通过旗-生物素串联纯化通过交叉链接和免疫沉淀对蛋白质-RNA相互作用进行转录组-全过程分析
May 18th, 2020
在这里，我们提出了一个改进的 CLIP-seq 协议， 称为 FbioCLIP-seq 与 FLAG 生物素串联纯化，以确定哺乳动物细胞中RNA结合蛋白（RBPs）的RNA靶点。
只有和只有结合的蛋白质控制多个生物过程。这种 FLAG-Biotin CLIP-seq 方法，因此在全球范围内描述哺乳动物细胞中RNA和RBB的特殊和时间排列。这种方法允许有效地检测直接蛋白结合的RNA，无需SDS-PAGE和膜转移程序。
与传统的 CLIP-seq 相比，它是无同位素的，不需要蛋白质特异性抗体。首先将大约300万只小鼠胚胎STEM细胞镀在10厘米的盘子里，并在一夜之间孵育。第二天，用真空去除介质，在室温下用两毫升0.25%的三丁辛EDTA治疗细胞两分钟。
用四毫升新鲜 MESC 介质淬火，将细胞转移到 15 毫升离心管中。然后，在摄氏4度下将它们在300倍G下离心3分钟，然后取出上一代。将细胞悬浮在四毫升冷PBS中，并转移回10厘米的板进行交叉连接。
用254纳米的紫外线辐射细胞，然后将交接的细胞转移到15毫升的管中。在4摄氏度下以300倍G旋转，3分钟，然后取出上流水线，然后根据手稿指示用500微升缓冲器 A来裂除细胞。将细胞转移到无RNAse的1.5毫升管中，并在4摄氏度下用温和旋转孵育30至60分钟。
在37摄氏度下用30微升DNAse 1处理酸盐10分钟。然后，通过添加四个微升 0.5 摩尔 EDTA 停止反应。在4摄氏度下以12，000次G离心，将不溶性颗粒旋转20分钟，然后将上分液转移到新的预冷却1.5毫升管中。
将细胞酸盐转移到预平衡的 FLAG 珠，并在四摄氏度下孵育样品，同时旋转两到四个小时。孵育后，将珠子在3000倍G下离心两分钟，取出上经剂。在样品中加入500微升缓冲液 A，在4摄氏度下孵育5分钟，然后旋转珠子并去除上流液。
使用缓冲区 A 重复洗涤，然后用预冷藏缓冲器 B.To 洗涤，用三个 X FLAG 肽洗涤，按照文本手稿中所述准备洗脱溶液，然后旋转 FLAG 珠。用狭窄的末端移液器尖端去除上流水器，并将三个 X FLAG 洗脱溶液的 200 微升添加到每个样品中。在4摄氏度下用温和的旋转孵育样品30分钟。
然后在3000次G.将超生转移到一根新鲜管子上，然后重复两次洗脱珠，旋转两分钟。保存 5% 的 Eluent 用于西印迹分析或银染色，以检查 FLAG 免疫沉淀的效率。将拉拔的埃卢子转移到准备好的链球菌珠上，并在四摄氏度下轻轻旋转样品一到三个小时或过夜。
然后，收集磁性支架上的珠子并取出上经剂。用 500 微升缓冲器 C 洗涤珠子两次，每次洗涤时旋转五分钟。接下来，用500微升缓冲器D清洗珠子两次，用500微升的冰冷PNK缓冲液清洗珠子，收集磁支架上的珠子，在洗涤之间去除上清液。
为了进行部分RNA消化，将100微升的MNA溶液添加到每个样品中，用热混合器将漩涡设置为37摄氏度，使用热混合器10分钟。用磁性支架收集磁珠 30 秒，然后取出上经剂。然后，根据手稿方向用 PNK-EDTA 缓冲器、缓冲区 C 和 PNK 缓冲器清洗它们。
用磁性支架收集磁珠并取出缓冲液。然后，加入CIP反应混合物，用热混合器在37摄氏度下旋转珠子10分钟。使用 500 微升的冰冷 PNK EDTA 缓冲液快速清洗珠子两次，然后用 500 微升的冰冷 PNK 缓冲液进行两次清洗。
洗涤后，在珠子上加入40个三个主要连接器连接混合的微升，并在16摄氏度下用热混合器旋转3小时或过夜。链接器与盟友的高效连接对于这个实验至关重要。偶尔检查反应管，以确保这些在结扎过程中不会沉淀。
孵育后，用PNK EDTA和PNK缓冲液重复洗涤，将40微升PNK混合到珠子中，用热混合器在37摄氏度下旋转10分钟。使用 PNK EDTA 和 PNK 缓冲液清洗珠子，然后按照文本手稿中所述进行 RNA 隔离。与 FLAG 中继或链球菌素中继亲和力纯化相比，FLAG-Biotin 串联纯化几乎去除所有核心纯化蛋白质，避免了间接蛋白RNA相互作用的污染。
LIN28 和 WDR43， Fbio CLIP-seq 使用小鼠胚胎 STEM 细胞进行。总共为LIN28和WDR43检索了大约770万和220万的唯一读取。轨道视图的比较显示了 RN45 前 rRNA 位点中不同的结合模式。
由 LIN28 、Fbio CLIP-seq 或识别的 GGA G 主题前 7g RNA 的交叉链接站点。此外，在结合位点中丰富的RNA图案，以及不同类型突变中突变核苷酸的百分比。显示LIN28倾向于与基因核苷酸结合。
那么，在10日下午，这个协议，重要的是要确认免疫沉淀的效率，以确保蛋白质只有复合物被成功纯化。
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概述
本文介绍了一种修改的CLIP-seq协议，称为Fbio CLIP-seq，它利用FLAG-生物素串联纯化来识别哺乳动物细胞中RNA结合蛋白（RBPs）的RNA靶标。该方法允许高效检测直接蛋白质结合的RNA，而无需SDS-PAGE和膜转移程序。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- RNA结合蛋白（RBPs）在调节各种生物过程中起着关键作用。
- 传统的CLIP-seq方法通常需要同位素和特定的抗体。
- Fbio CLIP-seq旨在简化RBPs及其RNA靶标的剖析过程。
- 该方法特别适用于研究哺乳动物细胞。
研究目的
- 开发一种更高效的方法来识别RBPs的RNA靶标。
- 消除对复杂程序如SDS-PAGE的需求。
- 提供一个可以轻松应用于哺乳动物细胞研究的协议。
所使用的方法
- 将小鼠胚胎干细胞接种在10厘米的培养板中。
- 治疗前的细胞过夜孵育。
- 用胰蛋白酶EDTA处理以分离细胞。
- 利用FLAG-生物素串联纯化进行RNA分离。
主要结果
- Fbio CLIP-seq方法成功地剖析了RBPs及其RNA靶标。
- 显示了检测蛋白质结合RNA的效率。
- 证明该方法无同位素且无抗体。
- 提供了一种研究RNA-蛋白质相互作用的简化方法。
结论
- Fbio CLIP-seq是研究哺乳动物细胞中RBPs的研究人员的有价值工具。
- 该方法提高了在无传统限制的情况下剖析RNA相互作用的能力。
- 未来的应用可能扩展到各种生物学背景和细胞类型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct mapping of protein-RNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery pipelines. The Fbio CLIP-seq method enables transcriptome-wide identification of direct RNA-binding protein targets without reliance on isotopes or protein-specific antibodies, reducing confounding from indirect interactions. This capability enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in RNA-targeted drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables transcriptome-wide interrogation of direct protein-RNA interactions for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by eliminating indirect RNA-binding protein contaminants.
- Supports predictive confidence in target engagement and pathway mapping.
- Facilitates triage of RNA-binding proteins based on direct interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, antibody-free workflow for preparing validated protein-RNA complexes.
- Delivers quantitative readouts of direct binding events suitable for downstream screening.
- Improves reproducibility and scalability by removing isotope and antibody dependencies.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by profiling endogenous interactions in mammalian cells.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by mapping direct RNA targets.
- De-risks translational biomarker selection through high-specificity interaction data.
- Facilitates risk-adjusted advancement of RNA-targeted therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
The Fbio CLIP-seq method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing direct evidence of protein-RNA interactions for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping direct RNA-binding protein targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound screening and assay standardization.
- Analytics: Enables transcriptome-wide comparison of binding patterns and motif enrichment.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by profiling interactions in disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, antibody-independent platform for diverse RNA-binding protein studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through antibody-free, isotope-free, and scalable purification steps.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA-protein biochemistry and cross-linking techniques.
- Needs access to UV cross-linking, FLAG and streptavidin bead purification, and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various mammalian cell models with protocol optimization.
- Potential limitations include requirement for tagged protein expression and careful validation of purification efficiency.
