视觉GPCR-mini-G蛋白信号复合物的策略性筛选与表征以实现成功结晶

信号转导是生物和药物研究中最重要的课题之一。该过程需要膜蛋白将其信号传递给细胞内信号伴侣蛋白。本方案旨在对信号复合物进行系统的去垢剂筛选，以制备用于结构解析的样品。

本实验方案采用生物学实验室中常用的成熟技术，领域内的初学者也可轻松完成。我们整合了这些方法，以确定膜蛋白复合物制备过程中最关键的参数。首先，将30克GNT I缺陷型HEK293细胞沉淀在室温下解冻，并转移至烧杯中。

加入含有蛋白酶抑制剂混合物的 PBS 缓冲液 120 毫升，使用 Dounce 匀浆器或电动匀浆器在 13,000 转/分钟下匀浆 30 秒。用 PBS 缓冲液将体积调至 150 毫升。轻柔加入 10% DDM 至匀浆后的细胞中，使其终浓度为 1.25%，冰上搅拌 1 小时。

溶解后，在4 °C、150,000 ×g条件下离心细胞裂解液45分钟，以去除未溶解的碎片。将上清液转移至500 mL瓶中，并加入10 mL 50% 1D4免疫亲和琼脂糖树脂。在4 °C下轻轻混合溶解的细胞裂解液与树脂4小时或过夜，以使蛋白结合。

将裂解液与树脂混合物上样至开放柱中以收集树脂。用10个柱体积的洗涤缓冲液A洗涤树脂，以去除蛋白质污染物。关闭阀门，并用两个柱体积的缓冲液A重悬树脂。接下来，在暗红光条件下，向重悬的树脂中加入9-顺式视黄醛，使其终浓度为50微摩尔。

在避光条件下，于4 °C轻轻混合4至16小时，以实现视黄醛结合。随后打开阀门，从柱中移除缓冲液。用20个柱体积的A缓冲液洗涤树脂，接着用15个柱体积的B缓冲液洗涤，以去除未结合的视黄醛。

用两倍柱体积的缓冲液B重悬树脂，然后将树脂悬液等分至10个10毫升的一次性层析柱中。去除这10个层析柱中的缓冲液，再分别用1毫升缓冲液C重悬各柱中的树脂，以更换去垢剂。冰上孵育一小时。

再重复进行一次缓冲液 C 的洗涤和孵育步骤。从层析柱中移除缓冲液，然后将每根柱子的树脂重悬于 0.8 毫升洗脱缓冲液中。轻轻混匀两小时。

将每根柱子的洗脱液收集到离心管中。每根柱子用 0.7 毫升洗脱缓冲液重悬树脂，轻轻混匀一小时。

将每根柱子的洗脱液收集到同一管中。在避光条件下，将洗脱出的蛋白质加入石英比色皿。测定蛋白质样品的光谱。

使用495纳米长通滤光片的光线直接照射比色皿中的蛋白质样品，持续两分钟。测量照射后样品的光谱。对在其他九种去垢剂中纯化的所有蛋白质样品进行相同的测量。

暗态和光照状态。在正常光线下，针对每种去垢剂条件，准备100微升浓度为0.7毫克/毫升的视紫红质溶液。在红光下，准备100微升含有浓度为0.7毫克/毫升的视紫红质和浓度为0.2毫克/毫升的mini-GO的混合溶液。

向混合物中添加一毫摩尔的氯化镁。使用495纳米长通滤光片的光源照射混合物，并孵育30分钟。将样品转移至自动进样瓶中，并放入样品盘内。

编程方法文件，通过自动进样器为每个样品自动连续进行尺寸排阻层析（SEC）运行，自动进样器向层析柱加载77微升样品，纯化系统每次运行洗脱25毫升SEC缓冲液。记录280纳米和380纳米处的吸光度。在保留体积约为12.9毫升处收集视紫红质及视紫红质-mini-GO复合物的峰级分。

在4%至12%的SDS变性梯度凝胶上，使用考马斯亮蓝染色分析左侧视紫红质样品及视紫红质-mini-GO复合物的峰组分。制备200微升混合液，其中含视紫红质浓度为1毫克/毫升，PNGase F浓度为0.01毫克/毫升。充分混匀后，于冰上孵育过夜。

制备200微升混合液，其中视紫红质浓度为1毫克/毫升，Endo F1-13浓度为0.01毫克/毫升。充分混匀后，于冰上孵育过夜。通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析消化结果。

本研究中，小规模纯化装置获得了足量的蛋白质，可用于后续分析。视紫红质的紫外-可见光谱显示，暗态下9-顺式视黄醛结合的视紫红质如蓝色曲线所示。光照后，9-顺式视黄醛从蛋白中解离，并异构化为全反式视黄醛。

280 纳米处吸收值与 488 纳米处吸收值的比值，以及 280 纳米处吸收值与 380 纳米处吸收值的比值，反映了在每种去垢剂中纯化的视紫红质的稳定性。此处展示了在 10 种不同去垢剂中纯化的视紫红质及视紫红质-mini-GO 复合物的尺寸排阻色谱图。标准分子量标记蛋白的谱图与 DDM 样品叠加显示。

以DMNG为例展示了峰形图谱的解析结果，其中还显示了DDM、DM、Cymal-6、Cymal-5和OGNG的理想情况。放大后的OGNG样品图谱显示，视紫红质和视紫红质-mini-GO复合物在相近的洗脱体积处被洗脱。此处展示了视紫红质以及经SEC纯化的视紫红质-mini-GO复合物样品的SDS-PAGE分析结果。

该图展示了使用内切酶 F1 和 PNGase F 对视紫红质进行去糖基化的 SDS-Page 分析。必须系统地进行去垢剂筛选，以便能够清晰明确地比较每种单独去垢剂的影响。对于不同数量的蛋白质，也可使用热 shift 测定来研究去垢剂对蛋白质稳定性的影响。

通过该方法，我们能够制备稳定的蛋白质复合物，并最终解析在几何组装中丢失的晶体结构，从而为G蛋白偶联受体（GPCR）与G蛋白相互作用的特异性提供了重要见解。