Name: 通过微分试穿素生成马赛克乳腺有机体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学习使用差异胰蛋白酶消化法分离乳腺肌上皮细胞和管腔上皮细胞，建立三维类器官培养系统。该技术可保持细胞完整性，适用于研究乳腺发育生物学及组织功能。

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我们感谢 Ben Abrams 提供的技术支持，以及加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）干细胞生物学研究所（IBSC）提供的核心设施支持。我们感谢 Susan Strome 和 Bill Saxton 提供 Solamere 转盘共聚焦显微镜的使用权限。本研究部分得到了以下资助：通过詹姆斯·H·吉利阿姆高级研究奖学金项目（S.R.）由霍华德·休斯医学研究所向加州大学圣克鲁兹分校提供的资助；美国国立卫生研究院（NIH GM058903）支持的学生发展最大化计划（H.M.）；美国国家科学基金会研究生研究奖学金（O.C. DGE 1339067）；以及加州大学癌症研究协调委员会（UC-Cancer Research Coordinating Committee）提供的资助（A18-0370）（LH）。

本文所述所有方法均已获得加州大学圣克鲁兹分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 第1天：乳腺组织消化
<ol>
	<li>准备从 10 至 14 周龄的成年雌性小鼠中采集乳腺组织。
	<ol>
		<li>在开放工作台面、无菌条件下进行组织采集操作。</li>
		<li>所有手术器械、软木板和大头针均需经高压灭菌，并在手术前用 70% 乙醇浸泡 20 分钟以消毒。</li>
		<li>使用 0.5 mL 胰岛素注射器经腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为 0.06 mg/g 体重的 2 倍麻醉量）对动物实施麻醉。</li>
		<li>通过轻捏动物脚趾以检测反射反应，监测麻醉深度，仅在动物完全麻醉后开始后续操作。</li>
		<li>将动物仰卧位固定于软木板上，四肢用大头针固定，并用乙醇擦拭其腹部和胸部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为从小鼠单侧获取第 2、3、4 和 5 对乳腺（即共 8 个乳腺，图 1A），首先识别后肢之间的中线，使用锋利剪刀在腹部皮肤上做一小切口（1 cm），然后沿中线向上延伸至颈部18。</li>
	<li>随后向四肢方向做横向小切口，以便使用棉签松解皮肤。将皮肤拉开并绷紧后，固定于软木板一侧（图 1B，步骤 1）18。在乳腺下方剪切以分离组织，并从第 4 对腺体中去除淋巴结（图 1B，步骤 2、3）18。在身体另一侧重复相同操作。</li>
	<li>将采集的乳腺组织收集至含有 50 mL 4 °C 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）/F12 营养混合物（F12），并补充 5% 胎牛血清（FBS）和 1× 抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti）的容器中18。</li>
	<li>使用剃须刀片或组织切片器在 35 mm 培养皿或陶瓷板上将腺体组织切碎。每手动切 5 次或组织切片器完成一圈后旋转一次板面，直至组织碎片可轻松通过 1 mL 微量移液器吸头（约 0.1 mm/片段，图 1C）。</li>
	<li>将乳腺组织置于消化液（见 表 1）中，在 37 °C、5% CO2 条件下，于 6 孔低吸附培养板中消化 14 小时。</li>
</ol>
2. 第2天：乳腺上皮组织片段的分离
<ol>
	<li>消化14小时后，使用1 mL微量移液器轻轻吹打消化后的组织10次，以分解任何残留的间质或脂肪组织，确保不产生气泡或施加过大的机械力。 
	注意：如果在14小时后消化不完全，可能是由于剪切DNA的积累。此时，每2 mL消化培养基中加入1 µL浓度为1 mg/mL的脱氧核糖核酸酶I（DNase I），在37 °C、5% CO2条件下再孵育30分钟。</li>
	<li>将组织收集至15 mL离心管中，并用2–3 mL不含Ca2+和Mg2+的组织培养级1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗用于消化的孔。在600 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>吸除含有脂质层和培养基的上清液，然后将沉淀物重悬于5 mL DPBS中，并转移至新的15 mL离心管中。在600 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>在离心过程中，将一个70 µm尼龙细胞筛网置于50 mL离心管上，并用10 mL 37 °C的DMEM/F12预润湿筛网。</li>
	<li>使用5 mL DPBS重悬步骤2.4中的组织碎片，并将悬液通过预润湿的70 µm尼龙细胞筛网，以去除间质细胞和单个细胞（图1D）。</li>
	<li>收集筛网上残留的组织碎片，并用10 mL 37 °C的DMEM/F12冲洗4次（图1D）。 
	警告：冲洗不充分会导致非上皮细胞污染培养物。</li>
	<li>戴上手套，用手指握住筛网标签，将筛网倒置在60 mm组织培养皿上方，分4次每次1 mL将维持培养基（见表1）从筛网底部冲过，以释放组织碎片（图1E）。</li>
	<li>检查筛网上是否有组织碎片残留（肉眼可见），如果仍有碎片附着在筛网上，则再用1 mL维持培养基冲洗1次。冲洗后的组织碎片应已无间质细胞。</li>
	<li>迅速在倒置显微镜下（4×或10×物镜，图1F）检查步骤2.9所得含MG碎片的60 mm培养皿。通常8个MG可获得约500个碎片。观察是否存在单个细胞或脂肪滴，以及是否有污染细胞。 
	注意：若存在污染细胞，应使用5 mL移液器从60 mm培养皿中收集培养基和碎片，再次通过新的70 µm筛网过滤，并重复步骤2.6、2.8–2.10。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，使组织碎片贴壁并形成双层结构的碎片（图2A）。 
	注意：若24小时后碎片仍未沉降，应继续孵育直至贴壁。若碎片贴壁不良，则细胞区室的分离将无法成功。若研究人员对贴壁情况有顾虑，可对组织培养板进行处理以促进碎片附着（例如使用多聚-L-赖氨酸）。</li>
</ol>
3. 第3天：肌上皮细胞与腔上皮细胞的差异性胰蛋白酶消化
<ol>
	<li>为分离 MyoECs 与 LECs，先弃去培养皿中的培养基，用 1 mL DPBS 洗涤一次，随后加入 1 mL 新鲜的胰蛋白酶-EDTA（0.05%），并在倒置显微镜下（10X 或 20X 物镜，图 2B,C,F）密切观察消化过程。外层 MyoECs 的脱落通常需要 3–6 分钟，具体时间取决于胰蛋白酶-EDTA（0.05%）的活性强度。 
	注意：请参见 图 2 中展示该过程的代表性图像。在明场照明下，MyoECs 呈圆形，亮度较高，而仍附着于中央区域的 LECs 则显得较暗。</li>
	<li>将 MyoEC 组分收集至含有 2 mL 10% FBS/DPBS 的 15 mL 离心管中。在不扰动 LECs 的前提下，用 2 mL DPBS 轻柔冲洗 60 mm 培养皿，然后弃去 DPBS（图 2H-I）。 
	注意：MyoECs 的常规回收数量范围为 (3.5 × 106–1.5 × 106)，具体取决于 MGs 的大小。</li>
	<li>为去除 LEC 组分，再次向培养皿中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），孵育 7–15 分钟，并密切监测以防止过度消化。用 2 mL 10% FBS/DPBS 终止培养皿中的胰蛋白酶-EDTA（0.05%）反应。将 LEC 组分收集至新的 15 mL 离心管中。 
	注意：LEC 的常规回收数量范围为 (2 × 106–4.2 × 106)，具体取决于 MGs 的大小。通常情况下，通过免疫组织化学检测，两种组分的纯度均约为 90%19（图 2E）。</li>
	<li>将每种组分在 300 × g 条件下离心 5 分钟，以去除胰蛋白酶-EDTA（0.05%）。将沉淀重悬于 250 µL 维持培养基中，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对各细胞群体进行计数。计数期间将细胞置于冰上保存。 
	注意：若需对细胞组分进行遗传操作，可将原代细胞培养于低黏附性培养皿中，并用慢病毒进行感染20。</li>
</ol>
4. 第3天：将细胞组分与细胞外基质混合并包埋
注意：一旦收集并计数了 MyoEC 和 LEC 细胞组分，即可将它们混合。典型的 MyoEC/LEC 比例为 1:3（图 3A）19。可开展不同的研究。例如，为了进行嵌合体研究，可从野生型（WT）和突变型（Mut）小鼠中分别获取细胞组分并进行组合（MyoEC/LEC：WT/WT；WT/Mut；Mut/WT；Mut/Mut）21，或以不同的 MyoEC/LEC 比例组合细胞组分19。
<ol>
	<li>根据细胞计数，计算需要准备的孔数（8孔板，参见材料表），每孔接种12,000个细胞（例如，3,000个MyoECs和9,000个LECs）。</li>
	<li>通过向每个孔中加入90 µL的50% ECM（50% ECM/50% DMEM/F12，不含酚红—参见材料表）建立3D培养的基础层。确保无气泡产生，且孔壁均匀覆盖。将载玻片置于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟，使基础层固化。 
	注意：ECM在此步骤前需始终保持冰上低温，否则会提前聚合，导致基础层覆盖不均和聚合异常。使用基础ECM层可促进类器官在单一平面上生长，有利于图像采集，同时还能加快类器官生长速度并减少ECM用量22。</li>
	<li>在聚合过程中，准备细胞混合液。将MyoEC和LEC组分在300 x g条件下离心5分钟，分别重悬于10% ECM/90%生长培养基中，使每孔加入体积为100 µL（生长培养基的配制方法见表1）。 
	注意：为便于操作，相同细胞混合比例的孔可使用同一管混合液进行重复设置。可将多个孔所需的细胞混合液合并至同一离心管中配制（例如，4个相同细胞混合比例的孔可在400 µL的10% ECM/90%生长培养基中统一配制）。</li>
	<li>向每个孔中加入100 µL含细胞的10% ECM/90%生长培养基，于37 °C、5% CO2条件下静置20分钟，使类器官沉降。</li>
	<li>待细胞沉降后，沿每个孔的腔室壁轻轻加入100 µL生长培养基。将载玻片置于37 °C、5% CO2条件下孵育（每个孔的完整组成参见图3A）。 
	注意：Rho激酶抑制剂、R-spondin和Nrg1是已被证实对源自原代小鼠乳腺细胞和人乳腺癌细胞的类器官长期培养至关重要的因子13,14。此外，干细胞因子B27和N2可延长类器官的培养时间。</li>
	<li>每隔24小时对细胞进行成像以监测其生长情况，并每隔2–3天轻柔更换培养基，每次每孔加入100 µL（参见图3B–E）。 
	注意：更换培养基时需格外小心。倾斜腔室载玻片，使培养基汇集至孔的一角。吸取≤100 µL旧培养基后，小心补充新鲜培养基，避免扰动ECM层。</li>
	<li>若研究人员希望研究泌乳/腺泡形成过程，可在第5天更换为腺泡形成培养基（参见表1），并继续每隔2–3天更换培养基，直至第10天（参见图3F）或更长时间，之后可通过传代继续培养（使用回收溶液，参见材料表）13。 
	注意：此时可通过在4 °C条件下向每孔加入400 µL的4 °C回收溶液并孵育，将类器官从ECM中分离（具体操作步骤和试剂信息参见材料表）。</li>
</ol>
第5天或第10天：类器官的固定与免疫染色
<ol>
	<li>用移液器小心吸去培养基（使用球形移液器效果最佳）。每孔使用 200 µL 的 1× 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS，参见配方）清洗一次。</li>
	<li>使用预冷（4 °C）的 4%（w/v）多聚甲醛（PFA，参见配方）在室温下固定类器官 10 分钟。 
	警告：PFA 具有危害性。请穿戴个人防护装备（实验服、手套和护目镜）。此步骤应在通风橱内进行。 
	注意：PFA 处理会溶解细胞外基质（ECM）。若 ECM 去除不完全，在通过免疫荧光分析类器官时可能导致背景染色。</li>
	<li>吸去 4% PFA，每孔加入 200 µL 的 0.2%（w/v）甘氨酸/DPBS（参见 表 1）。将培养板置于摇床上，在室温孵育 30 分钟，或在 4 °C 过夜，摇床设置为低速振荡。 
	注意：类器官可在下一步操作前于 4 °C 的 DPBS 中保存 1–3 天。</li>
	<li>使用含 0.25% Triton X-100 的 DPBS（PBST，参见 表 1）在室温下对类器官进行 10 分钟的透化处理。</li>
	<li>在摇床上使用含 5% 驴血清（DS）（或其他与二抗宿主物种匹配的血清）的 DPBS 封闭类器官 1 小时。 
	注意：此步骤也可在 4 °C 的摇床上过夜进行。</li>
	<li>将一抗用含 1% DS 的 DPBS 稀释配制，每孔加入 125–200 µL。将类器官置于摇床上，于 4 °C 与一抗孵育过夜，完成免疫染色。</li>
</ol>
6. 第11天：完成免疫荧光染色
<ol>
	<li>用 200 µL PBST 每孔洗涤 2 次，每次 5 分钟。在 1% DS/DPBS 中加入二抗，每孔 125–200 µL。在摇床上室温孵育 45 分钟。</li>
	<li>每孔使用 200 µL PBST 洗涤 2 次。</li>
	<li>使用 Hoechst DNA 染料（以 DPBS 1:2,000 稀释）在室温下对细胞核染色 5 分钟。</li>
	<li>用真空泵轻轻吸去孔中残留的所有液体。</li>
	<li>小心移除培养腔和垫圈，在每孔和盖玻片上各加一滴（约 30 µL）封片剂（见材料表），注意去除气泡。将载玻片置于避光处干燥 1–2 天，用透明指甲油封片。在共聚焦显微镜下观察类器官（图 3E-F）。</li>
</ol>

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<li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用原代乳腺腺泡细胞（MG细胞）生成三维类器官培养物的方法。本方法与其他方案的不同之处在于，我们详细描述了一种分离两种不同MG细胞区室的技术：外层的基底肌上皮细胞（MyoECs）和内层的腔上皮细胞（LECs）。我们的方法采用两步法胰蛋白酶-EDTA（0.05%）处理，称为差异胰蛋白酶消化法19。该程序使研究人员能够在无需使用复杂的流式细胞术的情况下分离MyoECs和LECs，因此可用于研究从多种哺乳动物物种中获取的乳腺组织，尤其适用于那些缺乏FACS所需明确生物标志物的物种。能够分离这两种细胞亚群，使研究人员可以独立地对分离的细胞进行遗传修饰，或将携带遗传突变或标记的动物来源的细胞重新组合，从而在三维培养中生成嵌合类器官。当前方案的一个局限性在于培养条件中未包含间质成分。然而，目前已有新的方法正在开发中，旨在将间质成分与来源于原代细胞或细胞系的类器官共培养，以更真实地模拟体内细胞外基质（ECM）23,24,<sup class="xref...

乳腺（mammary gland, MG）是一种树状的管状上皮结构，嵌于富含脂肪细胞的间质组织中。双层导管上皮由外层基底部位的收缩性肌上皮细胞（myoepithelial cells, MyoECs）和内层围绕中央管腔的腔面分泌性上皮细胞（luminal epithelial cells, LECs）构成。1哺乳期间，当外层肌上皮细胞（MyoECs）收缩以挤压内层腺泡腔上皮细胞（LECs）中的乳汁时，乳腺在多种生长因子（如EGF和FGF）和激素（如孕酮、胰岛素和催乳素）的调控下发生一系列变化。这些变化促使特化结构——腺泡的分化，从而在哺乳期合成并分泌乳汁。1乳腺上皮可通过实验操作进行干预，方法是将上皮组织碎片、细胞甚至单个基底细胞移植到宿主乳腺脂肪垫中（该脂肪垫已预先清除内源性乳腺实质），并使其生长以重建完整的功能性上皮树状结构2,3,4,5移植是一种强大的技术，但如果突变导致早期胚胎致死（早于E14期），从而无法获取可移植的乳腺原基，则该方法耗时且不可行。此外，研究者常常希望探究来源于谱系受限前体细胞的两个不同区室各自的功能。虽然Cre-lox技术可实现对肌上皮细胞（MyoECs）和腔上皮细胞（LECs）的差异性遗传操作，但该方法同样耗时且成本高昂。因此，自20世纪50年代以来，研究者一直采用体外乳腺类器官作为相对简便且高效的研究乳腺组织结构与功能问题的手段。6,7.
在早期描述原代乳腺上皮细胞分离与培养的实验方案中，研究者发现，当乳腺组织碎片在培养皿中生长时，需要一种由血浆凝块和鸡胚提取物组成的基底膜基质（BME）6。在随后的几十年中，人们开发出多种细胞外基质（ECMs），包括胶原蛋白以及由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白基质，以促进三维（3D）培养，并更真实地模拟体内环境7,8,9,10。在三维基质中培养细胞的研究表明，通过多种标准（形态学、基因表达和激素反应性）评估，此类微环境能更准确地模拟体内的生理过程9,10,11,12。利用原代小鼠细胞开展的研究鉴定了维持类器官长期生长和分化所必需的关键生长因子和形态发生因子13。这些研究为本论文所介绍的实验方案奠定了基础，也推动了人乳腺细胞以三维类器官形式进行培养的发展。如今，该技术已成为一种现代临床工具，可用于患者样本的药物筛选和药效测试14。总体而言，类器官培养凸显了原代细胞的自我组织能力，及其在形态发生和分化过程中的重要作用。
本文介绍了一种培养小鼠上皮细胞的方案，这些上皮细胞可分化为产奶腺泡。通过差异胰蛋白酶消化技术，可分离出构成乳腺两个不同细胞区室的肌上皮细胞（MyoECs）和腔上皮细胞（LECs）。分离后的细胞组分可进行遗传操作，以实现基因功能的过表达或敲低。由于谱系内在的自组织能力是乳腺上皮细胞固有的特性15,16,17，将这些细胞组分重新组合可使研究人员生成具有双层结构的嵌合类器官。我们首先通过酶消化去除脂肪组织，然后将乳腺组织片段置于组织培养皿中孵育24小时（图1）。组织片段会以体内原有的双层结构沉降到聚苯乙烯培养皿上：外层为肌上皮层，包围着内部的腔上皮层。这种细胞排列方式使得通过胰蛋白酶-EDTA（0.05%）处理3–6分钟即可分离外层MyoECs，随后再进行一轮胰蛋白酶-EDTA（0.05%）处理，以解离剩余的内层LECs（图2）。因此，利用这两种细胞对胰蛋白酶敏感性的差异，可实现它们的分离，并随后混合后接种于细胞外基质（ECM）中（图3）。细胞将自发进行自组织，形成由外层MyoECs包围内层LECs的双层球状结构。在含有多种生长因子混合物的培养基中（见“生长培养基”配方）培养时，随着细胞生长将形成管腔结构13。培养5天后，可通过更换为腺泡生成培养基（Alveologenesis Medium）（见配方及图3F）并继续孵育5天，使类器官进一步分化为产奶腺泡。或者，类器官可在生长培养基中持续扩展和分支，至少维持10天。类器官可通过免疫荧光染色进行分析（图3D–F），也可使用回收溶液（见材料表）从ECM中释放出来，用于其他分析方法（如免疫印迹、RT-qPCR）。

<table><tbody><tr><td>15 ml 高透明度聚丙烯锥形管（BD Falcon）</td><td>费舍科学</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>24 孔超低吸附培养板（Corning）</td><td>费舍科学</td><td>CLS3473-24EA</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养处理易握式培养皿（BD Falcon）</td><td>费舍科学</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 高透明度聚丙烯锥形管（BD Falcon）</td><td>费舍科学</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养处理易握式培养皿（BD Falcon）</td><td>费舍科学</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 尼龙细胞滤网（Corning）</td><td>费舍科学</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（100X）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15240062</td><td>青霉素/链霉素也可使用</td></tr><tr><td>B27 补充剂（不含维生素 A，50x）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>B6 ACTb-EGFP 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>BD 胰岛素注射器 0.5 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>II 型分散酶（Roche）</td><td>Millipore Sigma</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>III 型胶原酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004206</td><td></td></tr><tr><td>Corning 细胞回收溶液</td><td>费舍科学</td><td>354253</td><td>请遵循使用指南 &amp;ndash; 从 Corning Matrigel 基质中提取三维结构&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Corning Costar 超低吸附 6 孔板</td><td>费舍科学</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12，无酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>DNase（脱氧核糖核酸酶 I）</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 647</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A21447</td><td>使用比例 1:500，批号：1608641，储存浓度 2 mg/mL，RRID:AB_2535864</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-606-150</td><td>使用比例 1:1000，批号：140554，储存浓度 1.4 mg/mL</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12（DMEM/F12）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190-250</td><td>不含 Mg²⁺/Ca²⁺</td></tr><tr><td>EGF</td><td>费舍科学</td><td>AF-100-15-100ug</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>VWR</td><td>97068&amp;ndash;085</td><td>100% 美国来源，优级，批号：059B18</td></tr><tr><td>Fluoromount-G（Southern Biotech）</td><td>费舍科学</td><td>0100-01</td><td>文中称为封片介质</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>费舍科学</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗 WAP</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-14832</td><td>使用比例 1:250，批号：J1011，储存浓度 200 &amp;micro;g/mL，RRID:AB_677601</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AnaSpec</td><td>AS-83218</td><td>使用比例 1:2000，储存浓度 20 mM</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6634-100mg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>费舍科学</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH₂PO₄</td><td>费舍科学</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>KRT14&amp;ndash;CreERtam</td><td>杰克逊实验室</td><td>5107</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型 Matrigel（GFR）；无酚红；10 mL</td><td>费舍科学</td><td>CB-40230C</td><td>批号：8204010，储存浓度 8.9 mg/mL</td></tr><tr><td>MillexGV 滤器单元 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ SLIDE 8 孔玻璃载片，无菌</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td>此类腔室载片非常适合垫圈移除，但其他品牌也可使用（例如 Lab Tek II）。</td></tr><tr><td>小鼠抗 SMA</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2547</td><td>使用比例 1:500，批号：128M4881V，储存浓度 5.2 mg/mL，RRID:AB_476701</td></tr><tr><td>N-2 补充剂（100x）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>费舍科学</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>NaH₂PO₄</td><td>费舍科学</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Nrg1</td><td>R&amp;D</td><td>5898-NR-050</td><td></td></tr><tr><td>绵羊垂体催乳素</td><td>国家激素与肽项目</td><td></td><td>从 Harbor-UCLA 研究与教育研究所的 Dr. Parlow 处购买</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Millipore Sigma</td><td>PX0055-3</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>R26R-EYFP</td><td>杰克逊实验室</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>Rho 抑制剂 Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>费舍科学</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>无菌过滤驴血清</td><td>Equitech-Bio 公司</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>无菌过滤驴血清</td><td>Equitech-Bio 公司</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>x100-500ML</td><td>实验室级</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA 0.05%</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25300-062</td><td></td></tr></tbody></table>

通过差异性胰蛋白酶消化法生成嵌合型乳腺类器官

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

类器官是一种可自我组织的三维组织结构，能够在培养皿中模拟生理过程。小鼠乳腺由两种功能不同的上皮细胞区室组成：外层具有收缩功能的肌上皮区室和内层具有分泌功能的腔面上皮区室。本文介绍一种方法，可分离构成这两个区室的细胞，并将其重新组合，以研究它们在乳腺形态发生和分化过程中各自的谱系贡献。该方法简便高效，无需使用流式细胞分选等复杂的分离技术。具体而言，我们首先收获组织并进行酶消化，将上皮细胞接种于贴壁培养皿中，然后利用差异胰蛋白酶消化法，以约90%的纯度将肌上皮细胞与腔面上皮细胞分离。随后将细胞接种于细胞外基质中，使其自组织形成具有双层结构的三维（3D）类器官，并在培养10天后可诱导其分化产生乳汁。为研究基因突变的影响，可从小鼠野生型或基因工程小鼠模型中获取细胞，也可在进行三维培养前对细胞进行基因操作。该技术可用于构建嵌合类器官，从而特异性地研究基因在腔面或肌上皮区室中的功能。

本文所述方案介绍了一种利用嵌合类器官研究乳腺上皮细胞特定谱系贡献的方法。为了获得用于类器官培养的原代小鼠细胞，必须首先将乳腺上皮从富含脂肪细胞的间质组织中分离出来（图1）。此过程在此简要描述，亦见于先前发表的研究18。为获得足够数量的细胞，建议切除第2、3、4和5对乳腺组织（图1A）。分离纯上皮细胞群体的关键步骤之一是从第4对乳腺组织中去除淋巴结，因为这些淋巴结富含免疫细胞，会污染样品（图1A,B）。将乳腺组织剪碎，生成约0.1 mm大小的组织碎片（图1B）。随后通过酶消化法处理组织碎片，该过程在胶原酶存在下进行，以使上皮与间质分离，同时避免使用胰蛋白酶，防止降解维持细胞间连接的蛋白（如钙...

乳腺是一种双层结构，由外层的肌上皮细胞和内层的腔面 epithelial 细胞组成。本文介绍了一种利用差速胰蛋白酶消化制备类器官的方案。该高效方法使研究人员能够分别操控这两种细胞类型，以探究它们在乳腺形态与功能中的作用。

类器官是一种可自我组织的三维组织结构，能够在培养皿中模拟生理过程。小鼠……

我们的方法具有重要意义，因为它使研究人员能够分离和操控不同类型的细胞，以研究它们各自在组织形态和功能中的谱系贡献。该技术是一种温和且高效的细胞类型分离方法，因而能够保持细胞的完整性，适用于三维培养。该技术还可应用于其他系统，以分离那些缺乏明确特征生物标志物的细胞。从一只10至14周龄的雌性小鼠中分离第二、第三、第四和第五对乳腺时，首先在后肢之间的中线处做一个一厘米长的切口。将切口向上延伸至颈部，并从中线切口处向四肢方向做小的横向切口。然后将皮肤拉紧，并用针在动物两侧固定皮肤。使用镊子采集第四组淋巴结。用锋利的剪刀在每块组织下方剪切以去除乳腺组织，将组织置于含有5% FBS及抗生素-抗真菌剂的50毫升4°C DMEM-F12培养基中，随采集随放入。所有组织采集完毕后，将腺体组织剪碎，直至碎片可轻松通过1毫升移液器吸头，必要时旋转培养板，确保所有组织被均匀剪切。然后将三毫升消化液中的组织碎片转移至六孔低黏附培养板的一个孔中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育14小时。次日早晨，用1毫升微量移液器轻柔吹打组织10次，随后将组织碎片转移至15毫升离心管中。通过离心收集组织，并将沉淀重悬于5毫升新鲜DPBS中。将悬浮液通过预先润湿的70微米尼龙细胞筛过滤，每次用10毫升37摄氏度的DMEM-F12培养基冲洗管子，并在筛中冲洗四次，每次冲洗使用10毫升37摄氏度的DMEM-F12。为释放组织碎片，戴上手套后用手指握住筛网标签，将筛网倒置在60毫米组织培养皿上方。将四份每份1毫升的维持培养基通过筛网底部，然后在倒置显微镜下快速检查培养皿中的单个细胞、脂滴以及污染的组织。然后将培养板放入细胞培养箱中孵育24小时，以使组织碎片贴附于培养皿并形成双层结构。为分离肌上皮细胞与腔面上皮细胞，先用1毫升DPBS冲洗培养皿，再加入1毫升新鲜的0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液。在倒置显微镜下密切观察消化过程。肌上皮细胞的外层将在三到六分钟内开始脱落。当肌上皮细胞脱落后，将上清液转移至含有2毫升含10%胎牛血清（FBS）的DPBS的15毫升离心管中。在不扰动管腔上皮细胞的前提下，用2毫升DPBS轻轻冲洗培养皿，然后向剩余细胞中加入1毫升新鲜的胰蛋白酶-EDTA溶液。7到15分钟后，加入含有10%胎牛血清（FBS）的2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）以终止酶促反应，并将细胞转移至新的15毫升离心管中。在差异性胰蛋白酶消化过程中必须密切观察细胞状态，避免消化过度。当收集完两个细胞组分后，离心细胞以去除残留的解离试剂，并将每管细胞沉淀重悬于250微升维持培养基中。计数后，用新鲜维持培养基将每种细胞群体稀释至每孔1.2 × 10⁴个细胞的浓度。向八孔细胞培养腔载玻片的每个孔中加入90 µL不含酚红的DMEM/F12培养基中的50%细胞外基质溶液。所有孔包被完成后，在细胞培养孵箱中孵育30分钟，使底层基质

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

通过微分试穿素生成马赛克乳腺有机体

采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。...

乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

利用完整的组织类器官进行原代细胞培养，提供了一种模拟多细胞体内微环境的模型系统。我们建立了一种无血清的原代乳腺上皮组织培养模型，该模型可在不进行酶解组织解离的情况下长期维持混合细胞谱系，并表现出分化形态。乳腺类器官的存活时间可超过&gt;6个月。...

非侵袭性乳腺病变的非酶解、无血清组织培养以自发生成乳腺球

本方案描述了从非贴壁/间充质型乳腺上皮细胞中分离、定量和表征细胞外囊泡（EVs）/外泌体的方法，并介绍了利用这些囊泡将乳腺腺体形成能力转移至管腔型乳腺上皮细胞的技术。来源于具有干细胞样特性的乳腺上皮细胞的EVs/外泌体，能够将此类细胞特性传递给摄取这些EVs/外泌体的细胞。...

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无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

本文提供了一种从患者来源的乳腺肿瘤切除组织或正常乳腺组织建立人乳腺类器官的详细方案。该方案提供了培养、冻存和复苏人源性乳腺类器官的全面分步操作指南。...

建立和培养患者来源的乳腺类器官

该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立，到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的遗传特征，再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内...

由小鼠输卵管上皮细胞建立类器官系用于高级别浆液性卵巢癌建模

本方案描述了一种基于明确成分水凝胶的方法，可在可控的三维培养系统中生成模拟乳腺形态发生关键特征的人类乳腺类器官。...

一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程

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用于肿瘤发病机制中候选协同基因功能基因组学分析的嵌合体斑马鱼转基因技术

学习使用差异胰蛋白酶消化法分离乳腺肌上皮细胞和管腔上皮细胞，建立三维类器官培养系统。该技术可保持细胞完整性，适用于研究乳腺发育生物学及组织功能。

通过差异性胰蛋白酶消化法生成嵌合型乳腺类器官

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