Name: 免疫荧光和定量PCR对白蝇组织中白蝇病毒的定位和定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学习使用免疫荧光和定量PCR技术对白粉虱组织中的双生病毒进行定位和定量分析。该方法可分离中肠、唾液腺和卵巢等组织，实现病毒与载体蛋白的共定位，为理解病毒-媒介互作及制定防控策略提供重要工具。

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本工作得到国家重点研发计划（项目编号：2017YFD0200600）、中国农业研究体系专项资金（项目编号：CARS-23-D07）和比尔 &amp;#38; 梅琳达·盖茨基金会（投资编号 OPP1149777）。我们感谢吴建祥教授提供TYLCV CP抗体。

1. 粉虱、病毒、植物与病毒的获取
<ol>
	<li>在温室中，于26 ± 1 °C、14小时光照:10小时黑暗光周期、相对湿度60 ± 10%的条件下，在防虫网笼内的棉花（Gossypium hirsutum 品种 Zhemian 1793）上饲养烟粉虱（MEAM1）。</li>
	<li>基于烟粉虱线粒体细胞色素氧化酶I基因进行常规PCR，以确定烟粉虱种群的纯度。
	<ol>
		<li>采集20头成虫烟粉虱，分别转移至含有30 μL裂解缓冲液（10 mM Tris，pH = 8.4，50 mM KCl，0.45% [wt/vol] Tween-20，0.2% [wt/vol] 明胶，0.45% [vol/vol] Nonidet P 40，60 g/mL 蛋白酶K）的PCR管中。</li>
		<li>向每根PCR管中加入5–7颗陶瓷珠（直径2 mm），研磨样品以实现组织裂解。</li>
		<li>将所有样品在65 °C孵育1小时，随后在100 °C孵育10分钟，短暂离心。以上清液作为PCR扩增的模板。 
		注：如有需要，可适当延长65 °C的孵育时间。</li>
		<li>按如下体系配制PCR反应液：1 U Taq DNA聚合酶，2 µL 10x缓冲液（含Mg2+），1.6 µL dNTP混合物（2.5 mM），每种引物各0.5 µL（10 μM），2 µL烟粉虱组织裂解液上清，双蒸水补足至每反应总体积20 µL。上游引物序列为5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'，下游引物序列为5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'。 
		注：应设置阴性对照（以无核酸酶水替代DNA）和阳性对照（使用已验证的MEAM1烟粉虱DNA）。</li>
		<li>PCR扩增程序如下：95 °C预变性3分钟；随后进行35个循环，每个循环包括95 °C变性30秒，50–55 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟；最后72 °C延伸10分钟。</li>
		<li>使用限制性内切酶Taq I消化扩增产物。配制消化体系：0.1 µL（1 U）酶，1 μL 10x Taq I缓冲液，1 μL BSA，5 μL扩增产物，双蒸水补足至总体积10 μL。在PCR仪中65 °C孵育1小时。</li>
		<li>取5–7 µL各消化产物与DNA Marker（100–2,000 bp）加入1%琼脂糖凝胶的加样孔中，进行琼脂糖凝胶电泳。在凝胶成像系统中使用紫外光观察凝胶红染色后的DNA条带大小。将消化产物的条带大小与阳性对照比较，以确定烟粉虱种群的纯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的侵染性克隆（GenBank登录号AM282874.1）（pBINPLUS-SH2-1.4A）通过农杆菌介导法接种于3–4片真叶期的番茄植株（Solanum lycopersicum L. 品种 Hezuo 903）。
	<ol>
		<li>取单菌落接种于含卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）的10 mL LB培养基中，28 °C、200 rpm振荡培养至OD600约为1.5。</li>
		<li>在4,000 x g条件下离心10分钟收集农杆菌，弃去上清液。</li>
		<li>用10 mL浸润缓冲液（含200 μM乙酰丁香酮、10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）、10 mM MgCl2）重悬菌体沉淀，室温孵育1–2小时。</li>
		<li>使用步骤1.3.3所得菌液，用1 mL无针注射器浸润2–3片植株叶片。将植株置于26 ± 1 °C温室中培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>约一个月后，进行目视检查，选择表现出叶片黄化卷曲和矮化症状的植株。</li>
	<li>将非带毒烟粉虱成虫转移至TYLCV感染的番茄植株上，持续48小时以获取病毒。</li>
</ol>
2. 雌性粉虱中肠、原生唾液腺（PSG）、卵巢及血淋巴的解剖与采集
<ol>
	<li>用吸虫器采集粉虱，然后将其置于冰上使其进入昏迷状态。在载玻片上加入1×PBS（磷酸盐缓冲液），将粉虱放入1×PBS缓冲液中，于体视显微镜下进行解剖。
	<ol>
		<li>进行中肠解剖时，用细针（直径0.25 mm）刺破粉虱腹部，拉出中肠。将中肠转移至干净的1×PBS中。</li>
		<li>进行咽下唾液腺（PSG）解剖时，从背面在头部附近的胸部位置刺破粉虱体壁。接着，用一根针固定胸部，再用另一根针轻轻抖动粉虱，直至两个唾液腺与身体分离。然后将咽下唾液腺转移至干净的1×PBS中。</li>
		<li>进行卵巢解剖时，彻底刺破粉虱腹部，用针将卵巢与其他组织分离，随后通过移液去除多余组织。</li>
		<li>收集血淋巴时，在载玻片上加入10 μL 1×PBS缓冲液，将一只粉虱放入缓冲液中。用细针在腹部轻轻刺破一个小孔，并轻微挤压腹部，使血淋巴释放到缓冲液中。收集8 μL液体作为血淋巴样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过免疫荧光法定位烟粉虱中肠、主唾液腺及卵巢中的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）
注意：此处以 TYLCV 在中肠中的定位步骤为例进行说明。该方法也可用于唾液腺和卵巢。
<ol>
	<li>在 TBS 缓冲液（10 mM Tris-HCl，150 mM 氯化钠，pH = 7.5）中解剖中肠，操作如步骤 2.2.1 所述。收集 15–20 个烟粉虱中肠，转移至直径为 3.5 cm 的玻璃培养皿中，随后去除多余的 TBS 缓冲液。</li>
	<li>加入1 mL 4%多聚甲醛，在室温下固定中肠2小时，随后去除固定液。用TBS缓冲液缓慢吹打洗涤中肠3次，每次2分钟。</li>
	<li>在1 mL 0.5% Triton X-100中孵育中肠30分钟以进行通透处理。随后移除通透溶液，用TBST（1×TBS含0.05% Tween 20）洗涤中肠3次，每次洗涤方法参照步骤3.2。</li>
	<li>加入1 mL 1% BSA（用TBST配制的牛血清白蛋白）以封闭中肠。在室温下封闭2 h，随后移除封闭液，用TBST洗涤中肠3次。</li>
	<li>用 TBST 将一抗（针对 TYLCV 衣壳蛋白的 MAb 1C4）按 1:400 稀释24 将溶液加入培养皿中，浸没中肠。4 °C 避光孵育过夜。弃去一抗溶液，用 TBST 洗涤 3 次。</li>
	<li>用TBST以1:400稀释二抗（抗小鼠），将溶液加入培养皿中以浸没中肠。于室温避光孵育2小时。弃去二抗溶液，用TBST洗涤中肠3次。</li>
	<li>将中肠转移至洁净的显微镜载玻片上。尽可能吸除TBST。加入1滴DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）以染色细胞核，随后加盖盖玻片并用指甲油封固。在共聚焦显微镜下观察。</li>
</ol>
4. 利用qPCR定量检测烟粉虱中肠、主唾液腺、血淋巴和卵巢中的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）
<ol>
	<li>按照上述方法在1×PBS中解剖烟粉虱的中肠、PSG（咽下腺）、血淋巴和卵巢。</li>
	<li>提取中肠、PSG、血淋巴和卵巢的DNA。
	<ol>
		<li>解剖后，用洁净的1×PBS缓冲液清洗中肠、PSG和卵巢2–3次。</li>
		<li>将20个中肠或20个PSG收集至5 μL 1×PBS中，然后转移至25 μL裂解液中；每个卵巢分别用5 μL 1×PBS收集后，再各自转移至25 μL裂解液中。</li>
		<li>按照步骤1.2.2所述方法研磨中肠、PSG和卵巢样品。</li>
		<li>用1×PBS收集8 μL血淋巴至PCR管中，然后加入10 μL裂解液，充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照1.2.3所述方法从所有样品中提取DNA。</li>
	<li>分别配制TYLCV和内参基因（β-actin）的两份独立qPCR预混液（每份18 μL）：每反应包括10 μL SYBR Green预混液、0.8 μL正向引物（10 μM）、0.8 μL反向引物（10 μM）和6.4 μL双蒸水。TYLCV的正向引物序列为5′-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3′，反向引物序列为5′-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3′；β-actin的正向引物序列为5′-TCTTCCAGCCATCCTTCTTG-3′，反向引物序列为5′-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3′。</li>
	<li>将18 µL预混液分装至qPCR条形管或96孔板的各孔中，然后向每孔加入2 µL DNA样品。每个样本至少进行三次技术重复和三次生物学重复。 
	注意：步骤4.5应在冰上操作。</li>
	<li>盖紧qPCR管或使用粘性封板膜密封96孔板。</li>
	<li>短暂离心，使液体沉降至qPCR管或96孔板孔底。</li>
	<li>将qPCR管或板放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增。
	<ol>
		<li>采用以下扩增程序：95 °C预变性30 s，随后进行40个循环（95 °C变性5 s，60 °C退火与延伸34 s），再于95 °C维持15 s，最后进行熔解曲线分析（60 °C升至95 °C，每15 s升高0.5 °C）。</li>
		<li>选择SYBR作为荧光染料，样本类型设为未知（unknown）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将定量数据导出为电子表格格式，并采用2−ΔΔCT法分析病毒DNA的相对含量28。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种通过免疫荧光和定量PCR对双生病毒在其烟粉虱媒介体内组织进行定位与定量的实验方案。解剖是实现病毒在烟粉虱组织中定位与定量的第一步。烟粉虱体长约1毫米，其组织极为微小，解剖难度较大。此外，各组织之间存在较强的连接。例如，卵巢与含菌细胞紧密相连，难以分离。针对不同组织的结构特征与位置分布，本文介绍了多种解剖方法。然而，要快速而准确地完成这些组织的解剖，需要大量的实践操作。此外，最好使用新鲜的烟粉虱，因为死亡个体将增加解剖难度。同时，在解剖完成后，必须对组织进行清洗，以避免污染。
免疫荧光技术基于特异性抗体的使用。每种抗体的合适工作浓度在成像中非常重要，因为抗体浓度过高会降低信噪比，而浓度过低则可能无法提供足够的信号。本实验中，一抗和二抗均采用1:400的稀释比例。这些抗体应分装成小份保存于-20 °C，以避免反复冻融。抗体稀释液应在使用前新鲜配制。当本方案用于共定位病毒与烟粉虱蛋白时，针对病毒蛋白和烟粉虱蛋白的一抗必须由不同物种的动物产生。此外，应谨慎选择二抗所偶联的荧光染料，以防止不同检测通道之间的串色。另外，由于烟粉虱组织较小，所有洗涤步骤均应在显微镜下进行，以避免样...

近几十年来，双生病毒科（Geminiviridae）双生病毒属（Begomovirus）的病毒已对全球多种蔬菜、纤维作物和观赏植物的生产造成严重危害1。双生病毒以持久性方式由烟粉虱（Bemisia tabaci，半翅目：粉虱科）传播，而烟粉虱是一个包含35种以上隐存种的复合种2,3。双生病毒可能直接或间接影响烟粉虱的生理和行为，例如繁殖力4、寿命4以及寄主选择偏好5,6。此外，即使在相同的实验条件下，特定双生病毒种类/株系对不同烟粉虱隐存种的传播效率也存在差异7,8,9,10，表明双生病毒与烟粉虱之间存在复杂的相互作用。为了更深入理解烟粉虱与双生病毒相互作用的机制，对病毒在烟粉虱组织中的定位与定量至关重要。
番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）是一种双生病毒，最初在以色列被报道，但如今已在全球范围内对番茄生产造成严重危害11,12。由于其重要的经济影响，TYLCV 是研究最为深入的双生病毒之一13。与其他单组分双生病毒类似，TYLCV 是一种单链环状 DNA 病毒，基因组大小约为 2,800 个核苷酸14。尽管尚存争议，但已有多种证据支持 TYLCV 可在烟粉虱体内复制15,16,17。此外，已有研究报道了 TYLCV 病毒粒子与烟粉虱蛋白之间的相互作用6,18,19,20。在病毒传播过程中，烟粉虱通过取食感染病毒的植株获得 TYLCV，病毒粒子经食道进入食管，穿过中肠壁进入血淋巴，随后转移至主唾液腺（PSGs）。最终，病毒粒子随唾液经唾液导管被排入植物韧皮部21。此外，多项研究表明，TYLCV 能够通过卵传播，由雌性烟粉虱传给其后代22,23。换句话说，为了实现有效的传播，病毒必须克服烟粉虱体内的细胞屏障，从一种组织转移到另一种组织。在穿越这些屏障的过程中，烟粉虱蛋白与病毒蛋白之间可能发生相互作用，这可能决定了病毒传播的效率。
免疫荧光是一种常用于蛋白质分布分析的技术。抗体与其抗原结合的特异性构成了免疫荧光技术的基础。由于番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）具有重要的经济意义，已针对其衣壳蛋白开发了单克隆抗体，从而为病毒的定位提供了高灵敏度的方法24。定量PCR（qPCR）能够对核酸进行灵敏且特异的定量。该技术通常基于水解探针（如TaqMan）或荧光染料（如SYBR Green）检测。对于基于水解探针的qPCR，需要使用特异性探针，从而增加了成本。而基于荧光染料的qPCR则更为简便且经济，因为无需使用标记的扩增子特异性杂交探针25。迄今为止，已有若干研究结合免疫荧光和qPCR以及其他方法，用于探究复杂的双生病毒-烟粉虱相互作用。例如，Pan等人对烟粉虱组织中的病毒进行了qPCR和免疫荧光分析，发现AsiaII 1和中东-南亚1型（MEAM1）两种烟粉虱在传播烟草卷叶病毒（TbCSV）能力上的差异，是由于该病毒能够有效穿过AsiaII 1的中肠壁，而无法穿过MEAM1的中肠壁8。类似地，尽管地中海系（MED）烟粉虱能够有效传播TYLCV，却无法传播番茄黄化曲叶中国病毒（TYLCCNV）。通过免疫荧光检测病毒在唾液腺（PSGs）中的分布，研究发现TYLCCNV难以穿过MED烟粉虱的唾液腺26。在烟粉虱中肠中，TYLCV衣壳蛋白（CP）与自噬标志蛋白ATG8-II的免疫荧光共定位结果表明，自噬在抑制TYLCV感染烟粉虱的过程中起着关键作用27。
本文以番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）为例，介绍了一种利用免疫荧光技术对双生病毒在烟粉虱中肠、唾液腺（PSG）及卵巢中进行定位的实验方案。该技术包括组织解剖、固定，以及与一抗和荧光标记的二抗孵育等步骤。随后可在共聚焦显微镜下观察荧光信号，从而确定病毒蛋白在烟粉虱组织中的分布位置。更重要的是，本方案可用于实现双生病毒蛋白与烟粉虱自身蛋白的共定位分析。此外，我们还介绍了一种基于SYBR Green的qPCR方法，用于定量检测烟粉虱中肠、唾液腺、血淋巴及卵巢中的TYLCV含量，该方法可用于比较不同烟粉虱组织样本中病毒的相对丰度。

<table><tbody><tr><td>4% 甲醛</td><td>MultiSciences</td><td>F0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯并咪唑酮&amp;eacute;尼立哚（DAPI）</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>MultiSciences</td><td>A3828</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>伯乐（Bio-RAD）</td><td>185-5201</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>蔡司</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549-山羊抗小鼠</td><td>Earthox</td><td>E032310-02</td><td>二抗</td></tr><tr><td>单克隆抗体（MAb 1C4）</td><td></td><td></td><td>一抗</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sangon Biotech</td><td>B548119-0500</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td><td>TaKaRa</td><td>RR820A</td><td>qPCR预混液</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A41182</td><td></td></tr><tr><td>Tissuelyzer</td><td>上海精欣</td><td>Tissuelyser-48</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>BBI生命科学</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BBI生命科学</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

通过免疫荧光和定量pcr对烟粉虱组织中双生病毒的定位与定量

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

双生病毒属（Begomovirus，双生病毒科 Geminiviridae）由烟粉虱复合种（Bemisia tabaci）以持久性循环方式传播。鉴于双生病毒对全球农作物生产造成的严重危害，深入理解双生病毒与其烟粉虱传播介体之间的相互作用至关重要。为此，对病毒在介体组织中的定位与定量分析尤为关键。本文以番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）为例，详细介绍了一种利用免疫荧光技术对双生病毒在烟粉虱中肠、主唾液腺及卵巢中进行定位的实验方案。该方法基于特异性针对病毒外壳蛋白的一抗、荧光染料标记的二抗以及共聚焦显微镜检测。该方案还可用于双生病毒蛋白与烟粉虱蛋白的共定位分析。此外，本文进一步描述了一种通过定量PCR（qPCR）对TYLCV在烟粉虱中肠、主唾液腺、血淋巴及卵巢中进行定量的实验流程。利用针对TYLCV特异性设计的引物，该定量方案可实现对烟粉虱不同组织中TYLCV含量的比较。所描述的定量方法亦可用于检测烟粉虱个体或感染病毒的植物体内双生病毒的含量。这些实验方案可用于分析双生病毒在烟粉虱体内的循环路径，或作为其他研究烟粉虱-双生病毒互作方法的补充手段。

B. tabaci 复合种中的 MEAM1 烟粉虱和番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）被用作示例，以描述本研究中的实验流程。本文所述免疫荧光检测与病毒定量方法的整体流程见图1。图2展示了TYLCV免疫荧光检测与DAPI染色在烟粉虱咽下腺（PSGs）、中肠和卵巢中的代表性结果，表明TYLCV在咽下腺和中肠中积累较多，而在卵巢中积累较少。图3展示了烟粉虱在取食感染TYLCV的番茄植株24、48和72小时后，其咽下腺、中肠、血淋巴和卵巢中病毒的相对含量，结果显示随着获毒取食时间的延长，病毒在不同组织中的含量逐渐增加。
<img alt="粉虱解剖；免疫染色流程图；qPCR 设置；DNA 分析；显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60731/60731fig01.jpg" da...

我们描述了一种用于定位和定量昆虫组织中双生病毒的免疫荧光与定量PCR方法。该免疫荧光方案可用于病毒蛋白与媒介蛋白的共定位分析。定量PCR方案可进一步扩展用于整只烟粉虱个体以及病毒感染植物中病毒的定量分析。

通过免疫荧光和定量PCR对烟粉虱组织中双生病毒的定位与定量

双生病毒属病毒（Begomovirus，双生病毒科 Geminiviridae）由烟粉虱复合种（Bemisia tabaci）以持久性循环方式传播。

明确病毒在烟粉虱媒介体内的空间分布和数量，有助于理解双生病毒与烟粉虱之间的相互作用，并为防控严重的双生病毒病害提供新策略。该技术的优势在于，我们能够快速分离烟粉虱组织，实现病毒蛋白与烟粉虱蛋白的共定位，并对烟粉虱整体以及感染病毒的植物中的病毒进行定量分析。在病毒获取后的适当实验时间点，将经冰麻醉的雌性烟粉虱置于载玻片上的PBS液滴中，在体视显微镜下使用精细的针灸针切开烟粉虱的腹部。用针取出中肠，并将中肠放入盛有PBS的收集皿中。为收集成对的唾液腺（PSGs），从靠近头部的背部将虫体在胸部处分开，并用针穿过胸部固定烟粉虱。用第二根针轻轻抖动烟粉虱，直至两个唾液腺与虫体分离，然后将腺体转移至另一盛有PBS的培养皿中。采集卵巢时，完全打开腹部，用针将卵巢与其他组织分离。用移液器去除多余组织，将卵巢转移至新的含有PBS的培养皿中。采集血淋巴样品时，取10微升PBS滴加到新的显微镜载玻片上，将一只新的烟粉虱放入液滴中。使用细针灸针在腹部轻轻刺一个小孔，然后对腹部施加轻微压力，使血淋巴释放到缓冲液中，并收集8微升液体样本。为了观察收获的烟粉虱唾液腺、中肠或卵巢组织中TYLCV的定位情况，将15至20个样本转移至一个直径3.5厘米的玻璃培养皿中，并吸除多余的缓冲液。在室温下用 1 毫升 4% 多聚甲醛固定组织 2 小时，然后用 1 毫升新鲜 TBS 洗涤样品 3 次，每次 2 分钟。最后一次洗涤后，加入 1 毫升 0.5% Triton X-100 透化 30 分钟，随后用 1 毫升 TBST 洗涤 3 次，洗涤方式同前。最后一次洗涤后，在室温下用 1 毫升 1% 牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点 2 小时，然后按前述方法用 TBST 洗涤 3 次。最后一次洗涤后，在避光条件下，于4°C用目标一抗对细胞进行过夜孵育。次日早晨，用TBST洗涤样本三次，然后在避光条件下，室温下加入相应的二抗孵育两小时。孵育结束后，将中肠洗涤三次，并将样本转移至洁净的显微镜载玻片上。尽可能吸除缓冲液，然后滴加一滴 DAPI 对细胞核进行染色，盖上盖玻片后通过共聚焦显微镜观察标记的组织。对于番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的定量分析，将采集的烟粉虱组织样本用新鲜 PBS 洗涤两到三次，然后将 20 个中肠、20 个唾液腺（PSG）或一个卵巢连同 5 µL PBS 转移至含有 25 µL 裂解液的各个 PCR 管中。向每根 PCR 管中加入 5 至 7 颗直径为 2 毫米的陶瓷研磨珠，随后在均质仪中研磨样本。取八微升血淋巴样品加入新的PCR管中，再加入10微升裂解液，充分混匀。将所有样品在65摄氏度孵育1小时，随后在100摄氏度孵育10分钟，并进行短暂离心。接着，向定量PCR八联管的各管中加入18微升预混液，并向至少三个管中分别加入两微升的每种DNA样品。当所有样品加样完毕后，盖上管盖，离心使溶液沉降至各离心管底部。将离心管放入实时荧光定量PCR仪中进行定量PCR扩增，选择cyber作为荧光染料，样品类型设为未知（unknown）。随后将定量数据导出至电子表格，用于分析各样品中病毒DNA的相对含量。此处展示了TYLCV在烟粉虱唾液腺、中肠和卵巢中的DAPI染色代表性图像。如图所示，TYLCV在唾液腺和中肠中的积累量高于卵巢。烟粉虱在感染TYLCV的番茄上取食24、48和72小时后，对其唾液腺、中肠、血淋巴和卵巢中病毒量的定量分析表明，随着获毒时间的延长，病毒在烟粉虱不同组织中的含量呈正相关增加。最好使用新鲜的粉虱，因为死亡的昆虫会增加解剖难度。按照本实验步骤，还可进行其他分析，如蛋白质印迹和免疫共沉淀，以进一步研究病毒蛋白的表达以及病毒蛋白与媒介蛋白之间的相互作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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