通过微分试穿素生成马赛克乳腺有机体

我们的方法很重要，因为它允许研究人员分离和操纵不同的细胞类型，以调查他们个人血统对组织形式和功能的贡献。此技术是分离细胞类型的温和而有效的方法，因此，为 3D 培养保留了细胞的完整性。该技术还可以应用于其他系统，以分离没有良好特征的生物标志物的细胞。

要从一只10到14周大的雌性小鼠中收获二号、三、四和五个乳腺，首先在两只后肢之间的中线做一厘米的切口。将切口延伸到颈部，从中线切口向四肢进行小的横向切口。然后伸展教的皮肤，然后用针固定在动物的每一侧。

使用钳子，从四号腺体收集淋巴结。要切除乳腺，请使用锋利的剪刀切割每个组织区域，将组织放在50毫升的4摄氏度DMEM-F12中，并在收获时补充5%FBS和抗生素抗霉菌。当所有组织都收集好时，切开腺体，直到碎片能够通过一毫升移液器尖端轻松安装，必要时旋转板，使所有组织均匀地切碎。

然后在3毫升消化介质中将片段转移到一个六井低粘附盘中的一个井中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下14小时。第二天早上，用一毫升微移液器轻轻移液组织10次，将组织片段转移到15毫升管中。通过离心收集组织，并在五毫升新鲜DPBS中重新供应颗粒。

通过预湿 70 微米尼龙细胞过滤器过滤悬浮液，每次洗涤 10 毫升 37 摄氏度 DMEM-F12 冲洗滤株中的管四次。要释放组织片段，请用戴手套的手指握住过滤器标签，并在 60 毫米组织培养皿上反转应变器。通过四个一毫升的维护介质等同通过过滤器的底部，并快速检查培养皿中单细胞、脂肪液滴和在倒置显微镜下污染组织。

然后将盘子放在细胞培养箱中24小时，让组织片段粘附在培养皿上并生成双层片段。要将肌皮细胞与发光上皮细胞分离，请用一毫升的DPBS冲洗盘子，然后向细胞中加入一毫升新鲜0.5%的尝试素-EDTA。在倒置显微镜下仔细监测消化。

耳皮细胞的外层将在三到六分钟内开始分离。当脑皮细胞分离时，将上根转移到含有 DPBS 中 10%FBS 两毫升的 15 毫升管中。在不干扰发光上皮细胞的情况下，用两毫升的DPBS轻轻冲洗盘子，然后向剩余的细胞中加入一毫升的三辛-EDTA。

7至15分钟后，用PBS中两毫升10%FBS的酶反应淬火，将细胞转移到新的15毫升管中。在差异性尝试中密切监测细胞，不要过度消化细胞，这一点至关重要。收集两个分数后，将细胞离心，以去除任何残留分离试剂，并在每管250微升维护介质中重新喷洒颗粒。

计数后，将每个细胞组稀释至新鲜维持介质中每个井浓度的1.2倍至4个细胞。在 DMEM-F12 中加入 90 微升 50% 的细胞外基质，在八井室幻灯片的每个井中加入无酚红色。当所有孔都涂覆后，将细胞培养箱中的基层凝固30分钟。

在这种聚合过程中，通过离心收集细胞分数，并在每井90%生长介质中，在100微升10%的细胞外基质中重新计算细胞分数。接下来，在每个井中加入100微升每个细胞悬浮液，让共培养在细胞培养孵化器中沉淀20分钟。在孵化结束时，在每个腔室壁的一侧小心地添加100微升生长介质，并将幻灯片返回细胞培养箱。

每24小时对细胞进行成像，以跟踪细胞的生长，每两到三天轻轻更新生长介质。为了修复用于免疫的器官，在适当的实验时间点，小心地从每张幻灯片中吸出介质进行成像，并用每口井的 200 微升 DPBS 冲洗每口井。在室温下用200微升4摄氏度的半甲醛固定器官10分钟，然后用200微升0.2%甘氨酸在室温下处理，每井用0.2%甘氨酸处理30分钟。

在孵化结束时，在室温下用0.25%三吨X-100渗透器官10分钟，然后阻断与5%驴血清或与DPBS中二次抗体品种相匹配的特异性血清，用摇摆进行一小时。然后在 DPBS 中 1%驴血清中隔夜在 4 摄氏度下摇动，用 125 到 200 微升的适当原抗体标记细胞。第二天早上，用200微升的DPBS加三吨X-100洗两次井，然后用适当的荧光结合二次抗体标记器官，在室温下45分钟，并防震防光。

然后用新鲜的 DPBS 加三吨 X-100 洗两次，根据标准方案通过荧光显微镜对器官进行演示和图像。经过24小时的孵育，纯化的上皮片段粘附在培养皿的底部，形成扁平的煎饼样结构，外层有骨髓细胞，包围着发光上皮细胞的内层。三辛治疗以差异方式分离细胞，首先分离肌皮细胞，并出现为明亮的圆形细胞，包围剩余的长方体发光上皮细胞的核心。

根据两个群体内的角蛋白-14和E-cadherin表达的评估，两个细胞室的整体纯度约为90%。在50%细胞外基质基座上培养10%细胞外基质10天后，骨髓发光上皮细胞器官形成具有发达流明的大型分支结构。第五天与道洛形成介质的分化诱导形成更大、更含分枝的含牛奶有机体。

收集上皮时，必须记住小心清洗过滤器，以确保没有频闪污染物。为了查询基因表达的变化，研究人员可以通过使用恢复溶液从细胞外基质中释放RNA从器官中收集RNA。甲状甲醛被认为是危险的，研究人员使用个人防护设备，在使用这种试剂时，应在烟罩内工作。