小鼠巨噬体化学术的延时成像

传统上，由于细胞移动缓慢，在实时化疗分析中很难研究巨噬细胞。该协议提供了一种在化疗梯度中迁移的巨噬细胞，长达六小时或更长时间。与转移分析等植入测定相比，该技术具有可观察到巨噬细胞形态、测量细胞速度和化学效率等参数的优点。

巨噬细胞涉及许多炎症性疾病，这种技术可用于研究旨在抑制化疗的药物。它也可以应用于其他细胞类型，如人类单核细胞。首次尝试这种技术时，最好在使用细胞之前练习填充化疗室。

该技术最重要的一个方面是避免气泡。首先，使用根据手稿说明准备的经过修改的 RPMI 1640 HEPES 介质预填充一两个化学滑梯的连接通道。将幻灯片放入细胞培养盘中，将盘子放在加热至 37 摄氏度的铝块上。

然后将插头插入端口 1 和 4。使用 200 微升斜面移液尖将 15 微升的改性 RPMI 1640 HEPES 介质放入填充端口三中。接下来，将移液器尖端插入端口二，以中等快的速度吸入 15 微升，从而预填充连接通道和两个侧翼供应通道。

用盖子盖住填充口 2 和 3，将化学滑轨放在 37 摄氏度的封闭湿度室内，否则干燥且无二氧化碳的培养箱内。为了分离巨噬细胞，将一个24量表的塑料导管插入牺牲的三到四个月大的小鼠的腹腔，并使用5毫升的塑料注射器用冰汉克缓冲盐溶液洗脱腔，不产生钙或镁。在管中收集被洗洗介质后，在300倍G下离心6.5分钟。

丢弃上经剂，并在200微升改性RPMI 1640介质中重新悬浮细胞。稀释细胞悬浮液的一至二十。然后使用计数设备对单元格进行计数。

将细胞稀释至每毫升10倍至6个细胞的最终浓度，并在加热的铝块中将它们保持在37摄氏度。上下移液细胞悬浮液五次，以减少交管，并轻轻地将10微升液沉积到三号气室的端口上。将移液尖端放在端口 2 中，然后缓慢地将电池悬浮液绘制到连接通道中。

一旦引入单元悬挂，请拆下端口 1 和 4 上的插头以停止流量，并在所有四个灌装端口上放置盖。然后，将化学滑梯放在37摄氏度的湿度室中两到三个小时。使用倒置显微镜检查观察区域。

然后将插头插入加注端口一和二，并检查加注端口三是否用介质填充到顶部，并且是否无气泡。如有必要，使用无菌的 27 量针来分离气泡。接下来，用100微升机械移液器吸气60微升介质，将尖端放入填充端口三。

使用音量设置环缓慢而稳定地将介质注入储液罐中，直到一到两分钟后到达填充端口四的顶部。要填充第二个储液罐，请将插头从端口 1 中移出，然后缓慢地将其插入端口 3 中。吸50微升介质，将移液器尖端放入四号端口，缓慢地将介质注入第二个储液罐中，在一到两分钟后到达填充口的顶部。

在两毫升微离心管中加入495微升的介质，并加入5微升的专利蓝5。短暂地涡旋混合物，然后加入5.4微升的重组小鼠补充C5a和涡流再次混合。确保端口一顶部的浅凹陷是无介质的，并存放 15 微升的蓝色补充 C5a 包含介质。

然后将 200 微升移液尖插入填充端口四，然后缓慢旋转音量设置环，将介质绘制到相反的储液罐中。将空气抽入加注口一的短垂直柱，直到流体-空气界面在柱中中间。然后插入端口一，然后轻轻地从端口四提起移液器，确保滑轨保持到位，然后缓慢插入端口四。

要执行时间推移成像，请将化学幻灯片放在装有舞台培养箱的倒置显微镜的舞台上，用 10X 相对比度物镜对观察区域进行成像，重点是巨噬细胞拉梅利波迪亚。用于小鼠佩罗托内巨噬细胞的延时视频显微镜的化疗幻灯片有三个化疗室，每个腔室有四个填充端口。细胞在每个腔室的观察区播种。

经过两到三个小时的孵育，腔室慢慢充满介质。当观察区中的细胞被检查时，多达三分之二的细胞被冲走。一般来说，弱粘附B-1细胞被冲走，其余细胞主要是巨噬细胞。

为了区分巨噬细胞和B细胞，新鲜分离的细胞被标记在特定的抗体。巨噬细胞被标记为绿色荧光，B细胞与红色，细胞核与蓝色。通过向两个储层之一引入补充C5a（一种化疗物）来研究巨噬细胞迁移。

记录了在补充C5梯度中迁移的巨噬细胞的迁移轨迹。每个迁移轨道的起点被规范化为 X 等于零，Y 等于零来创建迁移图。然后计算个体巨噬细胞的细胞速度和化学效率。

该技术对研究G蛋白亚基、罗GPAses和巨噬细胞在化疗中运动的作用是有用的。