Name: 通过组合单域抗体库的分步噬菌体选择创建高度特异性化学诱导蛋白分解系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解如何通过噬菌体展示单域抗体库的分步选择方法，构建高度特异性化学诱导蛋白二聚化系统，用于实时监测细胞代谢物并化学调控细胞行为。该方法无需专用设备，成本效益高。

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本工作得到了华盛顿大学创新奖（授予 L.G.）、美国国立卫生研究院基金（1R35GM128918，授予 L.G.）以及华盛顿大学启动资金（授予 L.G.）的支持。H.J. 获得了华盛顿研究基金会本科生奖学金的支持。K.W. 获得了华盛顿大学蛋白质设计研究所本科生奖学金的支持。

1. 文库构建
<ol>
	<li>使用多样性约为 1.23–7.14 × 109 的合成组合单域抗体文库，如先前所述19。尽管本方案未包含文库构建步骤，但也可应用于其他组合型结合蛋白文库。</li>
</ol>
2. 配体靶标或配体的生物素标记
<ol>
	<li>根据靶标上合适的生物素化位点，通过不同的化学合成策略对选定的配体进行生物素标记，例如大麻二酚（CBD）和四氢大麻酚（THC）19。</li>
</ol>
3. 锚定结合剂筛选
<ol>
	<li>筛选起始
	<ol>
		<li>每轮筛选开始时，挑取一个新鲜培养的 TG1 细胞单菌落，接种于 6 mL 2YT 培养基中，在 37 ˚C、250 转/分钟（rpm）条件下培养至 600 nm 波长处吸光度（OD600）约为 0.5。将细胞置于冰上孵育，用于步骤 3.5.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用生物素结合链霉亲和素磁珠进行阴性筛选
	<ol>
		<li>使用磁性分离架清洗 300 µL 链霉亲和素包被的磁珠，用含 0.05% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST，即 1 × PBS 加 0.05% vol/vol Tween 20）洗涤 3 次，再用 1 × PBS 洗涤 2 次，以制备“阴性筛选磁珠”。</li>
		<li>将磁珠重悬于 1 mL 含 1% 酪蛋白的 1 × PBS（pH = 7.4）中，并加入推荐结合容量 5 倍量的 生物素 以饱和磁珠结合位点。在室温（RT）下旋转孵育 1 小时。</li>
		<li>用 0.05% PBST 洗涤 5 次，再用 1 × PBS 洗涤 3 次，共洗涤 8 次。</li>
		<li>加入约 1013 个噬菌体颗粒，溶于含 1% 酪蛋白/1% BSA 的 1 × PBS（pH = 7.4）中，在室温下旋转孵育 1 小时。</li>
		<li>孵育后，收集上清液，用于步骤 3.3.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用生物素化配体结合链霉亲和素磁珠进行阳性筛选
	<ol>
		<li>按照步骤 3.2.1 的方法，使用“阴性筛选磁珠”所用体积的一半来制备“阳性筛选磁珠”。</li>
		<li>将磁珠重悬于 1 mL 含 1% 酪蛋白的 1 × PBS（pH 7.4）中，并根据说明书计算的完全结合容量，加入所选 生物素化配体 的 5 倍量以饱和磁珠。在室温下旋转孵育 1 小时。</li>
		<li>用 0.05% PBST 洗涤 5 次，再用 1 × PBS 洗涤 3 次，共洗涤 8 次。</li>
		<li>用 1 mL 含 1% 酪蛋白/1% BSA 的 1 × PBS（pH = 7.4）封闭磁珠，在室温下旋转孵育 1 小时，以防止噬菌体与链霉亲和素包被磁珠之间的非特异性结合。</li>
		<li>用 0.05% PBST 洗涤 3 次，再用 1 × PBS 洗涤 1 次，共洗涤 4 次。</li>
		<li>使用步骤 3.3.5 中获得的未结合噬菌体重悬链霉亲和素包被磁珠，在室温下旋转孵育 1 小时。</li>
		<li>小心吸出上清液，避免扰动磁珠。将未结合的噬菌体保存为“输入”样品，用于步骤 3.5.1。</li>
		<li>用 0.05% PBST 洗涤 10 次，再用 1 × PBS 洗涤 5 次。每洗涤三次后，将磁珠转移至新离心管中，以避免噬菌体非特异性吸附在管壁上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>噬菌体展示纳米抗体的洗脱
	<ol>
		<li>通过加入 450 µL 的 非生物素化配体 进行竞争性洗脱，配体浓度为微摩尔范围（例如 10–50 µM），在室温下旋转孵育 30 分钟。用于竞争性洗脱结合噬菌体的配体浓度取决于目标“锚定结合剂”的期望 KD 值。在初始筛选轮次中可使用相对较高的配体浓度，随后在后续轮次中逐步降低。</li>
		<li>收集上清液，将洗脱的噬菌体保存为“输出”样品，用于步骤 3.5.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>输入/输出滴定与感染
	<ol>
		<li>对于输入滴定，将步骤 3.3.7 中获得的输入噬菌体用 1 × PBS 进行 10 倍系列稀释，最高稀释至 109 倍。取 107–109 稀释度的样品，分别取 10 µL 加入 70 µL TG1 细胞（OD600 约为 0.5）中进行感染。37 ˚C 孵育 45 分钟后，将感染后的 TG1 细胞涂布于三块含 100 μg/mL 氨苄青霉素和 2%（wt/vol）葡萄糖的 90 mm 2YT 琼脂平板上，37 ˚C 过夜培养。根据过夜培养的平板，噬菌体输入量可按以下公式计算： 
		<img alt="噬菌体滴度方程，生物淘选方法，噬菌体展示实验设置，菌落计数公式。" src="/files/ftp_upload/60738/60738eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"></li>
		<li>对于输出感染与滴定，将步骤 3.4.2 中获得的洗脱噬菌体加入 3 mL TG1 细胞（OD600 约为 0.5）中。在 37 ˚C 水浴中孵育 45 分钟。然后在 2YT 培养基中进行 10 倍系列稀释，最高稀释至 103 倍，将各稀释液涂布于 90 mm 2YT 琼脂平板上，37 ˚C 过夜培养。根据过夜培养的平板，噬菌体输出量可按以下公式计算： 
		<img alt="噬菌体滴度方程，生物淘选方法，噬菌体展示实验设置，菌落计数公式。" src="/files/ftp_upload/60738/60738eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"></li>
		<li>将剩余的感染后 TG1 细胞涂布于三块含 100 μg/mL 氨苄青霉素和 2%（wt/vol）葡萄糖的 150 mm 2YT 琼脂平板上，37 ˚C 过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库扩增与回收，用于后续筛选轮次
	<ol>
		<li>每块平板加入 3 mL 2YT，用无菌细胞刮刀刮下菌苔，将所有细胞收集至 50 mL 锥形管中。加入无菌甘油使终浓度为 20%（wt/vol）。测定混合液的 OD600，分装成 3–5 份储备液。长期保存于 -80 ˚C。</li>
		<li>进行噬菌体拯救时，将含噬菌粒的 TG1 菌液用添加了 2% 葡萄糖和 100 μg/mL 氨苄青霉素的 2YT 培养基稀释至 OD600 约为 0.1。在 37 ˚C、250 rpm 条件下培养至 OD600 约为 0.5。</li>
		<li>加入 CM13 辅助噬菌体至终浓度为 5 × 109 pfu/mL，进行超感染，在 37 ˚C、250 rpm 条件下孵育 45 分钟。CM13 辅助噬菌体提供组装完整噬菌体颗粒所需的噬菌体外壳蛋白。</li>
		<li>在 8,000 × g 条件下离心 10 分钟，去除葡萄糖。将细胞重悬于 50 mL 添加了 100 μg/mL 氨苄青霉素和 50 μg/mL 卡那霉素的 2YT 培养基中，在 25 ˚C、250 rpm 条件下过夜培养。</li>
		<li>将过夜培养物在 9,000 × g、4 ˚C 条件下离心 30 分钟。将上清液转移至新离心管中，加入 1/5 体积的 PEG/NaCl 溶液（含 20% wt/vol 聚乙二醇-6,000 和 2.5 M NaCl）沉淀上清液中的噬菌体。轻轻混匀后置于冰上 1 小时。</li>
		<li>在 12,000 × g、4 ˚C 条件下离心 30 分钟收集噬菌体颗粒。将沉淀用 1 mL 1 × PBS 重悬，转移至微量离心管中。在 20,000 × g、4 ˚C 条件下离心 10 分钟，以去除残留细菌。</li>
		<li>将上清液转移至新的微量离心管中，避免扰动细菌沉淀。取 1:100 稀释液测定 269 nm 和 320 nm 处的吸光度。噬菌体总数可按以下公式23计算： 
		<img alt="噬菌体滴度计算公式图示，利用吸光度和载体大小计算每毫升噬菌体数量。" src="/files/ftp_upload/60738/60738eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 3"></li>
		<li>噬菌体文库可短期保存于 4 ˚C，或加入 25% 甘油后长期保存于 -80 ˚C。</li>
		<li>重复筛选过程（步骤 3.1–3.6）3–6 轮，或直至观察到理想的富集效果（参见结果部分）。随后进行平板培养并挑取单克隆（第 4 节），以表征其对配体的亲和力与特异性（第 5–7 节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 单克隆分离
<ol>
	<li>为从富集的亚文库中分离单个克隆，制备噬菌体感染的TG1细胞的10倍系列稀释液（步骤3.5.2）。将系列稀释液接种于含有100 μg/mL氨苄青霉素和2%（wt/vol）葡萄糖的90 mm 2YT-琼脂平板上，37 ˚C过夜培养。</li>
	<li>从过夜培养的平板上挑取单菌落，分别接种至每孔含有250 μL添加了100 μg/mL氨苄青霉素的2YT培养基的无菌深孔板中，37 ˚C过夜培养。</li>
	<li>从过夜培养物中取10 µL接种至500 µL新鲜的添加了100 μg/mL氨苄青霉素的2YT培养基中。</li>
	<li>将细胞培养至OD600约为0.5，加入CM13辅助噬菌体至终浓度5 x 109 pfu/mL，在37 ˚C、250 rpm条件下孵育45分钟。</li>
	<li>加入500 µL添加了100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素的2YT培养基。在25 ˚C、250 rpm条件下过夜孵育。</li>
	<li>将过夜培养的深孔板以3,000 x g离心10分钟。收集上清液（含噬菌体颗粒），注意不要扰动菌体沉淀。</li>
	<li>噬菌体颗粒可用于ELISA实验，以确定所选克隆对配体的特异性。可使用生物素或靶标的结构类似物作为阴性对照。</li>
</ol>
5. 通过 ELISA 验证锚定结合剂
<ol>
	<li>使用包被缓冲液（100 mM 碳酸盐缓冲液，pH = 8.6）中浓度为 5 μg/mL 的链霉亲和素 100 μL，在 4 °C 过夜包被 96 孔 ELISA 板。</li>
	<li>用 0.05% PBST 洗涤 ELISA 板 3 次，向目标孔中加入 100 μL 浓度为 1 μM 的生物素化靶标；向对照孔中加入 100 μL 浓度为 1 μM 的生物素或靶标同源物。室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 0.05% PBST 洗涤 5 次，通过每孔加入 300 µL 含 1% 酪蛋白的 1 × PBS 封闭非特异性结合位点。室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 0.05% PBST 洗涤 ELISA 板 3 次，加入纯化的噬菌体上清液。室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 0.05% PBST 洗涤 ELISA 板 10 次，每孔加入 100 μL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的 M13 主要外壳蛋白抗体（用含 1% 酪蛋白的 1 × PBS 稀释至 1:10,000）。室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 0.05% PBST 洗涤 ELISA 板 3 次，每孔加入 100 μL 四甲基联苯胺（TMB）底物。孵育 10 分钟或直至观察到明显的颜色变化。加入 100 μL 1 M HCl 终止反应。在分光光度计上于 450 nm 处读取吸光值。</li>
	<li>对于蛋白表达与纯化，选择对靶标具有高亲和力和特异性的克隆（见讨论部分）。</li>
</ol>
6. 蛋白质表达、纯化和生物素标记
<ol>
	<li>如先前报道19，从第5节中选择亚克隆克隆，并表达为C端带有Avi标签和His标签的纳米抗体。</li>
	<li>在大肠杆菌WK6细胞的周质空间中表达所选纳米抗体（通常在1 L培养体系中），通过渗透休克法释放，并使用镍-NTA柱进行纯化（参见材料表）。</li>
	<li>使用脱盐柱更换缓冲液（1 × PBS含5%甘油；参见材料表）。</li>
	<li>使用商用试剂盒对纳米抗体进行生物素标记，以用于后续实验（参见材料表）。</li>
</ol>
7. 通过BLI表征锚定结合剂
<ol>
	<li>通过将200 nM生物素标记的锚定结合物固定在链霉亲和素生物传感器上（参见材料表），使用结合测定缓冲液（1 × PBS（pH = 7.4）、0.05% Tween 20、0.2% BSA、3%甲醇）分析所选锚定结合物的结合亲和力和动力学。</li>
	<li>使用数据分析软件（参见材料表）通过稳态分析计算锚定结合物-配体相互作用的解离常数（KD）。获得的KD值通常在单至双位数微摩尔范围内。</li>
</ol>
8. 二聚体结合剂筛选
注意：二聚化结合物的生物淘选筛选过程与锚定结合物的筛选类似，但有两个关键步骤不同：1）分别使用已选定的生物素标记锚定结合物和锚定结合物-配体复合物进行阴性筛选和阳性筛选，以筛选出二聚化结合物。2）在洗脱步骤中，使用 100 mM 三乙胺洗脱仅与锚定结合物-配体靶标复合物结合的阳性噬菌体。采用 100 mM 三甲胺溶液（pH = 11.5）通过破坏蛋白质相互作用来洗脱阳性克隆。
<ol>
	<li>开始筛选
	<ol>
		<li>每轮筛选开始时，挑取一个在最低培养基上新鲜培养的 TG1 单菌落，接种于 6 mL 2YT 培养基中，在 37 °C、250 rpm 条件下培养至 OD600 约为 0.5。随后将细胞置于冰上孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除负向筛选的纳米抗体
	<ol>
		<li>使用 400 µL 链霉亲和素包被的磁珠制备“去除管”，并按照步骤 3.2 操作。但与用生物素饱和不同，此处加入所选的 生物素化锚定结合剂，用量为计算出的完全结合容量的 5 倍，并保留未结合的噬菌体，用于步骤 8.3.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>正向筛选纳米抗体
	<ol>
		<li>使用“去除管”所用链霉亲和素包被磁珠体积的一半，按照步骤 3.3.2 至 3.3.3 制备“捕获管”。但与加入生物素化配体不同，此处加入所选的 生物素化锚定结合剂，用量为计算出的完全结合容量的 5 倍。</li>
		<li>为形成正向二聚化结合剂筛选所需的锚定结合剂-配体复合物，加入足够高浓度的 非生物素化配体，以确保大多数与链霉亲和素结合的锚定结合剂能够形成配体结合复合物。</li>
		<li>使用来自“去除管”的未结合噬菌体，按照步骤 3.3.3 至 3.3.8 操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗脱正向筛选的纳米抗体
	<ol>
		<li>加入 450 µL 100 mM 三乙胺，于室温在旋转仪上孵育 10 分钟，以洗脱结合在锚定结合剂-配体复合物上的噬菌体。</li>
		<li>收集竞争性洗脱的噬菌体，并按照步骤 3.4.1 至 3.4.2 操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进一步进行二聚化结合剂筛选
	<ol>
		<li>按照步骤 3.5 和 3.6 扩增并回收文库，以进行后续多轮筛选。重复筛选 3–6 轮，或直至观察到理想的富集效果。随后进行平板培养并挑取单克隆（参见第 4 节），以表征其对靶标的亲和力和特异性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 通过 ELISA 表征二聚体结合剂
<ol>
	<li>按照第4节中的步骤分离单个克隆，并通过ELISA进行表征。</li>
	<li>为检测二聚化结合候选分子对锚定结合剂-配体复合物的亲和力，使用100 μL浓度为100 nM的生物素化锚定结合剂包被ELISA靶标板。孵育1小时后，加入1 μM的配体靶标以形成锚定结合剂-配体复合物。</li>
	<li>对照板应仅使用生物素化锚定结合剂进行包被，以排除能够与游离锚定结合剂结合的克隆。加入100 μL浓度为100 nM的生物素化锚定结合剂，在室温下孵育1小时。</li>
	<li>按照第5.3–5.7节操作。</li>
</ol>
10. 通过BLI表征二聚体结合剂
<ol>
	<li>通过将生物素标记的二聚化结合剂固定在链霉亲和素（SA）生物传感器上，并使用结合缓冲液进行孵育，随后检测其与锚定结合剂-配体复合物的结合亲和力和动力学参数 1 μM 配体梯度稀释液预平衡的锚定结合剂。 KD, k在，以及 k关闭 相互作用的计算可使用我们报道的方法进行19.</li>
</ol>

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<li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475(2014).</li>
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</ol>

华盛顿大学已就本研究相关技术提交了临时专利申请。

在不同轮次的生物淘选中，选择输入噬菌体文库的正确浓度至关重要。我们通常起始于约 1012–1013 个噬菌体颗粒的输入文库，其多样性&#62;109，以确保在下拉实验中每种噬菌体克隆大约有 100–1,000 个拷贝被展示。如果结合实验中的噬菌体浓度过高或过低，则非特异性结合或丢失阳性克隆的可能性将增加。锚定分子或二聚化结合剂的筛选通常包括三到六轮生物淘选，输出的噬菌体数量通常从约 104 开始，逐渐增加至约 108–109。在观察到此类富集后，适合挑选单克隆进行 ELISA 验证。额外增加淘选轮次可能会降低发现丰度较低但合适的阳性克隆的机会。
设置适当的阴性对照和筛选条件对于提高筛选成功率至关重要。例如，使用配体靶标的结构类似物有助于筛选出具有配体特异性的结合物。在我们的研究中，在ELISA和BLI验证锚定结合物及二聚化结合物时，使用了与CBD高度相似的类似物THC作为对照19。在二聚化结合物的筛选过程...

化学诱导二聚化（CID）系统是指两种蛋白质仅在小分子配体存在下才会发生二聚化的体系（图1），可用于解析和调控代谢、信号转导及其他生物通路，是一种多功能工具1。该系统已在生物调控方面展现出应用潜力，例如通过药物控制T细胞激活2以及诱导细胞凋亡3,4，从而提高过继性T细胞治疗的安全性和有效性。此外，该系统还为小分子靶标的体内或体外检测提供了新方法。例如，可将CID蛋白与荧光报告系统（如荧光共振能量转移（FRET）5和环状重排荧光蛋白）6进行基因融合，用于活体实时检测；或作为亲和试剂，应用于类似夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）的检测方法中。
尽管化学诱导二聚化（CID）系统具有广泛的应用前景，但构建可由特定小分子配体调控的新型CID系统仍面临重大挑战。已建立的蛋白质结合物工程方法，包括动物免疫7、体外筛选8,9和计算蛋白质设计10，能够生成通过二元蛋白质-配体相互作用发挥功能的配体结合蛋白。然而，这些方法在构建配体诱导的三元CID复合物方面存在困难。某些方法通过化学连接两个可独立结合同一或不同蛋白质的配体来实现CID11,12,13,14,15,16，或依赖于筛选能够识别预先存在的小分子-蛋白质复合物的结合蛋白（如抗体）17,18，因此其可选用的配体种类有限。
我们近期开发了一种用于从头设计化学诱导二聚（CID）系统的新方法——combinatorial binders-enabled selection of CID（COMBINES-CID）方法19。该方法可实现配体诱导二聚的高特异性（例如，锚定二聚化结合物的解离常数，KD（无配体）/KD（有配体）&#62; 1,000）。这种二聚特异性是通过使用具有柔性结合位点的锚定结合物实现的，这些结合位点在配体结合后可发生构象变化，从而为筛选仅识别配体结合态锚定物的构象选择性结合物提供了基础。我们通过构建大麻二酚（CBD）诱导的纳米抗体异源二聚体，验证了该方法的可行性。纳米抗体是来源于骆驼科动物的一种12–15 kDa功能性抗体片段，具有通用支架结构和三个柔性CDR环（图2）20，可形成大小可调的结合口袋，适用于小分子表位21,22。值得注意的是，体外筛选组合蛋白文库的方法应具备成本效益且具有普适性，因为同一高质量文库可应用于不同配体的CID系统构建。
在本实验方案及视频中，我们重点描述通过使用CBD作为靶标，对多样性超过109的组合纳米抗体文库进行筛选，从而体外两步筛选并验证锚定结合物（图3A）和二聚化结合物（图3B）的方法；但该方案同样适用于其他蛋白质文库或小分子靶标。CID结合物的筛选通常需要6–10周（图4）。

<table><tbody><tr><td>1-Step Ultra TMB ELISA 底物溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34029</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心滤过装置（3 kDa 截留分子量）</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 蛋白定量检测试剂盒 II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>BirA 生物素-蛋白连接酶标准反应试剂盒</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CM13 辅助噬菌体</td><td>Antibody Design Labs</td><td>PH020L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖一水合物</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11090</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Fast DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3238S</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest BglI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0074</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap-FF-1ml</td><td>GE Healthcare</td><td>11000458</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Alfa Aesar</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>M13 主要衣壳蛋白抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 孔聚丙烯深孔储存板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Octet RED96</td><td>ForteBio</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pADL-23c 噬菌粒载体</td><td>Antibody Design Labs</td><td>PD0111</td><td></td></tr><tr><td>PEG-6000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Platinum SuperFi DNA 聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>12351010</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR 纯化试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin M13 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27704</td><td></td></tr><tr><td>恢复培养基</td><td>Lucigen</td><td>80026-1</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>超级链霉亲和素（SSA）生物传感器</td><td>ForteBio</td><td>18-5057</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 75 increase 10/300 GL 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>TG1 电转感受态细胞</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP9726-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin 脱盐柱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr></tbody></table>

通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

仅在小分子配体存在时发生的蛋白质二聚化事件，能够推动用于解析和调控生物通路的小分子生物传感器的开发。目前，化学诱导二聚化（CID）系统种类有限，针对特定小分子配体设计具有理想灵敏度和选择性的新型CID系统仍是蛋白质工程领域的一大挑战。本文介绍一种高通量筛选方法——combinatorial binders-enabled selection of CID（COMBINES-CID，组合型结合剂介导的CID筛选法），可用于从头设计适用于多种配体的CID系统。该方法通过两步筛选噬菌体展示的组合纳米抗体文库，首先获得1）&#34;锚定结合剂&#34;，即能够优先结合目标配体的分子；随后获得2）&#34;二聚化结合剂&#34;，即仅特异性结合锚定结合剂-配体复合物的分子。为筛选锚定结合剂，采用含超过109个互补决定区（CDR）随机化的纳米抗体组合文库，利用生物素标记的配体进行筛选，并通过生物层干涉技术（BLI）使用未标记配体验证阳性克隆。为获得二聚化结合剂，以锚定结合剂-配体复合物作为正向筛选靶标，同时以未结合配体的锚定结合剂作为负向筛选对照，对纳米抗体文库进行筛选。COMBINES-CID方法具有广泛适用性，可用于其他免疫球蛋白、非免疫球蛋白或计算设计支架结构的CID结合剂筛选，从而构建用于体外及体内药物、代谢物、信号分子等检测的生物传感器。

我们描述了通过使用CBD作为靶标，从多样性超过109的组合纳米抗体文库中进行筛选，从而在体外分两步筛选并验证锚定结合物和二聚化结合物的方法。在连续多轮筛选过程中，评估噬菌体生物淘选中锚定结合物和二聚化结合物的富集情况至关重要。如图5所示，在经过4–6轮筛选后典型的富集结果表明，亚文库中潜在阳性克隆的比例较高，因此可能无需进行更多轮次的筛选。
单克隆ELISA适用于分析锚定结合物和二聚化结合物的相对结合亲和力与选择性。图6A展示了经过六轮生物淘选后典型的锚定结合物筛选结果。可比较表现出高（例如 #87）或低（例如 #27）配体选择性的克隆。应选择具有高选择性的克隆作为锚定结合物候选物。同样，图6B展示了经过四轮生物淘选后的二聚化结合物筛选结果。我们通常观察到某些克隆仅在存在配体时（例如 #49）或在无配体时（例如 #8...

构建具有理想亲和力和特异性的、可被任意给定小分子配体化学诱导的蛋白质二聚化系统，在生物学检测与调控方面具有广泛的应用前景。本文中，我们描述了一种高效且可推广的从头设计化学诱导二聚化系统的方法，该方法通过逐步筛选噬菌体展示的组合型单域抗体文库来实现。

仅在小分子配体存在时发生的蛋白质二聚化事件，可被用于开发针对……的小分子生物传感器

本方案具有重要意义，因为它提供了一种通用方法，可用于构建以蛋白质二聚化系统为基础的生物传感器，以检测多种小分子。此外，该方法利用一个高度多样化的蛋白质文库，能够以高效且经济的方式筛选针对不同配体的生物传感器，且无需使用专用设备。所构建的生物传感器可用于化学调控细胞行为，并实时监测细胞代谢物的变化。通过本视频演示，研究人员可以观察到这些技术的详细操作步骤，并对实验结果有明确的预期。每轮筛选开始时，将单个TG1电转感受态细胞菌落接种于6毫升2YT培养基中，在37摄氏度、250转/分钟条件下培养至600纳米波长下的吸光度约为0.5。当达到最佳光密度时，将细胞置于冰上。为制备阴性筛选磁珠，将300微升包被链霉亲和素的磁珠置于磁性分离架上，每次用1毫升含0.5% Tween的PBS缓冲液洗涤三次，再每次用1毫升PBS洗涤两次。用1毫升含1%酪蛋白的PBS重悬磁珠，并加入磁珠标称结合能力五倍量的生物素对磁珠进行饱和处理。室温旋转孵育1小时后，按上述方法用含Tween的PBS洗涤五次，再用PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，将约1×10¹³个噬菌体颗粒加入含1% 脱脂奶粉和1% 牛血清白蛋白的PBS中，与磁珠混合，室温下旋转孵育1小时。孵育结束后，将上清液转移至1.5毫升离心管中。进行生物素化配体结合的链霉亲和素磁珠正向筛选时，根据说明书计算全结合容量，选用负筛所用磁珠体积的一半，用目标生物素化配体以五倍全结合容量进行饱和处理。室温旋转孵育一小时后，用含Tween的PBS洗涤磁珠五次，再单独用PBS洗涤三次，如图所示。随后加入1毫升含1%酪蛋白和1%牛血清白蛋白的溶液，旋转孵育一小时以封闭磁珠。孵育结束后，将链霉亲和素包被的磁珠用含Tween的PBS洗涤三次，再单独用PBS洗涤一次，如图所示，并用未结合的噬菌体重新悬浮链霉亲和素包被的磁珠。小心吸取上清液（含未结合的噬菌体），避免扰动磁珠，将该样品保留备用，作为输入样本。然后按照所示方法，用含 Tween 的 PBS 洗涤珠子 10 次，再用 PBS 洗涤 5 次，每洗涤三次后将珠子转移至新管中，以避免结合的噬菌体非特异性地吸附到管壁上。为竞争性洗脱结合的噬菌体，向阳性筛选珠子中加入 450 微升微摩尔浓度的非生物素化配体，并将珠子置于旋转仪上孵育 30 分钟。孵育结束后，将上清液转移至新管中，作为输出样品使用。对于输入滴定，用PBS将输入噬菌体进行10倍系列稀释，最高稀释至1×10⁹倍。从1×10⁷至1×10⁹的稀释液中分别取10 µL，加入到已准备好的70 µL TG1细胞等分试样中。在37°C孵育45分钟后，将感染的TG1细胞分别涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素和2%葡萄糖的90 mm 2YT琼脂平板上，于37°C过夜培养。第二天早晨，使用公式计算噬菌体的输入量。对于输出感染和滴定，将洗脱的噬菌体加入3毫升TG1细胞中，在37摄氏度水浴中孵育45分钟。然后用新鲜的2YT培养基对感染后的细胞进行10倍系列稀释，直至稀释到1×10³浓度，并将每种稀释液涂布于90毫米的2YT琼脂平板上，在37摄氏度下过夜培养。第二天早晨，根据公式计算噬菌体产量。为了从富集的亚文库中分离单个克隆，将过夜培养的、感染噬菌体的TG1细胞平板上的单菌落转移至无菌深孔板中，每孔加入含氨苄青霉素的250微升2YT培养基，于37摄氏度过夜培养。当细胞在600纳米处的光密度达到约0.5时，向每孔加入5 × 10⁹ pfu/mL的CM13辅助噬菌体，于37摄氏度、250转/分钟条件下孵育45分钟。孵育结束后，向每孔中加入500微升添加了氨苄青霉素和50微克/毫升卡那霉素的2YT培养基，将培养板置于25摄氏度、250转/分钟条件下过夜培养。次日早晨，通过离心沉淀细胞，以收集噬菌体颗粒。为通过ELISA验证锚定结合，使用包被缓冲液中含5微克/毫升链霉亲和素的溶液，每孔加入100微升，于4摄氏度包被96孔ELISA板过夜。第二天早晨，用 300 微升 PBS 加 Tween 洗涤平板三次，然后向靶标孔中加入 100 微升 1 微摩尔的生物素标记靶标，向相应的对照孔中加入 100 微升 1 微摩尔的生物素或靶标同源物。室温孵育 1 小时后，每次用 PBS 加 Tween 洗涤 5 次，每次洗涤后每孔加入 300 微升 1% 乳酪素，室温下封闭非特异性结合 1 小时。孵育结束后，每次用新鲜的 PBS 加 Tween 洗涤 3 次，然后加入纯化的噬菌体上清液。室温孵育一小时后，用新鲜的含吐温PBS溶液洗涤平板10次，每次更换PBS。每孔加入100 µL辣根过氧化物酶标记的M13主要外壳蛋白抗体，室温孵育一小时。然后按所示方法洗涤平板三次，每孔加入100 µL TMB底物溶液，室温孵育10分钟，或直至观察到明显的颜色变化。然后每孔加入100微升1摩尔的盐酸终止反应，并在分光光度计上于450纳米处读取吸光值。在完成锚定结合剂验证后，还应使用相同的蛋白质文库对锚定结合剂-配体复合物进行二聚化结合剂筛选。经过四到六轮筛选后典型的富集结果可很好地表明亚文库中潜在阳性克隆的比例较高，此时可能无需进行更多轮次的筛选。单克隆ELISA适用于分析锚定结合物和二聚化结合物的相对结合亲和力与选择性，并有助于比较不同克隆之间的结合选择性。同样，二聚化结合物筛选能够鉴定出仅在有或无配体存在时与固定的锚定结合物形成异源二聚体的克隆。这些依赖于配体浓度的结合数据表明，与对照样本表现出的弱结合相比，所测试的纳米抗体更适合用于构建化学诱导二聚化系统。此外，可采用分析型尺寸排阻色谱法，在配体存在的情况下确认锚定蛋白与二聚化结合物之间形成的异源二聚体。例如，在本实验中，当锚定蛋白、二聚化结合物与大麻二酚共同混合时，观察到一个二聚体峰；相比之下，在缺乏大麻二酚的情况下，或当各个结合物单独上柱时，均未检测到二聚体峰。应将蛋白质二聚化系统在酵母或哺乳动物细胞中进行基因编码，以进一步验证所选生物传感器在体内应用中的可行性。我们期望该方法能够为其他研究人员提供有效且必要的工具，用于在活体环境中以高时空分辨率检测重要的代谢物、信号分子或药物。

creating-highly-specific-chemically-induced-protein-dimerization

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过组合单域抗体库的分步噬菌体选择创建高度特异性化学诱导蛋白分解系统

在本视频中，我们演示了噬菌体展示技术，用于分离表达对目标蛋白具有高亲和力蛋白的预先改造噬菌体。...

利用噬菌体展示技术筛选高亲和力靶蛋白的蛋白质

噬菌体展示是一种强大的技术，可用于捕获与固定化目标分子相互作用的蛋白质或蛋白质片段。在确定了要构建和筛选的噬菌体cDNA文库类型后，本文所述方案可实现高效的亲和筛选，从而鉴定出相互作用分子。...

使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。...

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

我们提供一种方法，利用大肠杆菌（Escherichia...

用于筛选抗体片段文库的细菌内膜展示技术

本文所述方案可用于构建、表征和筛选（针对特定目标）来源于任意DNA样本的“"结构域组"文库。该流程通过整合多种技术实现：噬菌体展示技术、折叠报告系统、高通量测序以及用于数据分析的网络工具。...

相互作用组测序：通过噬菌体展示与下一代测序进行结构域组文库构建、验证与筛选的实验方案

本方案详细描述了构建具有定制多样性的噬菌体展示合成抗体文库的步骤。合成抗体在基础研究、疾病诊断和治疗中具有广泛的应用。...

构建具有定制多样性的合成噬菌体展示Fab文库

本研究旨在提出一种用于鉴定药物-肽相互作用的策略。该策略基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器进行识别药物的短肽的生物筛选，随后通过生物信息学分析，对获得的药物识别信息及蛋白质上药物结合位点的注释进行定量评估。...

基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰，其失调与多种人类疾病相关。本方案详细介绍了如何利用噬菌体展示技术分离新型泛素变体，这些变体能够结合并调控E3连接酶的活性，从而控制泛素化的特异性、效率和修饰模式。...

利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

本文介绍一种通过基因编码将含叠氮基团的氨基酸引入抗体片段，并利用应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）将该叠氮基团与化学探针特异性偶联，从而在特定位点引入化学探针的实验方案。...

高效且位点特异的抗体标记通过张力促进的叠氮-炔烃环加成反应

本方案描述了一种检测蛋白质与丝状肌动蛋白（F-actin）共沉淀能力的方法，若观察到结合，则可进一步测定该相互作用的亲和力。...

通过共沉淀法测定蛋白质与F-肌动蛋白的结合

了解如何通过噬菌体展示单域抗体库的分步选择方法，构建高度特异性化学诱导蛋白二聚化系统，用于实时监测细胞代谢物并化学调控细胞行为。该方法无需专用设备，成本效益高。

通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

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