利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

荧光抗生素的制备可通过分光光度法和显微镜等便捷的分析技术，用于评估这些治疗试剂在细菌内的定位情况。该技术的主要优势在于能够简便地确定抗生素的定位位置。这种定位与多种现象相关，包括外排作用。

进行点击A反应操作时，将目标叠氮化物抗生素置于圆底烧瓶中，每毫摩尔叠氮化物加入25毫升叔丁醇和25毫升水。向溶液中加入已制备的荧光染料炔烃，并将反应体系加热至50摄氏度。随后，向烧瓶中加入0.6当量的硫酸铜和2.4当量的抗坏血酸。

将反应搅拌一小时，或直至液相色谱-质谱（LCMS）分析表明反应完成。随后根据抗生素骨架的特性进行冷却和纯化。此处展示了基于环丙沙星、利奈唑胺和甲氧苄啶通过叠氮中间体制备荧光抗生素的关键点击化学反应，并给出了由相应抗生素合成的结构示例。

在环丙沙星叠氮化物与 NBD 炔烃发生点击反应的液相色谱-质谱图谱中，叠氮化物在 3.2 分钟时洗脱，产物在 3.8 分钟时洗脱。通过叠氮化物峰的消失可以追踪点击反应的进程。在这些谱图中，纯化的效果可通过错误峰的消失而得以直观呈现。

为了评估所合成抗生素的抗菌活性，将适用于该抗生素骨架的细菌菌株的甘油保存液划线接种于LB琼脂平板上，并在37摄氏度下培养过夜。次日早晨，从每个平板上挑取单个菌落，分别接种于每份5毫升的CAMHB培养基中，在37摄氏度下过夜培养。第二天，将培养物用新鲜CAMHB培养基稀释约40倍，并将细菌培养至对数生长中期，使在600纳米处的光密度值介于0.4至0.8之间。

接下来，将每种荧光标记的抗生素用含20%二甲基亚砜的无菌水配制成1.28毫克/毫升的储备液，取10微升抗生素加入96孔板第一列的每个孔中。向第一列每个孔中加入90微升CAMHB培养基，其余各列每孔加入50微升。然后在整块板上进行连续的两倍梯度稀释。

充分混匀后，将对数中期培养物稀释至约每毫升1 × 10⁶个菌落形成单位，取每种培养物50 µL加入稀释孔中，使最终浓度约为每毫升5 × 10⁵个菌落形成单位。所有细菌接种完成后，盖上培养板盖子，在37°C静置培养18至24小时。次日，对培养板进行肉眼观察。

最低抑制浓度将是无可见生长的最低浓度孔。对于探针累积分析，将细菌菌株的甘油保存液划线接种于LB琼脂平板上，在37摄氏度下过夜培养。次日早晨，从平板上挑取单个菌落，接种于LB液体培养基中，在37摄氏度下过夜培养。

第二天早晨，将过夜培养物用新鲜培养基稀释约50倍。当培养物达到对数中期时，通过离心收集细菌并弃去上清液。用一毫升磷酸盐缓冲液重悬细菌，再次离心。

弃去上清液，将洗涤后的菌体沉淀重悬于PBS中，调节其在600纳米处的光密度至2。向1毫升细菌悬液中加入10.1微升溶于PBS的10毫摩尔CCCP，于37摄氏度孵育10分钟。孵育结束后，通过离心收集细菌，并将沉淀重悬于1毫升含10至100微摩尔荧光标记抗生素的PBS溶液中。

在37摄氏度孵育30分钟后，每次用1毫升冷PBS洗涤细胞，共离心洗涤四次。洗涤后，加入180微升裂解缓冲液和70微升溶菌酶裂解细菌。在37摄氏度孵育30分钟后，将细菌在-78摄氏度冷冻5分钟和34摄氏度融化15分钟，重复冻融三次。

经过最后一轮冻融后，将样品超声处理20分钟，随后在65摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，通过离心收集裂解后的样品，并将管内液体通过10千道尔顿的滤膜进行过滤。每次用100微升水洗涤滤膜共四次，并将每次洗涤液分别分装至黑色平底96孔板的各个独立孔中。

然后使用酶标仪测量荧光强度，选择与所用荧光染料相匹配的激发波长和发射波长。这些通过荧光光谱法评估外排泵存在与缺失条件下细菌内药物蓄积的典型结果表明，经CCCP预处理后，细菌内的荧光强度显著升高，提示外排泵会降低抗生素在细菌内的蓄积。在这些代表性的共聚焦显微镜图像中，可观察到经CCCP处理后，抗生素在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌内的定位情况。

当未添加CCCP时，不会观察到这一现象。使用荧光标记的抗生素时，需明确希望获取的信息，并在获取数据时充分考虑哪种实验方案最为适用。荧光标记的抗生素合成后，可用于研究多种细菌过程，包括药物靶点相互作用和耐药性修饰。