通过组合单域抗体库的分步噬菌体选择创建高度特异性化学诱导蛋白分解系统

该协议意义重大，因为它为各种小分子的生物传感器提供了一种工程蛋白二化系统的通用方法。此外，它使用一个高度多样化的蛋白质库，以高效且经济高效的方式为不同配体选择生物传感器，而无需专用设备。工程生物传感器可用于化学控制细胞行为和监测细胞代谢物的实时变化。

通过这种视觉演示，研究人员可以观察技术的详细指导，对实验输出有一个明确的期望。在每轮选择开始，在6毫升2YT介质中生长一个TG1电穿孔能力细胞群，温度为37摄氏度，每分钟250转，达到600纳米的吸收度，约为0.5。达到最佳光学密度后，将细胞放在冰上。

要准备负选择珠子，用一毫升 05%PBS 加 Tween 缓冲液洗三次 300 微升的链球素涂层磁珠，在磁分离机架上每次洗涤一毫升 PBS 两次。在PBS中用1%的1%卡丁的1毫升重新暂停珠子，用生物素使珠子饱和，其含量是珠子所报告结合容量的五倍。在室温下旋转一小时后，用 PBS 加 Tween 清洗珠子五次，用 PBS 洗涤三次，用 PBS 清洗珠子三次。

上次洗涤后，将 PBS 中的 13 个噬菌激素和 PBS 中的 1% 牛血清白蛋白加入约 10 倍，在室温下旋转孵育一小时。在孵育结束时，将上经液转移到1.5毫升的管中。对于使用生物基化配体结合链子的正选，在生物素结合配体选择中用于负选择的珠子体积的一半饱和，其含量是手册计算的全部结合容量的五倍。

在室温下旋转一小时后，用PBS加Tween洗涤珠子五次，用PBS单独清洗三次，用1%的卡辛和1%牛血清白蛋白用1毫升的旋转阻断珠子一小时。在孵化结束时，在PBS加Tween中清洗三次，在PBS中清洗一次，在PBS中清洗一次，并使用未绑定的噬菌体重新悬浮过链球菌涂层的磁珠。在不干扰珠子的情况下提取不含绑定的噬菌玉，将样品放在一边用作输入。

然后用PBS加Tween洗10次，用PBS洗5次，每洗三次后将珠子转移到新管子上，避免将结合的噬菌体与管壁进行非特异性结合。为了竞争地对结合的噬菌体进行旋转，在正选择珠子中加入450微升非生物基基配体的微摩尔浓度，并将珠子旋转30分钟。在孵育结束时，将上经剂转移到一个新的管中，用作输出。

对于输入滴定，使用输入噬菌名在 PBS 中准备 10 个串行稀释，最多 10 倍至 9 倍。将10微升输入噬菌体从1倍10转移到7到10到9稀释到70微升的输入噬菌体。在37摄氏度下45分钟后，将受感染的TG1细胞盘上单个90毫米2YT的果子盘上，含有每毫升安他林100微克和2%葡萄糖，在37摄氏度下过夜孵育。

第二天早上，使用公式计算噬菌未成年人输入。对于输出感染和滴定，将洗净的噬菌体添加到三毫升的 TG1 细胞中，在 37 摄氏度的水浴中孵育 45 分钟。然后，在新鲜2YT介质中对受感染的细胞进行10次连续稀释，浓度高达1倍10至3次，并在90毫米2YT的阿加盘上进行每盘稀释，在37摄氏度的温度下进行隔夜孵育。

第二天早上，根据公式计算噬菌的输出。为了将单个克隆从富集的地下库中分离，将单菌落从隔夜培养的、受噬菌体感染的 TG1 细胞板转移到 250 微升的 2YT 介质中，每孔辅以安西林，在 37 摄氏度的无菌深井板中进行过夜培养。当细胞达到约0.5的600纳米密度时，每毫升CM13帮助器噬菌体的9个斑块形成单位中加入5倍10，并在37摄氏度下以每分钟250次旋转孵育细胞45分钟。

在孵育结束时，将500微升2YT介质加用安西林和每毫升卡那霉素50微克添加到每井，并将板在25摄氏度和250次旋转，过夜。第二天早上，通过离心沉淀细胞，以便收集噬菌体颗粒。为了验证 ELISA 的锚点结合，在四摄氏度的涂层缓冲液中，隔夜在涂层缓冲液中涂上 100 微升，每毫升 5 微克。

第二天早上，在300微升PBS加Tween中清洗板三次，然后向目标井中加入100微升的一微摩尔生物基化靶点，将100微升的一微摩尔生物素或目标同源物添加到适当的控制井中。在室温下一小时后，用PBS加Tween每次洗涤洗涤5次，并在室温下用300微升1%的卡丁进行阻断任何非特异性结合，在室温下洗涤一小时。在孵育结束时，用新鲜 PBS 和每次洗净 Tween 洗三次盘子，然后加入纯化的噬菌菌。

在室温下一小时后，用新鲜的 PBS 加每次洗净的 Tween 清洗盘子 10 次。在每个井中加入100微升的马萝卜过氧化物酶M13主要涂层蛋白抗体，在室温下孵育一小时。然后如所证明的三次清洗板，并在每孔中加入100微升TMB基材，在室温下孵育10分钟，或直到观察到明显的颜色变化。

然后停止每井100微升一摩尔盐酸的反应，并在分光光度计上读取450纳米的板。锚定粘结剂验证后，还应使用针对锚点粘结剂配体复合物的相同蛋白质库进行二丁化粘结剂筛选。四到六轮选择后的典型扩充结果很好地表明，在子库中潜在的命中率很高，在这种情况下，可能不需要进行进一轮选择。

单克隆ELISA适用于分析锚点和二化粘结剂的相对结合亲和力和选择性，便于比较克隆之间的结合选择性。同样，二丁化活页夹的选择允许识别仅使用固定锚点粘结剂与配体形成异质剂的克隆。这些配体浓度依赖结合数据表明，与控制样品所证明的不良结合相比，经测试的纳米体适合构建化学诱导的二丁体系统。

此外，分析大小排除色谱可用于确认锚和二丁体在配体存在的情况下的异质形成。例如，在此实验中，当锚点和二丁二醇与大麻二醇混合时，观察到了二丁二化峰值。相比之下，在没有大麻二醇或将每个活页夹单独加载到柱子上时，未检测到二丁二的二丁极。

蛋白质二化系统应在酵母或哺乳动物细胞中进行基因编码，以便进一步验证选定的生物传感器，以开发体内应用。我们期望这种方法将给其他研究人员提供有效和必要的工具，以检测重要的代谢物，信号分子，或药物体内的高时空分辨率。