利用明场显微镜定量斑马鱼幼鱼肝脏大小

该方法提供了一种量化幼年斑马鱼肝脏大小的途径，同时可用于评估基因和药物干预对肝脏生长与发育的影响。该技术能够快速、精确地对肝脏以及肠道和胰腺进行可视化观察和测量。

除了量化肝脏大小外，该解剖方法还有助于为原位杂交或共聚焦成像准备肝脏、肠道和胰腺。在对实验用幼鱼进行去皮操作前，务必先在非实验样本上充分练习，并达到较高的成功率。为了在不干扰周围器官的情况下去除皮肤，准确观察斑马鱼幼鱼和镊子的正确方位与移动至关重要。

在受精后3至7天，处死幼虫后，使用玻璃移液管和移液器泵将最多15只幼虫收集至2毫升离心管中。用1毫升预冷的1×PBS在冰上洗涤幼虫两次。尽可能用玻璃移液管和移液器泵吸除PBS，然后加入1毫升预冷的含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液。

在4°C条件下，至少轻轻摇动孵育过夜。使用玻璃移液管和移液泵从管中吸出PFA，并用1毫升冷PBS清洗三次，每次清洗之间摇动5分钟。

用移液器将数条幼虫转移至9孔圆底玻璃培养皿的一个孔中，加入PBS。在显微镜下，用精细镊子夹住一条幼虫的背部，尽可能轻柔地夹住头部两侧，固定幼虫；然后用另一只手持极精细的镊子，夹住覆盖在心脏上方的皮肤，将其移除。

在培养皿底部，将鱼体左侧或右侧的皮肤斜向尾部方向拉下。另一侧重复此操作。持续抓住皮肤瓣并向下拉扯，直至肝脏表面或附近的全部皮肤及黑色素细胞均被去除。

若受精后5至6天的幼鱼仍存在卵黄，可用精细镊子夹住幼鱼背部，再用极细的镊子轻轻推动卵黄，将卵黄完整剥离。对于3至4天的幼鱼，用精细镊子夹住幼鱼背部，用极细的镊子从腹侧开始轻拂卵黄，将卵黄分块刮除。

使用玻璃移液管和移液泵将解剖后的幼虫放入含有新鲜冷PBS的2毫升离心管中。为固定幼虫，取几毫升3%甲基纤维素置于洁净的塑料培养皿盖上。用玻璃移液管和移液泵将幼虫加入甲基纤维素中，尽量减少随幼虫带入的PBS体积。

在体视显微镜下使用低倍镜，用精细镊子将鱼体摆放至右侧朝下、头部向左的位置。确认待拍摄的鱼体完全对齐，两眼上下重叠。若鱼尾弯曲，可用镊子用力夹断尾部，使其平直放置。

放大至高倍镜，聚焦于肝脏，确保肝脏轮廓清晰可见。按下“捕获图像”按钮拍摄照片并保存文件。对所有鱼重复此操作，确保每张图片的放大倍数相同。

使用相同的放大倍数拍摄千分尺的照片。为了使用程序 R 对所有肝脏图片进行盲化处理，以避免潜在的研究者偏倚并提高科学严谨性，需将文件随机重命名，并创建一个随机化文件，其中包含原始文件名与对应盲化文件名的列表。按顺序打开随机化后的文件，从第一个文件开始。

选择自由选择工具并勾勒出每一份肝脏轮廓。按 Ctrl+M 键测量每份肝脏的面积。对于因残留皮肤、卵黄、失焦或不完整而无法准确测量的肝脏，插入一个占位测量值。

将测量结果保存在文本文件中。为解除盲态并分析数据，在电子表格程序中打开测量文件和随机化文件。在测量文件中插入新列，并利用随机化文件添加盲化文件的原始文件名。

将此文件另存为未设盲测量文件。按原始文件名对数据进行排序。排除图像质量不达标的肝脏测量数据。

如有必要，将测量值转换为所需的平方毫米单位。在图像处理软件中打开比例尺。使用直线工具测量比例尺上的1毫米。

图像处理软件随后以与肝脏相同的单位进行测量，得到一个转换系数。使用该转换系数将“未盲法测量文件”中的测量值进行转换。计算均值和标准差，并计算 P 值。

受精后第六天，非转基因斑马鱼幼鱼的肝脏位于肠道上方，位置和形态均正常。与非转基因同胞相比，转基因斑马鱼的肝脏尺寸显著增大。以下展示了一些成像质量不佳及微米标尺使用不当的示例。

肝脏被皮肤覆盖的幼体、卵黄遮挡肝脏的幼体、部分肝脏被挤压分离的幼体、肝脏移位并脱落的幼体、缺失肝脏的幼体、肝轮廓难以辨认的幼体，以及位置不正确的幼体。在进行该操作时，重要的是使用微小且受控的动作，以防止对肝脏造成损伤。除了明场显微镜观察外，我们还可以将以此方式解剖的幼体用于共聚焦显微镜观察，以可视化荧光报告蛋白或免疫荧光染色，以及用于原位杂交。

甲醛或PFA具有刺激性，且疑似致癌。操作PFA时应佩戴手套，浓溶液应在化学通风橱中处理。