使用光明场显微镜定量拉瓦尔斑马鱼的肝脏大小
February 2nd, 2020
在这里，我们演示了一种量化幼虫斑马鱼肝脏大小的方法，提供了一种评估遗传和药理操作对肝脏生长和发育的影响的方法。
这种方法提供了一种量化幼虫斑马鱼肝脏大小的方法。它还允许评估遗传和药理操作对肝脏生长发育的影响。这项技术提供了一种快速和精确的方式来可视化和测量肝脏以及肠道和胰腺。
除了量化肝脏大小外，这种解剖方法还有助于准备肝脏、肠道和胰腺进行原位杂交或共体成像。在尝试对实验幼虫进行桌面分析之前，请确保在非实验样本上花费大量时间练习，并且具有显著的成功率。要可视化斑马鱼幼虫和钳子的正确方向和运动，以便在不干扰周围器官的情况下去除皮肤，这一点至关重要。
在受精后三至七天，在安乐死幼虫后，使用玻璃移液器和移液器泵在两毫升管中收集多达15个幼虫。用一毫升的冷1XPBS在冰上清洗幼虫两次。使用玻璃移液器和移液器泵清除尽可能多的 PBS，并在 PBS 中加入 1 毫升 4% PFA 的冷液。
在四摄氏度下孵育，至少一夜轻轻的摇动。使用玻璃移液器和移液器泵，从管子上取出 PFA，然后用一毫升冷 PBS 冲洗三次。在冲洗之间摇动五分钟。
在PBS中将几个幼虫放入一个九井圆底玻璃盘的井中。在显微镜下，用细钳子去除肝脏周围的皮肤，将一个幼虫抱在背部，尽可能轻轻地抓住头部两侧。然后用非常精细的钳子在另一只手抓住皮肤只是过度心脏。
对角线向下拉皮，对角向鱼左侧或右侧菜底的鱼尾。对另一侧重复。继续抓皮瓣和拉下，直到所有的皮肤和黑色素覆盖或肝脏附近已被删除。
如果蛋黄在受精后有五到六天的幼虫，则将蛋黄放在一块中，将鱼背上的细钳子抱住，并使用非常细的钳子轻轻搅拌蛋黄。对于三到四个DPF幼虫，用细钳子握住鱼的背部，用非常细的钳子从腹侧开始抚摸蛋黄。把蛋黄刮成碎片。
使用玻璃移液器和移液器泵将解剖的幼虫放入两毫升管中，放入新鲜、冰冷的 PBS 中。要安装幼虫，将几毫升百分之三的甲基纤维素倒在干净的塑料培养皿的盖子上。使用玻璃移液器和移液器泵将幼虫添加到甲基纤维素中，与幼虫一起添加尽可能少的 PBS。
在低放大倍率下的解剖显微镜下，使用细钳来定位鱼，使鱼朝右。确认要拍摄的鱼与一只眼睛直接放在另一只眼睛上完美对齐。如果鱼的尾巴弯曲，用钳子用力捏它来取下尾巴，使鱼平放。
放大到高放大倍率并聚焦在肝脏上，确保肝脏的轮廓清晰可见。按"捕获图像"按钮捕捉图片并保存文件。对所有鱼重复，确保每张图片的放大倍率相同。
使用相同的放大倍率拍摄千分尺的照片。使用程序R来盲化所有肝脏图片，以避免潜在的研究者偏见，并促进科学严谨性，随机重命名文件，并创建一个随机化文件，其中包含原始文件名和相应的盲化文件名的列表。按顺序打开随机文件，从文件 1 开始。
选择手绘选择工具并勾勒出每个肝脏的轮廓。按 Control-M 测量每个肝脏的面积。对于任何无法准确测量的肝脏，因为它们有残留的皮肤，蛋黄，没有焦点，或不完好无损，插入占位符测量。
将测量值保存在文本文件中。要解盲和分析数据，请打开电子表格程序中的测量文件和随机化文件。在测量文件中插入新列，并使用随机化文件为盲文件添加原始文件名。
将此文件另存为"未盲测量"文件。按原始文件名对数据进行排序。排除任何肝脏测量图片不足。
如有必要，将测量值转换为所需的刻度（以平方毫米为单位）。打开图像处理软件中的"缩放"栏。使用直线工具在刻度栏上测量一毫米。
然后，图像处理软件与肝脏以相同的单位进行测量，从而给出转换因子。使用转换系数在"无盲测量"文件中转换测量值。确定平均值和标准差并计算 P 值。
在受精后六天，非转基因斑马鱼幼虫显示出肝脏覆盖肠道的自然位置和形状。与非转基因的兄弟姐妹相比，转基因斑马鱼的肝脏大小显著增加。此处显示了图像和千分尺不足的一些示例。
幼虫用皮肤覆盖肝脏，幼虫用蛋黄遮盖肝脏，幼虫与部分肝脏挤压脱落，幼虫与肝脏脱位脱落，幼虫与缺失的肝脏，幼虫与肝脏轮廓难以识别，幼虫与不当定位。当尝试这个程序时，重要的是使用小和受控的运动，以防止损害肝脏。除了明亮的场显微镜，我们还可以使用这种解剖的幼虫，用于共和显微镜，可视化荧光记者蛋白或免疫荧光染色，以及原位杂交。
甲醛或PFA是一种刺激性物质和疑似致癌物质。处理 PFA 时应佩戴手套，浓缩溶液应在化学烟气罩中处理。
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概览
该方法提供了一种量化幼体斑马鱼肝脏大小的方法，允许评估遗传和药理学操作对肝脏生长和发育的影响。它还便于肝脏、肠道和胰腺的可视化和测量。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 遗传学
背景
- 肝脏大小量化对理解器官发育至关重要。
- 幼体斑马鱼作为发育研究的模型生物。
- 遗传和药理学操作可以影响器官生长。
- 正确的技术对于成功的解剖和可视化至关重要。
研究目的
- 开发一种量化幼体斑马鱼肝脏大小的方法。
- 评估遗传和药理学干预对肝脏发育的影响。
- 为进一步分析技术（如原位杂交）准备器官。
使用的方法
- 解剖幼体斑马鱼以暴露肝脏、肠道和胰腺。
- 用于测量器官大小的可视化技术。
- 在非实验样本上练习以确保技术熟练。
- 解剖过程中的定位和运动控制以避免器官损伤。
主要结果
- 该方法允许快速和精确地测量肝脏大小。
- 便于研究器官发育对操作的响应。
- 为进一步的成像研究提供基础。
- 展示了技术在实验结果中的重要性。
结论
- 该方法有效用于量化幼体斑马鱼的肝脏大小。
- 它支持评估遗传和药理学效应对器官生长的影响。
- 正确的解剖技术对于成功的实验结果至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying larval liver size in zebrafish models enables rapid assessment of drug effects on oncogene-related phenotypes, supporting early-stage target validation in hepatocellular carcinoma research. This method provides predictive confidence by linking genetic or pharmacologic interventions to measurable organ growth changes, informing portfolio triage decisions. The approach supports mechanistic de-risking by offering a quantitative, reproducible readout for pathway modulation in preclinical disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring liver area changes in response to oncogene modulation.
- Operational Value: Provides a rapid, precise quantification method suitable for high-throughput screening of genetic or pharmacologic interventions.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through objective, measurable phenotypes that correlate with disease-related hepatomegaly.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Dissection protocol prepares liver, gut, and pancreas for downstream applications like immunofluorescence and in situ hybridization.
- Reproducibility: Standardized fixation, dissection, and imaging steps ensure consistent liver area measurements across experimental groups.
- Scalability: Method allows processing of up to 15 larvae per tube, supporting batch-wise analysis for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma where hepatomegaly is an early larval phenotype.
- Translational Continuity: Enables seamless transition from discovery to preclinical validation by providing quantifiable organ size data.
- Risk-Adjusted Decisions: Liver size measurements inform go/no-go decisions based on dose-dependent or genotype-dependent growth effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a quantitative bridge between genetic manipulation and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking oncogene expression to measurable liver area changes in larval zebrafish.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (liver area in mm²) that enable reliable comparison across treatment conditions.
- Analytics: Generates measurable data (mean, standard deviation, P-values) suitable for statistical analysis and hit confirmation.
- Translational Research: Connects early phenotypic screening to preclinical continuity through disease-relevant liver hypertrophy readouts.
- Enterprise Reuse: Dissection and imaging workflow is adaptable across multiple organ systems (liver, gut, pancreas) and compatible with multiplexed downstream assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing a direct, quantifiable readout of liver growth in response to pathway modulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through blinded image analysis and scale-bar calibration.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early phenotypic assessment, reducing investment in ineffective targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by identifying compounds or genotypes that significantly alter liver size relative to controls.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, dissection, and brightfield microscopy to avoid tissue damage.
- Depends on instrumentation including dissecting microscopes, glass pipettes, forceps, and image processing software (e.g., R, ImageJ).
- Necessitates cross-team standardization of dissection technique, file blinding, and measurement protocols to minimize investigator bias.
- Adaptation considerations include adjusting dissection timing based on larval age (3–7 dpf) and yolk presence.
- Practical limitation: Liver area measurement may underestimate volume changes; complementary methods needed to distinguish hypertrophy from hyperplasia.
