Name: 小鼠巨噬体化学术的延时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 了解小鼠腹腔巨噬细胞在补体C5a趋化梯度中的实时迁移行为。该延时相差显微技术可测量细胞速度和趋化效率，适用于炎症机制研究及药物筛选。

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本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助（项目编号：HA 3271/3-2）。

本方案遵循我们当地研究伦理委员会的指导方针以及动物护理指南。
注意：图1展示了趋化性实验的工作流程。
1. 预填充趋化性载玻片
<ol>
	<li>使用改良的 RPMI 1640 HEPES 培养基预填充一个或两个趋化实验载片中宽 1 mm、长 2 mm 的连接通道。该培养基由不含碳酸氢盐的 RPMI 1640 培养基配制而成，其中包含 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、10% 经热灭活的胎牛血清（FBS）以及抗生素（如青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL），通过将 100 倍浓缩的青霉素/链霉素稀释获得），并添加 1 µg/mL 脂多糖（来自 E. coli）——一种用于激活细胞的 Toll 样受体 4 配体。
	<ol>
		<li>将一个趋化实验载片（图 2A）放入已预热至 37 °C 的圆形细胞培养皿（直径 10 cm）中，并将培养皿置于预热（37 °C）的铝块上。将塞子插入 1 号和 4 号孔（图 2B）。 
		注意：在超净工作台内使用维持在 37 °C 的铝块有助于趋化室的制备。理想情况下，加热铝块应提供一个平坦的操作区域，并设有用于放置各种离心管（如 50 mL 管和 2 mL 微量离心管）的凹槽。</li>
		<li>使用带有斜面尖端的 10–200 µL 移液枪头，向加样孔 3 中加入 15 µL 改良 RPMI 1640 HEPES 培养基（图 2B）。随后，保持移液器体积设定为 15 µL，按住（2–20 µL 量程）移液器的控制按钮，将枪头插入 2 号孔，并以中等偏快速度吸取 15 µL 液体（图 2B）。此操作将预填充 1 mm × 2 mm 的连接通道（观察区），以及位于中央观察区与 2 号、3 号孔之间的两个侧翼供液通道。用盖帽封闭 2 号和 3 号加样孔。</li>
		<li>预填充完成后，将趋化实验载片放置于置于密闭湿度室内的支架上，并将整个装置放入一个干燥、无 CO2 但温度维持在 37 °C 的培养箱中。 
		注意：选择正确的移液枪头对填充趋化载片至关重要。斜面枪头可楔入加样孔顶部，而常用的尖头枪头可能插入更深，从而显著增加液体流动阻力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠腹腔常驻巨噬细胞的分离
<ol>
	<li>使用高浓度挥发性麻醉剂异氟烷处死一只3–4月龄的小鼠（&#62;5% 空气）或二氧化碳25，随后进行颈椎脱位。啮齿类动物翻正反射的消失与人类意识丧失相关。26用80%乙醇水溶液清洁小鼠腹部，然后使用钝头手术剪在腹中线处做1–2 cm的皮肤切口。将皮肤向两侧推开，暴露下方的腹壁。</li>
	<li>插入24 G塑料导管至腹腔内。使用5 mL塑料注射器，用2次共4.5 mL冰冷的不含钙的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）冲洗腹腔2+ 和 Mg2+留约0.5 mL的残余HBSS在注射器中，以便将意外吸入导管尖端的组织排出。</li>
	<li>将灌洗液（通常总量为 8–8.5 mL）转移至一个 14 mL 聚丙烯圆底管中。以 300 x g 室温下持续6.5分钟。 
	注意： 圆底管可使上清液完全倾倒，减少细胞聚集。</li>
	<li>弃去上清液，重悬腹腔细胞（通常约为 ~4 x 106 每只小鼠在200 µL改良的RPMI 1640 HEPES培养基中加入细胞。取细胞悬液样品按1:20稀释，使用细胞计数设备（如改进型Neubauer计数板）进行细胞计数。随后，将细胞悬液稀释至终浓度为10 × 106 细胞/mL，并将细胞置于圆底2 mL聚丙烯微量离心管中，使用预热的铝块在37 °C条件下孵育（见步骤1.1.1中的注释）。</li>
</ol>
3. 将腹膜细胞接种至趋化性载玻片
<ol>
	<li>用移液器将细胞悬液上下吹打5次，移液量设为100 µL（或设为悬液总体积的一半），以减少细胞团块形成。随后，轻柔地将10 µL细胞悬液加入趋化室的3号孔中（图2C）。将移液器枪头插入2号孔，缓慢将细胞悬液吸入连接通道（图2C）。一旦细胞悬液完全进入通道，立即移除1号和4号孔的塞子，以帮助停止细胞悬液的流动。随后在全部四个加样孔上盖上盖帽。</li>
	<li>对所有趋化室重复步骤3.1。使用小型倒置显微镜和10倍相差物镜，检查趋化载片是否存在不需要的气泡。</li>
	<li>将接种了腹腔细胞的趋化载片置于37 °C的湿化培养 chamber 中孵育2–3小时。</li>
</ol>
4. 填充储液池并加入趋化因子
<ol>
	<li>使用倒置显微镜检查观察区域（连接两个 40 µL 储液池的通道）。 
	注意：在此阶段，细胞密度将高于填充储液池后的密度，因为在填充过程中，弱黏附的细胞（主要是 CD19+ 细胞，即 B1 细胞）会被冲洗出观察区域（图 2C–E）。</li>
	<li>将塞子插入填充口 1 和 2（图 2D）。确保填充口 3 被培养基完全充满且无气泡。如有需要，使用无菌的 27 G 注射针头去除不需要的气泡。</li>
	<li>使用 10–100 µL 量程的机械移液器，吸取约 60 µL 改良 RPMI 1640 HEPES 培养基，并将移液器吸头插入填充口 3。调节移液器的体积设定旋钮，缓慢而稳定地向储液池中注入培养基，使培养基在 1–2 分钟后到达填充口 4 的顶部（图 2D）。</li>
	<li>填充第二个储液池。将塞子从端口 1 移出，并缓慢插入端口 3（图 2D）。接着，吸取约 50 µL 改良 RPMI 1640 HEPES 培养基，并将移液器吸头插入填充口 4。使用 10–100 µL 量程移液器的体积设定旋钮，缓慢而稳定地向第二个储液池注入培养基，使培养基在 1–2 分钟后到达填充口 1 的顶部（图 2D）。</li>
	<li>将 495 µL 改良 RPMI 1640 HEPES 培养基加入一个（圆底）2 mL 微量离心管中，再加入 5 µL 专利蓝 V（储备液：10 mg/mL 磷酸盐缓冲液 [PBS]），该蓝色染料用于直观指示浓度梯度的形成。短暂涡旋混匀。然后加入 5.4 µL 重组小鼠补体 C5a（储备液：50 µg/mL PBS 含 0.1% 牛血清白蛋白），再次短暂涡旋混匀。</li>
	<li>在确认填充口 1 顶部浅凹处无液体后（否则液滴可能溢出），将 15 µL 含蓝色染料和补体 C5a 的培养基滴加至填充口 1（图 3A）。</li>
	<li>将 10–200 µL 移液器吸头插入填充口 4，并缓慢而稳定地旋转 10–100 µL 移液器的体积设定旋钮，将含蓝色染料和补体 C5a 的液滴吸入对侧储液池中（图 3B）。此时空气将开始进入填充口 1 的短垂直柱中。持续吸入空气，直至液-气界面位于垂直柱中部，然后缓慢将塞子插入该端口。</li>
	<li>用一只手轻轻提起填充口 4 的移液器，同时用另一只手确保载片保持固定不动。最后，缓慢塞住填充口 4（图 3B）。</li>
	<li>在倒置显微镜下检查趋化滑片。 
	注意：观察区域内残留的贴壁细胞应主要为巨噬细胞。可通过荧光标记的抗 F4/80 抗体进行验证（F4/80 是小鼠巨噬细胞的特异性标志物）。B 细胞可通过荧光标记的抗 CD19 抗体识别，而 F4/80-/CD19- 细胞则可使用蓝色荧光核酸染料检测（图 4）。</li>
</ol>
5. 通过时间序列相差显微镜成像巨噬细胞迁移
<ol>
	<li>将趋化实验载玻片放置在配备载物台培养箱的倒置显微镜载物台上，维持温度为 37 °C。</li>
	<li>使用 10 倍相差物镜对 1 mm × 2 mm 的观察区域进行成像，并聚焦于巨噬细胞的片状伪足：即薄而片状的膜突起结构。以每 2 分钟采集 1 帧的速率，连续成像 14 小时。</li>
</ol>
6. 时间序列图像分析
<ol>
	<li>使用自动图像分析软件，或由 Fabrice P. Cordelières 开发的 ImageJ 插件“Manual Tracking”，分析延时相差图像。 
	注意：自动追踪程序可用于分析通过延时相差显微镜或荧光显微镜成像的细胞。例如，由 Cordelières 等人开发的基于 Java 的软件 iTrack4U27 可以使用延时相差图像或荧光图像作为输入，进行细胞的自动追踪与分析。手动追踪较为耗时，但通过 ImageJ 插件 Manual Tracking 生成的轨迹可直接导入，并由 ImageJ 插件 Chemotaxis and Migration Tool28,29 进行自动分析。</li>
</ol>

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<li>Bachg, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+Myo10+knockout+%28Myo10%28tm2%2Ftm2%29%29+mice+lacking+full-length+%28motorized%29+but+not+brain-specific+headless+myosin+X%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X.</a> Scientific Reports. 9, 597(2019).</li>
<li>Horsthemke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isoform+of+myosin+18A+%28Myo18Agamma%29+is+an+essential+sarcomeric+protein+in+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).</li>
<li>Bzymek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+two-+and+three-dimensional+imaging+of+monocyte+motility+and+navigation+on+planar+surfaces+and+in+collagen+matrices%3A+roles+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho.</a> Scientific Reports. 6, 25016(2016).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

活体成像技术可追溯至19世纪，为研究免疫细胞在其天然环境中的行为提供了手段。然而，即使借助当今先进的显微镜技术和遗传学方法，仍难以在体内研究细胞对特定趋化因子的响应。为解决这一问题，Boyden18于20世纪60年代开发了Transwell实验，但这类终点实验无法直观显示细胞实际向趋化因子迁移的过程，因而难以区分趋化运动（chemokinesis，即化学信号刺激下的随机迁移32）与趋化性（chemotaxis，即细胞朝向化学刺激物浓度更高区域的定向迁移33）。该问题通过设计多种带有桥接结构的开放腔室得以解决，桥宽通常为1 mm，位于两个储液池之间，并可被物镜观察到21,22,23。将接种了贴壁细胞的倒置盖玻片覆盖于腔室上方以封闭系统，趋化因子加入其中一个储液池后，经桥区扩散至对侧储液池，从而形成浓度梯度。本文描述了一种基于相同原理但采用具有四个加样口的封闭腔室的趋化性实验。利用该系统结合延时相差显微镜，我们建立了一种用于观察小鼠腹腔常驻巨噬细胞在趋化性补体C5a梯度中迁移的实验方法31,34,35,36。该实验方法结合基因敲除小鼠模型，对研究多种Rho GTP酶及运动蛋白在巨噬细胞形态、运动性和趋化性中的作用起到了关键作用31,34,35,36,37。我们还曾利用该方法观察人外周血单核细胞在二维表面或三维I型胶原基质中的迁移38。此外，该实验同样适用于小鼠骨髓来源的巨噬细胞或由条件性永生化髓系前体细胞分化的巨噬细胞39,40。我们此前曾使用带鲁尔接头的聚四氟乙烯（PTFE）袋培养骨髓细胞并获取巨噬细胞34。PTFE袋的优势在于，将袋子置于冰上20–30分钟后，细胞可迅速重悬并直接用于实验。需注意的是，我们在引入细胞前预先填充趋化实验载玻片的观察区域。此方法的优点是可随后冲洗掉不必要的气泡（成功率不一），且预先浸润的观察区允许通过移液器缓慢加入细胞悬液。然而，预填充也可能导致培养基部分流入一侧或两侧相邻的储液池，从而促使细胞在观察区域之外附着。另一种方法是将细胞悬液直接移入干燥的观察区，但之后无法排除产生的气泡。
小鼠腹腔中含有两种主要的细胞群体：F4/80+ 巨噬细胞和（数量较少的）CD19+ B 细胞，其比例约为 1:2（图 4A）。这两种细胞群体占腹腔细胞总数的 95% 以上，而其余的 F4/80-/CD19- 细胞通常可鉴定为 CD11c+ 细胞（树突状细胞）或 CD3+ 细胞（T 细胞）。在向储液池中加入培养基时，弱黏附的 B 细胞会被冲洗出观察区域（图 2）。在向两个储液池之一加入趋化因子后，可通过延时相差显微镜成像技术，观察剩余细胞（巨噬细胞）在动态形成的趋化因子梯度中的迁移行为。通过模拟从一个储液池向另一个储液池扩散的过程，可利用分子量相近的荧光染料来模拟补体 C5a 在观察区域中浓度梯度的形成。重组小鼠补体 C5a（预测分子量为 9.0 kDa）的一个良好替代物是荧光标记的葡聚糖（10 kDa）31。利用共聚焦显微镜，可以固定时间间隔测量趋化滑片两个储液池之间狭窄通道（观察区域）内的荧光梯度，并绘制不同时间点的浓度分布曲线24,31。我们常规在趋化因子培养基中加入一种非荧光性的蓝色染料（专利蓝 V），以直观指示扩散过程和梯度的形成。将 15 µL 含蓝色染料和趋化因子的培养基加入储液池后，约 1 小时内该储液池即呈现均匀蓝色；根据菲克扩散定律，在连接两个储液池的狭窄观察区域内将形成稳定的浓度梯度（图 3B）。溶质（蓝色染料或趋化因子）完全均匀分布则需要数天时间。
荧光显微镜可替代相差显微镜，用于自动细胞追踪具有优势，因为荧光标记的细胞可轻易与背景区分。另一优势在于，通过使用荧光抗体标记表面标志物，可选择性地追踪特定的免疫细胞亚群。我们采用该方法对人外周血CD14+细胞（单核细胞）在趋化性fMLP（N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸）梯度中的迁移进行成像38。类似地，可使用荧光标记的抗F4/80抗体对小鼠巨噬细胞在趋化性补体C5a梯度中的迁移进行成像。光毒性是使用荧光成像时的潜在缺点41，但可通过多种方式减轻42，包括使用长波长激发的荧光染料以及在培养基中添加抗氧化剂。另一种方法是先通过荧光显微镜识别标记细胞，随后采用延时相差显微镜进行成像。然而在实际操作中，对于移动速度中等偏低的细胞（如约1 µm/min的巨噬细胞或约4 µm/min的单核细胞），可每隔数分钟间歇性地进行荧光显微成像，这种方案耐受性良好38。我们此前已将荧光显微镜与本文所述的趋化滑片用于三维趋化实验38,43。在此类实验中，两个储液池预先充满培养基，在将悬浮于含I型胶原的培养基中的荧光标记细胞缓慢加样至观察区之前，立即向其中一个储液池吸入15 µL含趋化因子的培养基。该操作的关键难点在于I型胶原的处理，因其通常浓缩于酸性溶液中。在将冰浴的胶原溶液与细胞悬液混合前，需加入碱性溶液以中和胶原溶液的pH。将胶原-细胞混合物转移至37 °C培养箱后，将启动胶原聚合。在孵育过程中，应缓慢绕长轴旋转载片，使细胞在X、Y和Z轴方向保持均匀分布，直至胶原形成凝胶。最近已有报道一种适用于三维趋化实验的封闭式趋化滑片，其具有六个塞子而非四个塞子29。该系统允许在独立填充两侧储液池之前，先将胶原-细胞混合物引入观察区，因为每个储液池均设有两个加样口，而非单一加样口。
综上所述，我们描述了一种实时趋化性检测方法，可实现对细胞在趋化梯度中迁移过程的可视化观察，持续时间可达6小时或更长。本文重点介绍巨噬细胞，这类细胞在炎症性疾病中发挥重要作用，但在实时趋化性检测中的研究程度却低于中性粒细胞和盘基网柄菌（Dictyostelium）等移动较快的细胞。

免疫细胞通常以变形虫样方式在二维表面单独迁移1,2，该过程包括前端反复伸出、由整合素介导的细胞黏附以及尾端回缩。迁移的前提步骤是细胞极化，即细胞形成前端和后端3。趋化性始于G蛋白偶联受体对趋化因子的识别，并通过膜锚定的异源三聚体G蛋白和小单体G蛋白以及磷脂结合的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）介导复杂的信号网络4,5。Cdc42和Rac亚家族的Rho GTPases被激活后，可在细胞前端诱导形成突起6，而Rho亚家族成员（尤其是RhoA）则激活尾端收缩5,7。在三维（3D）环境中，整合素在白细胞迁移中基本冗余，RhoA在推动细胞通过狭窄通道时变得更加重要8，而由Cdc42或Rac诱导的Arp2/3激活在趋化导向中仍起重要作用9,10。
免疫细胞可能面临不同的趋化因子，尤其是在组织损伤、病原体入侵和炎症等情况下。吞噬细胞上表达的内源性趋化因子补体成分C3a和C5a，可通过补体级联反应的激活迅速产生，并由补体C3a和C5a受体识别。类似地，坏死细胞通过甲酰肽受体招募吞噬细胞，这些受体可识别线粒体来源以及细菌来源的甲酰肽11。免疫细胞还表达针对趋化因子的G蛋白偶联受体；趋化因子是一大类趋化性多肽，在免疫细胞迁移的调控中发挥重要作用，参与稳态和炎症状态下的免疫应答。根据前两个半胱氨酸（C）残基之间的间距，趋化因子可分为四类：C、CC、CXC和CX3C细胞因子，其中X代表一个氨基酸。因此，体内免疫细胞需要恰当地响应高度复杂的时空信号，这使得趋化性研究成为一项艰巨的任务。下文将简要回顾趋化性的研究历史，该领域始于活体成像技术的应用。
白细胞趋化性的研究可追溯至1888年12，当时眼科医生 Theodor Karl Gustav Leber 在真菌性角膜炎模型中清晰描述了白细胞向炎症部位的定向迁移及其在该处的聚集。Leber 强调，由病原体产生的物质吸引过量白细胞对于通过吞噬作用清除有害微生物至关重要，而吞噬作用在此前同一十年间已由 Metchnikoff（也称 Metschnikoff）所描述1320世纪20年代，克拉克（Clark）和克拉克（Clark）还开展了体内实验。14,15，利用蝌蚪的透明特性，证明了巴豆油诱导的无菌性炎症14 或其他刺激物15 导致白细胞黏附于血管壁，随后发生穿出血管（跨内皮迁移）并快速向刺激物方向在组织间隙中迁移。体外实验采用让·科蒙丹开发的显微电影摄影法16 表明白细胞向颗粒性趋化因子源（如细菌）迁移17当时，趋化因子的分子身份尚不清楚。20世纪60年代，Stephen Boyden18 意识到研究可溶性物质趋化活性的技术尚不完善，他设计了一种具有两个腔室的装置，中间由滤纸膜隔开，后来被称为博伊登小室。将细胞悬液加入上层腔室，待测物质则加入下层腔室，或同时加入上下两个腔室。经过一定孵育时间后，取出滤膜，对细胞进行固定和染色。通过比较细胞穿过滤膜向含有待测物质的下层腔室迁移的数量——在待测物质存在于上下两室、均不存在或仅存在于下室的不同条件下——即可确定其趋化活性。如今，Transwell实验仍被广泛使用，并经历了多种改进，包括采用具有特定孔径和孔密度的不同聚碳酸酯膜。19,20Transwell 实验的一个主要缺点是难以直接观察细胞的迁移过程，且细胞穿过膜的迁移路径通常不超过一个免疫细胞的直径。
Sally H. Zigmond 开发了一种趋化性小室21，可利用荧光染料同时观察浓度梯度的形成和细胞形态。该小室由一块聚甲基丙烯酸甲酯（亚克力）载片构成，载片上设有两条平行的线性凹槽，每条凹槽体积约为 100 µL，两条凹槽之间由一条宽 1 mm、低于载片上表面 3–10 µm 的桥连接。将接种有细胞的盖玻片倒置并放置在载片上，使其跨越两个凹槽。向其中一个凹槽加入趋化因子后，通常在 30–90 分钟内，桥区域会形成陡峭的趋化因子浓度梯度。在 Zigmond 小室中，可观察到人多形核白细胞（粒细胞）朝向趋化因子方向定向排列。已有多种 Zigmond 小室的改良版本被报道，包括 Dunn22 和 Insall23 小室，二者均采用在两个由 1 mm 宽桥连接的凹槽之间放置接种细胞的盖玻片的设计。Dunn 小室由同心环形凹槽和圆形桥构成，而 Insall 小室则更接近于 Zigmond 小室，但提供了两种不同宽度的桥，分别为 0.5 mm 和 1 mm。Zemmel 等人24描述了一种新型趋化性小室，称为 µ-Slide Chemotaxis，采用注塑成型塑料制造。该趋化性小室由两个 40 µL 的储液池组成，二者之间通过一条宽 1 mm、长 2 mm、高 70 µm 的通道连接。小室底部由一层透气的薄塑料膜构成，其厚度和光学特性与 1.5 号玻璃盖玻片相同24。本文中，我们描述了一种使用 µ-Slide Chemotaxis 小室的趋化性实验，用于在趋化性（补体 C5a）梯度中观察小鼠腹腔常驻巨噬细胞长达 14 小时的迁移过程。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;-Slide（阳极氧化铝）支架</td><td>Ibidi, Martinsried, Germany</td><td>80003</td><td>可高压灭菌、可堆叠的通道载片支架</td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide Chemotaxis 2D（趋化性载片）</td><td>Ibidi, Martinsried, Germany</td><td>80306</td><td>含趋化室的载片（组织培养处理）</td></tr><tr><td>100倍青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>用作RPMI 1640培养基的添加剂</td></tr><tr><td>10–100 &amp;micro;L移液器（带体积调节环）</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td>Eppendorf Research plus移液器</td></tr><tr><td>10–200 &amp;micro;L移液器吸头</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>739261</td><td>斜面吸头移液器吸头（每架96个：无菌）</td></tr><tr><td>14 mL聚丙烯圆底管</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td>用于收集腹腔细胞</td></tr><tr><td>14位Hamamatsu C9100-50电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）帕尔贴冷却相机</td><td>Hamamatsu Photonics Inc., Japan</td><td></td><td>转盘共聚焦显微镜系统的EM-CCD相机</td></tr><tr><td>2–20 &amp;micro;L移液器（带体积调节环）</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td>Eppendorf Research plus移液器</td></tr><tr><td>24 G塑料导管</td><td>B Braun Mesungen AG, Germany</td><td>4254503-01</td><td>用于腹腔灌洗</td></tr><tr><td>405 nm固态激光器，50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td><td></td><td>转盘共聚焦显微镜系统的激光源（405 nm）</td></tr><tr><td>488 nm固态激光器，50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td><td></td><td>转盘共聚焦显微镜系统的激光源（488 nm）</td></tr><tr><td>561 nm固态激光器，50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td><td></td><td>转盘共聚焦显微镜系统的激光源（561 nm）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488标记的大鼠（IgG2a）单克隆（克隆BM8）抗小鼠F4/80抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MF48020</td><td>小鼠巨噬细胞标志物及质膜标记</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594标记的大鼠（IgG2a）单克隆（克隆6D5）抗小鼠CD19抗体</td><td>BioLegend</td><td>115552</td><td>小鼠B细胞标志物</td></tr><tr><td>C-Chip一次性（改进型Neubauer）血细胞计数板</td><td>NanoEnTek（由VWR International经销）</td><td>631-1098</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>CSU-X1转盘扫描仪</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Japan</td><td></td><td>Nipkow转盘单元</td></tr><tr><td>不含Ca&amp;rsquo;&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;和Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的Hank’s缓冲盐溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170120</td><td>用于腹腔灌洗</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082139</td><td>用作RPMI 1640培养基的添加剂</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21486</td><td>细胞通透性蓝色荧光核酸染料</td></tr><tr><td>ImageJ（基于Java的图像处理与分析软件）</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>来自&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;O111:B4的脂多糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391-1MG</td><td>Toll样受体4配体</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti倒置显微镜</td><td>Nikon, Japan</td><td></td><td>倒置显微镜</td></tr><tr><td>专利蓝V钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21605-10G</td><td>蓝色染料，用作梯度形成过程的视觉指示剂</td></tr><tr><td>重组小鼠补体蛋白C5a</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2150-C5-025</td><td>小鼠巨噬细胞趋化因子</td></tr><tr><td>含20 mM Hepes的RPMI 1640培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7388</td><td>实验基础培养基</td></tr><tr><td>UltraVIEW Vox 3D活细胞成像系统 + Volocity软件</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td><td></td><td>转盘共聚焦显微镜系统</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 + Axiovision软件</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany</td><td></td><td>适用于相差显微镜的共聚焦激光扫描显微镜（LSM）</td></tr></tbody></table>

小鼠巨噬细胞趋化作用的延时成像

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

趋化性是指细胞在化学梯度引导下通过受体介导的定向移动，而趋化运动则是指化学物质刺激细胞产生随机运动。趋化运动与趋化性在免疫细胞的动员和分布过程中具有重要作用。例如，趋化因子（即具有趋化作用的细胞因子）能够快速招募循环中的中性粒细胞和单核细胞至血管外炎症部位。趋化因子受体属于G蛋白偶联受体这一大类。目前，趋化性配体梯度如何通过G蛋白偶联受体信号通路引导细胞迁移的机制尚未完全阐明。在免疫学领域，中性粒细胞是体外研究趋化性的常用模型细胞。本文介绍一种专为小鼠组织驻留型巨噬细胞设计的实时二维（2D）趋化性检测方法，这类细胞传统上较难进行研究。巨噬细胞在二维表面上的移动速度较慢，约为 ~1 µm/min，相较于移动速度快一个数量级的中性粒细胞或Dictyostelium discoideum，其在点源迁移实验（例如向充满趋化因子的微移液管尖端迁移）中的适用性较差。广泛使用的Transwell实验可用于评估不同物质的趋化活性，但无法提供有关细胞形态、迁移速度或趋化导航能力的信息。本文所述的基于延时显微镜的巨噬细胞趋化性检测方法，可定量分析细胞迁移速度和趋化效率，并为解析趋化性过程中的信号转导分子、信号通路及效应分子提供研究平台。

图 2A 展示了用于延时视频显微镜观察小鼠腹腔巨噬细胞在趋化梯度中迁移的趋化滑片示意图。该滑片包含三个趋化室，每个趋化室具有四个加样口。可通过滑片上方所示的塞子单独封闭各加样口。或者，也可将非密封盖帽置于未堵塞的加样口上以维持无菌状态。在堵塞加样口 1 和 4 后，可通过在加样口 3 处加入 15 µL 液滴，并在加样口 2 处使用 2–20 µL 移液器吸取，预先将加样口 2 与 3 之间的观察区域（连接两个储液池的通道，宽 1 mm × 长 2 mm × 高 70 µm）充满培养基（图 2B）。将小鼠腹腔常驻细胞悬液（10 × 106 个细胞/mL）通过在加样口 3 处加入 10 µL 悬液，并在加样口 2 处缓慢吸取的方式接种至观察区域（图 2C）。图 2C 还展示了使用 10 倍物镜进行相差显微镜观察所获得的接种于观察区域中的细胞的典型图像。孵育 2–3 小时后，缓慢向趋化滑片中填充培养基（图 2D）。在堵塞加样口 1 和 2 后，通过加样口 3 缓慢注入培养基，直至液体从加样口 4 流出。随后，将塞子从加样口 1 转移至加样口 3，再通过加样口 4 缓慢注入培养基，直至液体从加样口 1 流出，从而填充第二个储液池。在此阶段，使用倒置显微镜重新检查观察区域中的细胞（图 2E）。通过比较储液池填充前（图 2C）和填充后（图 2E）的图像，发现约有三分之二的细胞被冲洗出观察区域。通常，弱黏附的 CD19+ 细胞（B1 细胞）被洗脱，而残留的细胞主要为 F4/80+ 细胞（巨噬细胞）。通过使用荧光标记的特异性抗体对每种细胞类型进行标记后，经荧光显微镜检测证实了这一点（图 4）。在图 4A 中，新鲜分离的小鼠腹腔常驻细胞使用绿色荧光染料标记的抗 F4/80 抗体和红色荧光染料标记的抗 CD19 抗体进行标记，细胞核则使用蓝色荧光核酸染料染色。F4/80 是小鼠巨噬细胞的特异性标志物30，而 CD19 是 B 细胞标志物。图 4B 显示了在趋化室的观察区域内，通过旋转盘共聚焦显微镜成像的 F4/80+ 细胞。这些细胞在经过延时相差显微镜记录的过夜趋化实验后进行荧光标记。
将补体C5a（趋化因子）引入两个储液池中的一个，方法是在堵住2号和3号端口后，向1号加样端口加入15 µL含有0.54 µg/mL（重组小鼠）补体C5a和10 µg/mL专利蓝V的培养基（图3A）。通过4号端口用移液器缓慢抽吸，使趋化因子培养基缓慢进入储液池。图3B显示了将15 µL液滴吸入储液池后蓝色染料的扩散情况。专利蓝V被用作趋化因子扩散的间接视觉指示剂。补体C5a分子明显大于专利蓝V分子（分别为9.0 kDa和0.57 kDa），因此扩散更慢。补体C5a在储液池中扩散后，其浓度约为0.2 µg/mL（15 µL/40 µL [储液池体积] × 0.54 µg/mL = 0.2 µg/mL），相当于约22.5 nM。在加入趋化因子3小时后，观察区域形成了较为陡峭的浓度梯度，并持续增强，约12小时达到最大值31。图3C显示了巨噬细胞在补体C5a浓度梯度中迁移的轨迹（加入趋化因子后6–12小时）。根据迁移轨迹图（图3D）计算单个巨噬细胞的迁移速度和趋化效率，后者以y-FMI（y轴前向迁移指数；范围：-1至+1）和x-FMI表示。图3D还显示了在将每个迁移轨迹的起始点归一化至X = 0和Y = 0后生成的迁移轨迹图（位于箱形图下方）。轨迹图中的插图展示了每条迁移轨迹y-FMI的计算方法。
<img alt="细胞分离工作流程；显微镜观察、细胞追踪示意图；通过延时成像分析趋化性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：趋化性实验的工作流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控装置设置：细胞接种和活细胞成像过程的步骤示意图及结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：趋化性载玻片的操作。（A）一个具有四个塞子和四个盖帽的趋化性载玻片的三维视图。该载玻片包含三个趋化性腔室，每个腔室由两个40 µL的储液池通过一个1 mm × 2 mm、高70 µm的通道连接而成，该通道称为观察区。（B）连接通道在两端延伸至加样口2和3。将塞子插入加样口1和4后，通过在加样口3滴加培养基（红色），并在加样口2使用10–200 µL移液枪头抽吸，预先将观察区充满培养基。随后，在将载玻片于37 °C孵育并准备细胞悬液之前，将盖帽盖在加样口2和3上。（C）通过在加样口3滴加10 µL小鼠腹腔常驻巨噬细胞悬液，并在加样口2缓慢抽吸，将巨噬细胞接种至形成趋化因子梯度的观察区。然后将载玻片置于湿润培养盒中，在37 °C孵育2–3小时。右侧所示的相差图像通过10倍物镜获得，显示了细胞在37 °C接种并孵育2小时后的状态。比例尺 = 500 µm。（D）通过堵塞加样口1和2，然后从加样口3缓慢注入培养基直至液体从加样口4流出，从而将趋化性腔室充满培养基。通过调节20–100 µL移液枪的容量调节环，可实现缓慢而稳定的填充。第一个储液池填充完毕后，可通过堵塞加样口2和3，然后从加样口4缓慢注入培养基直至液体从加样口1流出，来填充第二个储液池。（E）填充两个储液池后，上述相同观察区（C）的相差图像。比例尺 = 500 µm。图形元素由Elias Horn提供。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移分析；图A-B，补体C5a，追踪路径；图C-D，速度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：趋化性实验。（A）将含有 0.54 µg/mL 补体 C5a 和 10 µg/mL 专利蓝 V 的 15 µL 培养基滴加至趋化室的加样口 1，随后在加样口 4 缓慢抽吸，使趋化因子进入两个储液腔中的一个。（B）趋化因子溶液（蓝色）刚被吸入储液腔时呈大致倒置的液滴形状，随后缓慢扩散至整个储液腔。（C）巨噬细胞在趋化因子（补体 C5a）梯度中迁移的轨迹图，时间为趋化因子加入储液腔后 6–12 小时。右侧指示了梯度方向。每条迁移轨迹的终点以实心圆圈标示。（D）速度、x-FMI（x轴前向迁移指数）和 y-FMI（y轴前向迁移指数）的箱线图；y-FMI 是趋化效率指数，取值范围为 -1 至 +1。数据来自对 25 条巨噬细胞迁移轨迹的分析。随机选取观察区域下半部分、且在 6 小时内位移至少达一个细胞宽度的巨噬细胞进行分析。下方为将所有轨迹起点归一化至 X = 0 和 Y = 0 后的迁移轨迹图。趋化指数（y-FMI）通过将 Y 轴方向的净位移（d）除以迁移路径的累积长度（l）计算得出，示意图如图所示。图 A 和图 B 中的图形元素由 Elias Horn 提供。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="腹腔细胞趋化实验结果；荧光显微镜显示细胞标志物 F4/80、CD19。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过转盘共聚焦显微镜获得的活体小鼠腹腔常驻细胞的荧光图像。（A）新鲜分离的小鼠腹腔细胞的扩展焦点图像（所有 Z 层面中最亮的点合并），细胞经绿色荧光标记的抗 F4/80 抗体（巨噬细胞标志物）、红色荧光标记的抗 CD19 抗体（B 细胞标志物）以及蓝色荧光核酸染料染色。比例尺 = 10 µm。（B）趋化实验过夜后，在趋化室观察区域内拍摄的 F4/80+ 细胞（巨噬细胞）快照（单个 Z 层面）。细胞使用绿色荧光标记的抗 F4/80 抗体和蓝色荧光核酸染料染色。补体 C5a 和专利蓝 V 的浓度梯度在细胞染色过程中已被洗去，因此趋化室示意图中的上层储液室不呈蓝色。比例尺 = 10 µm。图形元素由 Elias Horn 提供。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了利用延时相差显微镜技术，在趋化性补体C5a梯度中对小鼠腹腔常驻巨噬细胞进行成像的方法。该方案可推广至其他免疫细胞的研究。

趋化性是细胞通过受体介导沿化学梯度定向移动的现象，而趋化运动则是由化学物质刺激引起的细胞随机运动……

传统上，由于巨噬细胞移动缓慢，实时研究其趋化性的实验较为困难。本方案提供了一种可对巨噬细胞在趋化梯度中迁移长达六小时或更长时间进行成像的方法。与转移植入等植入实验相比，该技术的优势在于可观察巨噬细胞的形态，并可测量细胞速度和趋化效率等参数。巨噬细胞参与多种炎症性疾病，该技术可用于研究旨在抑制趋化作用的药物。该技术也可应用于其他细胞类型，例如人单核细胞。初次尝试该技术时，最好先练习填充趋化室，再进行细胞操作。该技术最重要的方面之一是避免产生气泡。首先，根据文稿说明，用改良的 RPMI 1640 HEPES 培养基预填充一至两个趋化作用载玻片的连接通道。将一张载玻片放入细胞培养皿中，并将培养皿置于加热至 37 摄氏度的铝制金属块上。然后将塞子插入1号和4号端口。使用200微升带斜面的移液枪头，向3号加样端口加入15微升改良的RPMI 1640 HEPES培养基。接着将移液枪头插入2号端口，以中等偏快的速度吸取15微升液体，从而预先充满连接通道以及两侧的供液通道。用盖子盖住加样口二和三，并将趋化迁移小室置于密闭的湿盒内的支架上，放入一个干燥且无二氧化碳的37摄氏度培养箱中。为分离巨噬细胞，将一根24号塑料导管插入一只已处死的3至4月龄小鼠的腹腔内，使用5毫升塑料注射器以冰冷的、不含钙和镁的Hank's平衡盐溶液冲洗腹腔。将收集到的灌洗液转移至离心管中，于300 × g离心6.5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 200 微升改良的 RPMI 1640 培养基中。取部分细胞悬液，按 1:20 比例稀释，然后使用细胞计数仪对细胞进行计数。将细胞稀释至终浓度为每毫升10 × 10⁶个细胞，并在37 °C的加热铝块中维持。用移液器将细胞悬液上下吹打5次以减少细胞团块，然后轻柔地将10 µL加入趋化室的第3孔。将移液器吸头置于第2孔，缓慢将细胞悬液吸入连接通道中。一旦加入细胞悬液，立即拔掉第1和第4端口的塞子以停止流动，并在全部四个加样口上盖上盖帽。随后，将趋化实验载玻片置于37摄氏度的湿化孵育 chamber 中孵育2至3小时。使用倒置显微镜检查观察区域。然后将塞子插入加样口一和加样口二，并检查加样口三是否已完全充满培养基且无气泡。如有必要，使用无菌的27号注射器针头去除气泡。接下来，用100微升移液器吸取60微升培养基，并将吸头插入加样口三中。使用体积调节环缓慢而稳定地将培养基注入储液池，持续一到两分钟，直至培养基达到第四个加样口的顶部。为填充第二个储液池，将塞子从第一个端口移开，缓慢插入第三个端口。吸取 50 µL 培养基，将移液器吸头插入第四个加样口，缓慢将培养基注入第二个储液池，持续一到两分钟，直至培养基达到第一个加样口的顶部。向一个 2 毫升的微量离心管中加入 495 微升培养基，并加入 5 微升专利蓝 V。短暂涡旋混匀，然后加入 5.4 微升重组小鼠补体 C5a，再次涡旋混匀。确保 1 号端口顶部的浅凹处无培养基，然后加入 15 微升含专利蓝 V 的补体 C5a 培养基。然后将200微升移液枪头插入加样口四，缓慢旋转体积调节旋钮，使培养基吸入对侧储液池中。向加样口一的短垂直柱中吸入空气，直至液面-空气界面位于柱体中间位置。随后在轻轻从加样口四取出移液枪头之前，先封闭加样口一，并确保载片位置不变，再缓慢封闭加样口四。进行延时成像时，将趋化性载玻片置于配备载物台培养箱的倒置显微镜上，使用10倍相差物镜对观察区域进行成像，并聚焦于巨噬细胞的片状伪足。用于小鼠腹腔巨噬细胞延时视频显微镜观察的趋化性载玻片包含三个趋化性腔室，每个腔室具有四个加样孔。细胞被接种于每个腔室的观察区域内。经过两到三小时的孵育后，逐渐向室中加入培养基。当观察区域的细胞被检查时，多达三分之二的细胞已被冲走。通常，弱黏附的B-1细胞被洗脱，而残留的细胞主要为巨噬细胞。为了区分巨噬细胞与B细胞，将 freshly isolated cells 用特异性抗体进行标记。巨噬细胞标记绿色荧光，B细胞标记红色荧光，细胞核标记蓝色荧光。通过向两个储液池之一加入趋化因子补体C5a，以研究巨噬细胞的迁移行为。记录了巨噬细胞在补体C5梯度中迁移的轨迹。将每条迁移轨迹的起始点归一化为X等于零、Y等于零，以生成迁移图。随后，计算单个巨噬细胞的迁移速度和趋化效率。该技术已用于研究G蛋白亚基、Rho GTP酶以及巨噬细胞在趋化性中的运动作用。

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科研

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免疫学与感染

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