使用荧光抗生素探针对细菌耐药性的可视化
March 2nd, 2020
荧光标记的抗生素是强大的工具，可用于研究抗菌素耐药性的多个方面。本文介绍了荧光标记抗生素的制备及其在细菌中抗生素耐药性研究中的应用。探针可用于通过分光光度测定法、流式细胞测定和显微镜研究细菌抗性机制（例如，排泄物）。
荧光抗生素的制备允许通过光谱光测量和显微镜等方便的分析技术评估这些治疗试剂在细菌中的定位。该技术的主要优点是易于确定抗生素的本地化。这种本地化与包括流水在内的许多现象相关。
要执行单击 A 反应程序，请将感兴趣的 azide 抗生素放在圆形底部烧瓶中，并在烧瓶中加入 25 毫升的三叶草醇和每毫升 azide 25 毫升水。将准备好的氟磷烷加入溶液中，将反应加热至50摄氏度。接下来，在烧瓶中加入0.6个当量的硫酸铜和2.4个当量的抗坏血酸。
搅拌反应一小时或直到 LCMS 的分析表明反应完成。然后冷却和纯化反应，适合抗生素支架。在这里，显示了制备荧光抗生素的关键点击化学反应，并举例说明了从相应抗生素中合成的基于丙丙沙星、线佐利德和三聚氰胺的亚兹德中间体的结构。
在这些液相色谱质谱法中，从丙丙沙星阿齐德和NBD烷基点击反应中，azide在3.2分钟内被洗出，产品在3.8分钟内被洗出。点击反应的进度可以跟随阿齐德峰的消失。在这些光谱中，纯化的影响可以随着错误的峰值消失而可视化。
为了评估合成抗生素的抗菌活性，适合抗生素支架的细菌菌株的条纹甘油储存到LB agar板上，并在37摄氏度下一夜之间生长培养物。第二天早上，从每个板块中挑选一个殖民地，在摄氏37度的每培养量下，以五毫升的CAMHB培养殖民地。第二天，在新鲜CAMHB中稀释培养物约40倍，将细菌生长到中生代阶段，光学密度在0.4至0.8之间，光学密度为600纳米。
接下来，在无菌水中以每毫升1.28毫克的20%二甲基硫化物准备每种荧光抗生素的库存溶液，并在96井板的第一柱中每井加入10微升抗生素。在第一柱的每个油井中添加 90 微升 CAMHB，在所有其他油井中添加 50 微升。然后对板进行连续的两倍稀释。
彻底混合后，将中原相培养物稀释至每毫升形成单位约10倍至第六菌落，并在稀释井中加入50微升，使每毫升形成单位的最终浓度约为5倍10至第五菌落形成单位。当所有细菌都镀上时，将盖子盖在盘子上，在37摄氏度下孵育培养物18至24小时，不摇晃。第二天，目视检查板。
最小抑制浓度将是最低浓度井没有可见的增长。用于探针积累分析，将细菌菌株的条纹甘油储存到 LB agar 板上，在 37 摄氏度下进行夜间孵育。第二天早上，从盘子里挑选一个殖民地，在摄氏37度的利生汤中过夜养殖。
第二天早上，在新鲜介质中稀释了约50倍的过夜文化。当培养达到中日志阶段时，通过离心和蒸馏来使细菌产生颗粒。将细菌重新浓缩在一毫升PBS中，然后再次使细菌离心。
去掉上一个液位，将PBS中洗净的颗粒重新暂停到光学密度的600纳米（两个）。在PBS中加入10.1微升10毫摩尔CCCP，加入1毫升细菌，在37摄氏度下孵育细菌10分钟。在孵育结束时，通过离心收集细菌，并在PBS中10至100微摩尔荧光抗生素溶液中重新中联用颗粒。
在37摄氏度下孵育30分钟后，每次洗涤一毫升冷PBS，通过离心四次清洗细胞。洗涤后，用180微升的解解缓冲液和70微升的解酶来解菌。在37摄氏度下30分钟后，在零下78摄氏度下冷冻细菌3次，分别冷冻5分钟和34摄氏度，冷冻15分钟。
在最后一轮冷冻解冻后，对样品进行20分钟的声波化，随后在65摄氏度下孵育30分钟。在孵化结束时，通过离心收集结石样品，并通过10千吨滤膜对管内层进行应变。每次洗涤时用 100 微升水清洗过滤器四次，每次洗净到黑色平底 96 孔板的单独井中均等。
然后测量板读卡器上的荧光强度，其激发和发射波长与荧光团相同。这些典型的结果，通过荧光光谱评估的荧光光谱在存在和不存在出流表明，细胞内荧光的细菌是明显高于后，预处理与CCCP表明，流流减少细菌内的积累。在这些具有代表性的Gram阳性和Gram阴性细菌的共生显微镜图像中，在CCCP治疗后，可以可视化细菌内抗生素的定位。
未添加 CCCP 时，不会观察到这种现象。使用荧光抗生素时，请注意您要收集哪些信息，并一定要考虑在获取这些数据时哪种协议最有用。合成荧光抗生素后，可用于研究一些细菌过程，包括药物靶点相互作用和耐药性修饰。
概述
本文讨论了用于研究细菌抗微生物药物耐药性的荧光标记抗生素的制备和应用。使用分光光度法、流式细胞术和显微镜等技术来评估抗生素的定位和耐药机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 抗微生物药物耐药性
- 荧光探针
背景
- 抗微生物药物耐药性对于治疗细菌感染构成了重大挑战。
- 荧光标记抗生素可以帮助可视化和研究细菌过程。
- 理解抗生素的定位对于解决耐药机制至关重要。
- 细菌中的外排机制可以减少抗生素的积累。
研究目的
- 准备荧光标记抗生素以研究细菌耐药性。
- 评估抗生素在细菌细胞内的定位。
- 评估外排对抗生素积累的影响。
使用的方法
- 使用点击化学法制备荧光抗生素。
- 通过最小抑菌浓度（MIC）测试评估抗菌活性。
- 使用荧光光谱分析探针积累情况。
- 通过共聚焦显微镜观察抗生素定位。
主要结果
- 成功合成并表征了荧光抗生素。
- 外排机制显著减少了细菌中抗生素的积累。
- 共聚焦显微镜揭示了抗生素的不同定位模式。
- 该研究为细菌耐药机制提供了见解。
结论
- 荧光标记抗生素是研究抗微生物药物耐药性的有价值工具。
- 理解定位和外排可以为治疗策略提供信息。
- 未来的研究可以基于这些发现来开发更好的抗生素。
常见问题
Executive Industry Relevance
Fluorescent antibiotic probes enable direct visualization and quantification of antibiotic localization and accumulation in bacterial cells, providing actionable insights into resistance mechanisms such as efflux. This capability supports mechanistic de-risking and target validation at early discovery and preclinical inflection points. Integrating these probes into R&D pipelines enhances predictive confidence for antimicrobial candidate selection and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antibiotic-bacteria interactions and resistance pathways through direct visualization.
- Supports functional target validation by quantifying intracellular antibiotic accumulation and efflux effects.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between uptake and resistance-driven localization changes.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative readouts for antibiotic activity and localization using spectrophotometry and flow cytometry.
- Enables reproducible assessment of probe accumulation across bacterial strains and resistance phenotypes.
- Supports scalable assay development for high-throughput screening of antibiotic candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking probe localization to resistance mechanisms relevant in clinical isolates.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by enabling mode-of-action studies in disease-relevant bacterial systems.
- Reduces risk of late-stage attrition by providing early evidence of compound efficacy against resistant strains.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescent antibiotic probes fit within the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational research on antimicrobial resistance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibiotic uptake, efflux, and resistance modifications.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Provides fluorescence-based measurements for comparing probe accumulation and localization under different conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to clinically relevant resistance mechanisms and informs biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse antibiotic scaffolds and resistance phenotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in resistance studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of antibiotic localization assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of antimicrobial candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of compounds with favorable resistance profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in click chemistry, fluorescence analytics, and bacterial culture techniques.
- Needs access to spectrophotometry, flow cytometry, and confocal microscopy instrumentation.
- Demands cross-team standardization of probe synthesis, purification, and assay protocols.
- Adaptation may be necessary for different antibiotic scaffolds and bacterial species.
- Consider limitations in probe stability, fluorescence interference, and biological relevance of model systems.
