>
9. RNA 部分消化
<ol>
	<li>用MNase反应缓冲液（表1）将MNase稀释105倍。向每个样品中加入100 µL MNase溶液。在37 °C下使用设定为1,200 rpm（运行5秒，暂停30秒）的恒温混合仪涡旋振荡 beads 10分钟，随后将beads置于磁力架上30秒以收集，并弃去上清液。 
	注意：MNase的浓度应根据不同RNA结合蛋白进行优化。能够将RNA消化为30−50 nt片段（由最终文库插入片段大小确定）的MNase浓度为最佳。</li>
	<li>用500 µL预冷的PNK+EGTA缓冲液（表1）快速洗涤beads两次。每次洗涤后均需将beads置于磁力架上并弃去上清液。</li>
	<li>用500 µL洗涤缓冲液C在室温下轻柔旋转洗涤beads两次，每次5分钟。然后用500 µL预冷的PNK缓冲液快速洗涤beads两次。</li>
</ol>
10. RNA 去磷酸化
<ol>
	<li>配制小牛肠碱性磷酸酶（CIP）反应体系：加入 8 µL 的 10× CIP 缓冲液（材料表）、3 µL CIP 酶和 69 µL 水。每反应总体积为 80 µL。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上收集并弃去上清液。向磁珠中加入 CIP 反应体系。使用设定为 1,200 rpm（运行 5 秒，暂停 30 秒）的温控混匀仪在 37 °C 下涡旋振荡磁珠 10 分钟。</li>
	<li>用 500 µL 冰冷的 PNK+EGTA 缓冲液快速洗涤磁珠两次。再用 500 µL 冰冷的 PNK 缓冲液快速洗涤磁珠两次。</li>
</ol>
11. 3’ 连接子连接
<ol>
	<li>配制3’接头混合液：将4 µL的20 µM 3’接头、4 µL的10x T4 RNA连接酶缓冲液、4 µL的50% PEG8000、2 µL的T4 RNA连接酶2（截短型）和26 µL的水混合。每反应总体积为40 µL。</li>
	<li>使用磁力架收集第10.3步的磁珠，并弃去上清液。向磁珠中加入40 µL的3’接头连接反应混合液。在16 °C下，使用设定为1,200 rpm（运行5秒，暂停30秒）的温控混合仪涡旋振荡磁珠，反应3小时或过夜。</li>
	<li>用500 µL预冷的PNK+EGTA缓冲液快速洗涤磁珠两次。再用500 µL预冷的PNK缓冲液快速洗涤磁珠两次。</li>
</ol>
12. PNK 处理
<ol>
	<li>配制PNK反应液：取4 µL的10x PNK缓冲液、2 µL的T4 PNK酶、1 µL的10 mM ATP以及33 µL的水。每反应总体积为40 µL。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上收集并弃去上清液。向磁珠中加入40 µL的PNK反应液。使用设定为1,200 rpm（运行5秒，暂停30秒）的温控混匀仪，在37 °C下轻轻涡旋振荡10分钟。</li>
	<li>用500 µL预冷的含EGTA的PNK缓冲液快速洗涤磁珠一次。</li>
	<li>用500 µL预冷的PNK缓冲液再次快速洗涤磁珠一次。保留5%的磁珠用于后续Western blot或银染分析，以验证免疫沉淀的效率。</li>
</ol>
13. RNA 提取
<ol>
	<li>用磁力架收集步骤 12.4 中的磁珠，并移除缓冲液。加入 200 µL 蛋白酶 K 消化缓冲液（表 1）。在 37 °C 下使用设定为 1,200 rpm（运行 5 秒，停止 30 秒）的热混仪涡旋振荡磁珠 30 分钟。通过磁力分离磁珠，收集上清液用于后续实验。</li>
	<li>向步骤 13.1 的上清液中加入 400 µL RNA 提取试剂（材料表），充分混匀，并在冰上孵育 5 分钟。加入 80 µL 氯仿，充分混匀后再次在冰上孵育 5 分钟。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。 
	注意：此步骤应在化学通风橱中进行。</li>
	<li>取上清液（约 500 µL），加入两倍体积的异丙醇:乙醇混合液（1:1）、1/10 体积的 3 M 醋酸钠（pH = 5.5）以及 1 µL 糖原。在 -20 °C 下冷冻 2 小时。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 20 分钟。</li>
	<li>用预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀物两次。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟以沉淀。移除上清液并干燥沉淀物。将 RNA 溶解于 5 µL 无 RNase 的 H2O 中。</li>
</ol>
14. 5’ RNA 连接子连接
<ol>
	<li>配制5’端RNA连接反应体系：加入1 µL 10× T4 RNA连接酶缓冲液、0.5 µL BSA（1 µg/µL）、1 µL 10 mM ATP、1 µL RNase抑制剂和0.5 µL T4 RNA连接酶。每反应总体积为4 µL。</li>
	<li>向第13.4步获得的RNA中加入1 µL 5’端20 µM RNA接头，于70 °C加热2分钟使RNA变性，随后立即置于冰上冷却。</li>
	<li>将5’端RNA连接反应体系加入第14.2步的RNA中，16 °C孵育过夜。</li>
</ol>
15. 逆转录
<ol>
	<li>按照第13节所述方法纯化RNA，并用11.5 µL无RNase的水溶解RNA。</li>
	<li>向纯化的RNA中加入1 µL浓度为10 µM的反转录引物，在70 °C加热2分钟，然后立即置于冰上冷却。</li>
	<li>配制反转录反应体系：加入4 µL 5x反转录缓冲液、1 µL 10 mM dNTPs、1 µL 0.1 M DTT、1 µL RNase抑制剂和0.5 µL反转录酶（材料表）。每反应总体积为7.5 µL。</li>
	<li>将7.5 µL反转录反应体系加入RNA样品中，在50 °C孵育30分钟，然后在70 °C孵育10分钟以终止反应。随后置于4 °C保存。</li>
</ol>
16. PCR 扩增
<ol>
	<li>配制PCR扩增体系：加入15 µL的2x PCR预混液（材料表）、5 µL第15.4步的cDNA、0.6 µL的10 µM正向引物1（表2）、0.6 µL的10 µM反向引物1（表2）以及8.8 µL的H2O，总体积为30 µL。</li>
	<li>按以下程序扩增cDNA：98 °C 30 s，98 °C 10 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s（重复第2−4步15−20个循环），72 °C 2 min，然后置于4 °C保存。将PCR产物在2−3%琼脂糖凝胶上电泳，切取约100−150 bp的DNA条带，使用凝胶回收试剂盒（材料表）提取DNA，并用20 µL水洗脱DNA。</li>
	<li>取3 µL纯化后的PCR产物，按照第16.2步所述条件，使用正向引物2（表2）和反向引物2（index引物；表2）进行5个循环的扩增，以引入index序列。PCR产物的纯化步骤同第16.2步所述。</li>
	<li>使用高通量测序平台对文库进行测序。</li>
</ol>
17. 生物信息学分析
<ol>
	<li>使用商业软件进行数据分析，方法如前所述8。</li>
</ol>

<ol><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
<li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3%27+Ends%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li>
<li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li>
<li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).</li>
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<li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+%28eCLIP%29+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681(2019).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种改良的CLIP-seq方法，称为FbioCLIP-seq，该方法利用FLAG-生物素双标签系统对蛋白质-RNA复合物进行串联纯化。已有研究表明，FLAG-生物素双标签系统在鉴定蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用方面具有强大优势13,21。本文展示了该系统在鉴定与蛋白质相互作用的RNA时具有高特异性和操作便捷性。通过串联纯化和严格的洗涤条件，我们省略了技术难度较高的SDS-PAGE和膜转移步骤，从而更好地保留了蛋白质-RNA相互作用，并避免了同一复合物中RNA结合蛋白（RBP）带来的RNA信号污染。此外，跳过这些步骤也避免了使用放射性标记的ATP对RNA进行标记，使实验流程大大简化。需要注意的是，在本论文撰写过程中，另一种类似的方法uvCLAP也已被提出24。
该实验方案的成功需要注意以下几个关键步骤。首先，在实验前应通过蛋白质印迹法（Western blot）确认标记蛋白生物素标...

RNA 和 RNA 结合蛋白（RBPs）调控多种细胞过程，包括剪接、翻译、核糖体生物合成、表观遗传调控以及细胞命运转变1,2,3,4,5,6。这些过程的精细机制依赖于 RNA 和 RBPs 在空间和时间上的特异性分布。因此，要从分子水平上理解 RNA 的调控机制，一个重要步骤是揭示 RBPs 结合位点的位置信息。
一种称为交联免疫沉淀测序（CLIP-seq）的策略已被开发出来，用于捕捉蛋白质-RNA相互作用，其过程包括使用紫外交联，随后对目标蛋白质进行免疫沉淀7该方法的关键特征是通过紫外照射在RNA结合蛋白与其直接结合的RNA分子（约1 Å范围内）之间诱导形成共价交联。8RBP 足迹可通过 CLIP 标签聚类和峰识别来确定，通常分辨率为 30−60 nt。或者，CLIP 的逆转录步骤可在交联位点处导致插入缺失（indels）或碱基替换，从而实现 RNA 上蛋白质结合位点的单核苷酸分辨率鉴定。已开发出 Novoalign 和 CIMS 等分析流程，用于 CLIP-seq 高通量测序结果的分析8还提出了多种改进的CLIP-seq方法，包括单核苷酸分辨率交联免疫沉淀法（iCLIP）、增强型CLIP（eCLIP）、irCLIP，以及光活化核糖核苷增强型交联免疫沉淀法（PAR-CLIP）。9,10,11,12.
尽管传统的CLIP-seq方法在RBP研究中被广泛应用，但CLIP方法仍存在若干缺点。首先，繁琐的变性凝胶电泳和膜转移步骤可能导致信息丢失，并造成序列复杂性降低。其次，基于蛋白质特异性抗体的CLIP方法可能沉淀整个蛋白质复合物而非单一目标蛋白，从而导致共纯化的RBP产生假阳性的蛋白-RNA相互作用。第三，基于抗体的策略需要大量高质量的抗体，这使得在缺乏高质量抗体的情况下，这些方法难以应用于相关RBP的研究。第四，传统CLIP方法需要使用放射性标记的ATP来标记与蛋白质结合的RNA。
链霉亲和素对生物素化蛋白的高亲和力使其成为纯化特定蛋白或蛋白复合物的强有力方法。在哺乳动物细胞中异源表达细菌生物素连接酶BirA，可对携带人工肽序列的蛋白进行高效生物素标记，从而实现体内生物素亲和纯化。13我们开发了一种改良的CLIP-seq方法，称为 FbioCLIP-seq（FLAG-生物锡介导的 C罗斯-l印迹与 我免疫pFLAG-生物素标签串联纯化结合高通量测序的沉淀反应14 (图1）。通过串联纯化和严格的洗涤条件，几乎所有相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）均被去除（图2）。严格的洗涤条件还能够避免使用耗时且技术难度较高的SDS-PAGE和膜转移步骤。与eCLIP和irCLIP类似， FbioCLIP-seq 方法无需使用同位素。省略凝胶电泳和转膜步骤可避免信息丢失，保持真实的蛋白质-RNA 相互作用完整，并提高文库复杂性。此外，该标记系统的高效率使其成为缺乏高质量抗体的 RNA 结合蛋白研究的理想选择。
本文提供了哺乳动物细胞中FbioCLIP-seq 实验方案的逐步描述。简言之，首先使用 254 nm 紫外线对细胞进行交联，随后进行细胞裂解和 FLAG 免疫沉淀（FLAG-IP）。接着，通过生物素亲和捕获进一步纯化蛋白-RNA 复合物，并利用 MNase 部分消化对 RNA 进行片段化。然后，将蛋白结合的 RNA 去磷酸化，并连接 3’ 接头。在 RNA 经 PNK 磷酸化并用蛋白酶 K 消化洗脱后，添加 5’ RNA 接头。逆转录完成后，通过 PCR 扩增蛋白结合的 RNA 信号，并通过琼脂糖凝胶纯化进行富集。本研究选取两种 RNA 结合蛋白（RBP）来展示 FbioCLIP-seq 的结果。LIN28 是一种已被广泛研究的 RNA 结合蛋白，参与 microRNA 成熟、蛋白质翻译以及细胞重编程过程15,16,17。WDR43 是一种含有 WD40 结构域的蛋白，被认为在核糖体生物合成、真核转录以及胚胎干细胞多能性调控中发挥协调作用14,18。与先前报道的 LIN28 CLIP-seq 结果一致，FbioCLIP-seq 在 microRNA mir-let7g 和 mRNA 上检测到 LIN28 对“GGAG”基序的结合位点16,19（图 3）。WDR43 的 FbioCLIP-seq 实验也鉴定出其对前体 rRNA 的 5' 外部转录间隔区（5'-ETS）具有结合偏好性20（图 4）。上述结果验证了 FbioCLIP-seq 方法的可靠性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 交联仪</td><td>UVP</td><td>HL-2000 HybrilLinker</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;亲和纯化珠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG 珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素珠</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>3 x FLAG 肽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙 (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>CIP</td><td>NEB</td><td>M0290S</td><td>CIP 缓冲液包含在同一包装中。</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>凝胶纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449172</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>TAKARA</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真 2X 预混液</td><td>NEB</td><td>0492S</td><td></td></tr><tr><td>逆转录酶 (SupperScriptIII)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNA 提取试剂 (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>PNK 缓冲液包含在同一包装中。</td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶</td><td>ThermoFisher</td><td>EL0021</td><td>T4 RNA 连接酶缓冲液和 BSA 包含在同一包装中。</td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶2，截短型</td><td>NEB</td><td>M0242S</td><td>T4 RNA 连接酶缓冲液和 50% PEG 包含在同一包装中。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;mESC 培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (80%)</td><td>Gibco</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>FCS (15%)</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1%)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td></td><td></td><td>纯化的重组蛋白；10,000 倍稀释</td></tr><tr><td>NEAA (1%)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>核苷混合物 (1%)</td><td>Millipore</td><td>ES-008-D</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 (1%)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

基于flag-生物素串联纯化的交联与免疫沉淀法进行全转录组蛋白质-rna相互作用分析

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

RNA 和 RNA 结合蛋白（RBPs）调控多种生物学过程。RNA 与 RBPs 的时空分布是这些过程精细调控的基础。一种称为 CLIP-seq（交联与免疫沉淀）的策略已被开发用于捕获内源性蛋白-RNA 相互作用，其过程包括紫外交联后进行免疫沉淀。尽管传统的 CLIP-seq 方法在 RBP 研究中被广泛应用，但该方法受限于高质量抗体的可获得性、共纯化 RBP 可能带来的污染、对同位素操作的需求，以及在繁琐的实验流程中可能造成的信息丢失。本文介绍了一种改良的 CLIP-seq 方法，称为 FbioCLIP-seq，该方法采用 FLAG-生物素标签串联纯化技术。通过串联纯化和严格的洗涤条件，几乎所有的相互作用 RNA 结合蛋白均被去除，因此由这些共纯化 RBP 间接介导的 RNA 相互作用也被显著减少。FbioCLIP-seq 方法能够在无需同位素标记、无需蛋白特异性抗体、且不经过 SDS-PAGE 和膜转移步骤的情况下，高效检测直接与蛋白结合的 RNA。

图1展示了FbioCLIP-seq实验流程的示意图。与FLAG介导或链霉亲和素介导的单步亲和纯化相比，FLAG-生物素串联纯化几乎去除了所有共纯化的蛋白质，避免了间接蛋白-RNA相互作用的污染（图2）。图3和图4分别展示了LIN28和WDR43的FbioCLIP-seq代表性结果。我们利用小鼠胚胎干细胞（mESCs）进行了LIN28或WDR43的FbioCLIP-seq实验。图3A显示了LIN28和WDR43在pre-let-7g区域的FbioCLIP-seq信号轨迹图。图3B展示了pre-let-7g中已报道的GGAG基序以及FbioCLIP-seq鉴定出的交联位点。通过C...

本文介绍了一种改良的CLIP-seq方案，称为FbioCLIP-seq，通过FLAG-生物素串联纯化技术来确定哺乳动物细胞中RNA结合蛋白（RBPs）的RNA靶标。

基于FLAG-生物素串联纯化的交联与免疫沉淀法进行全转录组蛋白质-RNA相互作用分析

RNA 和 RNA 结合蛋白（RBPs）调控多种生物学过程。RNA 与 RBPs 在空间和时间上的有序分布构成了精细的……

唯有结合蛋白能够调控多种生物学过程。因此，本实验采用FLAG-生物素CLIP-seq方法，以全面分析哺乳动物细胞中RNA与RNA结合蛋白（RBP）在空间和时间上的特异性分布。该方法无需经过SDS-PAGE及膜转移步骤，即可高效检测直接与蛋白结合的RNA分子。与传统的CLIP-seq相比，该方法无需使用同位素，也不需要针对特定蛋白质的抗体。首先，将约300万个鼠胚胎干细胞接种于10厘米培养皿中，过夜培养。次日，用真空泵吸除培养基，并在室温下用2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA处理细胞2分钟。用四毫升新鲜的 MESC 培养基终止胰蛋白酶反应，并将细胞转移至15毫升离心管中。随后，在4°C条件下以300 × g离心3分钟，弃去上清液。用四毫升预冷的PBS重悬细胞，然后将其转移回10厘米培养皿中进行交联。用254纳米的紫外光照射细胞，然后将交联的细胞转移至15毫升离心管中。在4摄氏度下以300 × g离心3分钟，随后弃去上清液，并用500微升按照文稿说明配制的缓冲液A裂解细胞。将细胞转移至无RNA酶的1.5毫升离心管中，在4摄氏度下轻轻旋转孵育30至60分钟。在37摄氏度下，用30微升DNA酶1处理裂解液10分钟。然后加入4微升0.5摩尔EDTA终止反应。在4摄氏度下以12,000 × g离心20分钟，沉淀不溶物，并将上清液转移至新的预冷的1.5毫升离心管中。将细胞裂解液转移至预先平衡的FLAG磁珠中，在4摄氏度下旋转孵育2至4小时。孵育结束后，以3000 × g离心磁珠2分钟，并弃去上清液。向样品中加入500微升缓冲液A，于4摄氏度孵育5分钟，然后离心收集磁珠并弃去上清液。用缓冲液A重复洗涤一次，随后用预冷的缓冲液B洗涤两次。若使用三倍X FLAG肽进行洗脱，请按照文稿中所述配制洗脱液，并将FLAG磁珠离心沉淀。用窄头移液枪头吸除上清液，每份样品中加入200微升三倍X FLAG洗脱液。将样品在4摄氏度下轻轻旋转孵育30分钟。然后在3000 × g下离心2分钟使磁珠沉淀。将上清液转移至新的离心管中，并重复洗脱两次。保留5%的洗脱液用于Western blot分析或银染，以检测FLAG免疫沉淀的效率。将收集的洗脱液转移至预先准备好的链霉亲和素磁珠中，在4°C轻轻旋转孵育1至3小时或过夜。然后，将磁珠置于磁力架上收集，并移除上清液。用500 µL缓冲液C轻轻旋转洗涤磁珠两次，每次洗涤5分钟。接着，用500 µL缓冲液D洗涤磁珠两次，再用500 µL冰冻的PNK缓冲液洗涤两次，每次洗涤均需在磁力架上收集磁珠并移除上清液。进行部分RNA消化时，向每个样品中加入100微升MNA溶液，在37摄氏度下使用带有热混仪的涡旋振荡器反应10分钟。将样品置于磁力架上30秒以收集磁珠，并移除上清液。随后根据论文中的说明，依次使用PNK-EDTA缓冲液、缓冲液C以及PNK缓冲液对磁珠进行洗涤。将磁珠置于磁力架上收集并弃去缓冲液。随后加入CIP反应混合液，使用温控混匀仪在37摄氏度下涡旋振荡磁珠10分钟。用500微升预冷的PNK EDTA缓冲液快速洗涤磁珠两次，再用500微升预冷的PNK缓冲液洗涤两次。洗涤后，向磁珠中加入 40 微升 3' 连接子连接反应混合液，在 16 摄氏度下使用热混仪涡旋振荡反应 3 小时或过夜。连接子与目标片段的有效连接对本实验至关重要。连接过程中需定期检查反应管，确保磁珠未发生沉淀。孵育后，用 PNK EDTA 缓冲液和 PNK 缓冲液重复洗涤，向珠粒中加入 40 微升混合的 PNK 溶液，在 37 摄氏度下使用热混仪涡旋振荡 10 分钟。用 PNK EDTA 缓冲液和 PNK 缓冲液洗涤珠粒，然后按照文本稿件中所述进行 RNA 分离。与 FLAG 介导或链霉亲和素介导的单步亲和纯化相比，FLAG-生物素串联纯化几乎去除了所有核心纯化的蛋白质，避免了间接蛋白质-RNA 相互作用的污染。针对LIN28和WDR43，使用小鼠胚胎干细胞进行了Fbio CLIP-seq实验。总共分别获得了约770万和220万条唯一的测序读段。通过比较轨迹图，可见两者在RN45 pre-rRNA位点的结合模式存在差异。通过LIN28、Fbio CLIP-seq鉴定出pre-let7-g RNA上GGA G基序的交联位点。此外，确定了结合位点中富集的RNA基序以及不同类型突变中核苷酸突变的比例，表明LIN28倾向于结合基因核苷酸。在晚上10:00，该实验方案中，确认免疫沉淀的效率非常重要，以确保仅目标蛋白复合物被成功纯化。

transcriptome-wide-profiling-protein-rna-interactions-cross-linking

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

通过旗-生物素串联纯化通过交叉链接和免疫沉淀对蛋白质-RNA相互作用进行转录组-全过程分析

RNA转录本受到多种反式作用的RNA结合蛋白（RBPs）介导的广泛转录后调控。本文介绍一种可普遍应用的方法，用于精确且在全转录组范围内鉴定RBPs的RNA结合位点。...

PAR-CliP——一种用于鉴定RNA结合蛋白转录组范围结合位点的方法

RNA结合蛋白在转录本上的空间排布是转录后调控的关键决定因素。因此，我们开发了单核苷酸分辨率的紫外交联免疫沉淀技术（iCLIP），可实现RNA结合蛋白结合位点的精确全基因组定位。...

iCLIP——全转录组范围内单核苷酸分辨率的蛋白质-RNA 相互作用图谱绘制

我们已建立一种利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统纯化共调节相互作用蛋白的方法。...

一种用于通过LC-MS/MS分析高通量鉴定与核辅因子相互作用蛋白的蛋白质制备方法

此处，我们详细说明该方法 S测序 P补骨脂素交联， L研究，并 S选出的 HSPLASH（通过测序进行RNA相互作用分析），可实现全基因组范围内分子内和分子间RNA-RNA相互作用的定位 体内SPLASH 可用于研究包括酵母、细菌和人类在内的生物体的 RNA...

利用生物素标记的补骨脂素全局绘制RNA-RNA相互作用

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

本文介绍了一种应用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略的详细方案，用于鉴定与编码RNA和非编码RNA结合的蛋白质。...

利用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略捕获与鉴定RNA结合蛋白

本文介绍一种从哺乳动物细胞中富集内源性RNA结合位点或RNA:蛋白质（RNP）复合物的"足迹”的实验方案。该方法包括对RNP亚基进行两次免疫沉淀，因此被称为串联RNA免疫沉淀（RIPiT）。...

通过串联RNA免疫沉淀测序（RIPiT-Seq）鉴定RNA:蛋白质复合物的足迹

动力学交联与cDNA分析是一种能够在活细胞中以高时间分辨率研究蛋白质-RNA相互作用动态过程的方法。本文详细描述了该实验方案，包括酵母细胞培养、紫外交联、细胞收集、蛋白质纯化以及下一代测序文库制备等步骤。...

使用&#967;CRAC技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-RNA相互作用动态

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、定位、折叠和组装过程中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析法，这是一种用于在模式真核生物Saccharomyces...

通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

此处，我们介绍一种经过优化的 体外 利用人源细胞总蛋白提取物、包被生物素化RNA的链霉亲和素磁珠及质谱分析，鉴定、定量和验证特定RNA序列的蛋白互作分子的方法。...

一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

学习Fbio CLIP-seq方法，利用FLAG-生物素串联纯化技术鉴定哺乳动物细胞中RNA结合蛋白的RNA靶标。该方法无需同位素和特异性抗体，可高效检测直接结合的蛋白-RNA相互作用。

基于FLAG-生物素串联纯化的交联与免疫沉淀法进行全转录组蛋白质-RNA相互作用分析

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