免疫荧光和定量PCR对白蝇组织中白蝇病毒的定位和定量
2020年2月8日
我们描述了一种免疫荧光和定量PCR方法，用于昆虫组织中果子病毒的定位和定量。免疫荧光方案可用于共定病毒和载体蛋白。定量PCR协议可以扩展，以量化整个白蝇体内和受病毒感染的植物中的病毒。
澄清白蝇病媒中病毒的空间性和数量有助于理解白蝇病毒与白蝇的相互作用，并有助于制定控制严重白蝇病毒病的新策略。这项技术的优点是，我们可以快速分离白蝇组织，联合本地化病毒和白蝇蛋白，并量化白蝇全身和受病毒感染的植物中的病毒。在适当的实验时间点，在获得病毒后，将冰麻醉雌性白蝇放入显微镜幻灯片上的一滴PBS中，并使用精细的针灸针在立体显微镜下打开白蝇的腹部。
使用针头提取中针，将中针放入PBS的收集盘中。要收集 PSG，请将胸部部位的主体从头部附近的后侧分离，用针头固定白蝇穿过胸部。使用第二根针摇动白蝇，直到两个唾液腺从身体分离，并转移腺体到PBS的新菜。
要收集卵巢，完全打开腹部，用针将卵巢与其他组织分离。使用移液器去除多余的组织，将卵巢转移到PBS的新盘中。要收集血与升样品，请将 10 微升 PBS 添加到新的显微镜幻灯片上，并将新的白蝇放入液滴中。
使用细针灸针轻轻打孔在腹部。然后对腹部施加轻微压力，将血氧释放到缓冲液中，并收集液体的八微升样品。要在收获的白蝇PSG、中毛病或卵巢组织中可视化TYLCV定位，请将15至20个标本转移到一个玻璃3.5厘米的培养皿中，并吸进多余的缓冲液。
将组织在一毫升4%甲醛中固定两小时，在室温下，每次洗涤一毫升新鲜TBS，然后仔细清洗样品三次，两分钟。上次洗涤后，用 0.5%Triton X-100 的 0.5% 的一毫升渗透样品 30 分钟，然后洗涤三次，每次洗涤用一毫升 TBST 进行证明。上次洗涤后，在室温下用一毫升1%牛血清白蛋白进行两个小时的非特异性结合，随后在TBST中进行三次洗涤，如证明。
上次洗涤后，在四摄氏度下将细胞与感兴趣的主要抗体标记在四摄氏度下，防止光线。第二天早上，用TBST清洗样品三次，然后加入适当的二级抗体，在室温下保持两小时，防止光线。在孵育结束时，洗涤中组三次，将试样转移到干净的显微镜幻灯片中。
在安装盖玻片和通过共和显微镜检查标记组织之前，尽可能多地取出缓冲液，用一滴 DAPI 染色核。对于 TYLCV 定量，在新鲜 PBS 中将收获的白蝇组织样本洗涤 2 到 3 次，并在 5 微升 PBS 中将 20 个中结、20 个 PSG 或 1 个卵巢转移到含有 25 微升解解的单个 PCR 管中。在每个管中加入五到七个直径两毫米的陶瓷珠子，并将样品研磨在均质器中。
将一个八微升的血升样品加入新的PCR管中，并加入10微升的解菌，并进行彻底的混合。在65摄氏度下孵育所有样品一小时，随后在100摄氏度下孵育10分钟，并短暂离心。接下来，在定量PCR条管的小瓶中加入18微升主混合物，并将每个DNA样本的两微升添加到至少三个小瓶中。
当所有样品都装好后，关闭管子并离心机将溶液沉淀在每瓶的底部。将小瓶加载到用于定量 PCR 的实时热循环器上，选择网络作为荧光染料，选择未知作为样品类型。然后将定量数据导出到电子表格中，以分析每个样品中病毒DNA的相对数量。
在这里，显示了在白蝇 PSG、中古和卵巢中，DAPI 染色中的 TYLCV 的代表性图像。正如观察到的，TVLCV表明在PSG和中古体内比在卵巢中积累更多。在喂养受TYLCV感染的番茄24、48和72小时后，白蝇PSG、中古、血红和卵巢中病毒的定量表明，不同白蝇组织中病毒的数量增加，与采集获取期增加有直接关系。
最好使用新鲜的白蝇，因为死昆虫会增加解剖的难度。按照这个程序，其他分析，如西方印迹和共免疫沉淀，可以进行，以回答有关病毒蛋白表达和病毒和载体蛋白相互作用的其他问题。
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概述
本文介绍了一种使用免疫荧光和定量PCR在蚜虫载体中定位和定量地黄花叶病毒的方法。了解这些病毒的空间分布和数量可以帮助制定地黄花叶病毒疾病的防控策略。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 昆虫学
- 分子生物学
背景
- 地黄花叶病毒是影响植物的重要病原体。
- 蚜虫是这些病毒的载体。
- 了解病毒-载体相互作用对于疾病管理至关重要。
- 当前研究这些相互作用的方法有限。
研究目的
- 开发一种在蚜虫组织中分离和定量地黄花叶病毒的技术。
- 共定位病毒和载体蛋白。
- 将定量方法扩展到整个蚜虫身体和病毒感染的植物。
使用的方法
- 用于蛋白定位的免疫荧光。
- 用于病毒定量的定量PCR。
- 使用细针穿刺针分离蚜虫组织。
- 对提取的组织进行显微镜检查。
主要结果
- 在蚜虫组织中成功定位地黄花叶病毒。
- 对整个蚜虫身体中的病毒进行定量。
- 实现病毒和蚜虫蛋白的共定位。
- 该方法适用于病毒感染的植物。
结论
- 开发的方法增强了对地黄花叶病毒-蚜虫相互作用的理解。
- 这些技术可以为控制地黄花叶病毒疾病的策略提供信息。
- 未来的研究可以在这些方法的基础上进行更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding virus-vector interactions is critical for developing targeted interventions against plant pathogens that threaten global crop yields. This method enables precise spatial and quantitative analysis of begomoviruses in whitefly tissues, supporting mechanistic de-risking in early-stage antiviral or vector control target validation. By providing reproducible localization and quantification data, it enhances predictive confidence in target selection and pathway interrogation for agrochemical or biologics discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral tissue tropism and vector protein interactions to clarify mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Provides standardized tissue dissection and labeling workflows for consistent target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral load data across tissues to support assay readout standardization and reproducibility.
- Operational Value: Establishes a scalable sample preparation pipeline for high-throughput screening of antiviral compounds or vector-targeting agents.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling correlation of viral accumulation with transmission potential.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between virology, entomology, and molecular biology teams through standardized outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing tissue-specific viral quantification and co-localization data that inform target selection and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral protein function and vector interaction pathways through direct tissue localization.
- Screening: Enables assay readiness by providing quantified viral DNA inputs for compound efficacy screening in vector-based models.
- Analytics: Delivers quantitative PCR readouts that allow statistical comparison of viral burden across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical relevance by enabling viral load correlation with transmission efficiency in whitefly populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing and detection platform applicable to multiple virus-vector systems beyond begomoviruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virus-vector interaction models through direct tissue-level visualization and quantification.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized tissue isolation, fixation, and detection protocols across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing quantitative thresholds for viral accumulation in key tissues.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral or vector control strategies based on tissue-specific viral dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, immunofluorescence microscopy, and qPCR assay design.
- Dependent on access to confocal microscopes, thermal cyclers, and tissue homogenization equipment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue collection timing and fixation procedures.
- Adaptation to other vector systems may require optimization of antibody penetration and tissue permeability steps.
- Practical limitations include tissue degradation risk with delayed processing and variability in whitefly infection efficiency.
