基于FLAG-生物素串联纯化的交联与免疫沉淀法进行全转录组蛋白质-RNA相互作用分析

唯有结合蛋白能够调控多种生物学过程。因此，本实验采用FLAG-生物素CLIP-seq方法，以全面分析哺乳动物细胞中RNA与RNA结合蛋白（RBP）在空间和时间上的特异性分布。该方法无需经过SDS-PAGE及膜转移步骤，即可高效检测直接与蛋白结合的RNA分子。

与传统的CLIP-seq相比，该方法无需使用同位素，也不需要针对特定蛋白质的抗体。首先，将约300万个鼠胚胎干细胞接种于10厘米培养皿中，过夜培养。次日，用真空泵吸除培养基，并在室温下用2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA处理细胞2分钟。

用四毫升新鲜的 MESC 培养基终止胰蛋白酶反应，并将细胞转移至15毫升离心管中。随后，在4°C条件下以300 × g离心3分钟，弃去上清液。用四毫升预冷的PBS重悬细胞，然后将其转移回10厘米培养皿中进行交联。

用254纳米的紫外光照射细胞，然后将交联的细胞转移至15毫升离心管中。在4摄氏度下以300 × g离心3分钟，随后弃去上清液，并用500微升按照文稿说明配制的缓冲液A裂解细胞。将细胞转移至无RNA酶的1.5毫升离心管中，在4摄氏度下轻轻旋转孵育30至60分钟。

在37摄氏度下，用30微升DNA酶1处理裂解液10分钟。然后加入4微升0.5摩尔EDTA终止反应。在4摄氏度下以12,000 × g离心20分钟，沉淀不溶物，并将上清液转移至新的预冷的1.5毫升离心管中。

将细胞裂解液转移至预先平衡的FLAG磁珠中，在4摄氏度下旋转孵育2至4小时。孵育结束后，以3000 × g离心磁珠2分钟，并弃去上清液。向样品中加入500微升缓冲液A，于4摄氏度孵育5分钟，然后离心收集磁珠并弃去上清液。

用缓冲液A重复洗涤一次，随后用预冷的缓冲液B洗涤两次。若使用三倍X FLAG肽进行洗脱，请按照文稿中所述配制洗脱液，并将FLAG磁珠离心沉淀。用窄头移液枪头吸除上清液，每份样品中加入200微升三倍X FLAG洗脱液。将样品在4摄氏度下轻轻旋转孵育30分钟。

然后在3000 × g下离心2分钟使磁珠沉淀。将上清液转移至新的离心管中，并重复洗脱两次。保留5%的洗脱液用于Western blot分析或银染，以检测FLAG免疫沉淀的效率。将收集的洗脱液转移至预先准备好的链霉亲和素磁珠中，在4°C轻轻旋转孵育1至3小时或过夜。

然后，将磁珠置于磁力架上收集，并移除上清液。用500 µL缓冲液C轻轻旋转洗涤磁珠两次，每次洗涤5分钟。接着，用500 µL缓冲液D洗涤磁珠两次，再用500 µL冰冻的PNK缓冲液洗涤两次，每次洗涤均需在磁力架上收集磁珠并移除上清液。

进行部分RNA消化时，向每个样品中加入100微升MNA溶液，在37摄氏度下使用带有热混仪的涡旋振荡器反应10分钟。将样品置于磁力架上30秒以收集磁珠，并移除上清液。随后根据论文中的说明，依次使用PNK-EDTA缓冲液、缓冲液C以及PNK缓冲液对磁珠进行洗涤。

将磁珠置于磁力架上收集并弃去缓冲液。随后加入CIP反应混合液，使用温控混匀仪在37摄氏度下涡旋振荡磁珠10分钟。用500微升预冷的PNK EDTA缓冲液快速洗涤磁珠两次，再用500微升预冷的PNK缓冲液洗涤两次。

洗涤后，向磁珠中加入 40 微升 3' 连接子连接反应混合液，在 16 摄氏度下使用热混仪涡旋振荡反应 3 小时或过夜。连接子与目标片段的有效连接对本实验至关重要。连接过程中需定期检查反应管，确保磁珠未发生沉淀。

孵育后，用 PNK EDTA 缓冲液和 PNK 缓冲液重复洗涤，向珠粒中加入 40 微升混合的 PNK 溶液，在 37 摄氏度下使用热混仪涡旋振荡 10 分钟。用 PNK EDTA 缓冲液和 PNK 缓冲液洗涤珠粒，然后按照文本稿件中所述进行 RNA 分离。与 FLAG 介导或链霉亲和素介导的单步亲和纯化相比，FLAG-生物素串联纯化几乎去除了所有核心纯化的蛋白质，避免了间接蛋白质-RNA 相互作用的污染。

针对LIN28和WDR43，使用小鼠胚胎干细胞进行了Fbio CLIP-seq实验。总共分别获得了约770万和220万条唯一的测序读段。通过比较轨迹图，可见两者在RN45 pre-rRNA位点的结合模式存在差异。

通过LIN28、Fbio CLIP-seq鉴定出pre-let7-g RNA上GGA G基序的交联位点。此外，确定了结合位点中富集的RNA基序以及不同类型突变中核苷酸突变的比例，表明LIN28倾向于结合基因核苷酸。

在晚上10:00，该实验方案中，确认免疫沉淀的效率非常重要，以确保仅目标蛋白复合物被成功纯化。