利用蓝光与红移通道视紫红质进行长距离辅助回路定位以绘制下丘神经元环路图谱

通道视紫红质辅助的环路定位是一种用于长程神经投射功能定位的精确技术。在此，我们展示了如何利用该方法研究听觉脑干中的神经环路。在脑片中，来自多个来源的轴突通常相互混杂，使得通过电刺激难以分离出单个输入。

通过使用CRACM，可以克服这一局限性。确定lambda并准确定义立体定位坐标系具有挑战性，同时还需要尽可能缩短操作时间。仔细规划所有步骤将提高实验成功率。

首先用70%乙醇喷洒手术区域以进行消毒，并放置无菌毛巾单覆盖手术区域。清除笼具中的垫料，以降低恢复期间发生窒息的风险。接着，在笼具下方放置加热垫，并提供食物和水源。

接下来，将动物转移至立体定位仪中并持续麻醉。插入直肠温度探针，并打开恒温控制器。然后，涂抹眼用软膏以防止眼睛干涩。

给予预先镇痛药物。最后，使用电动剪发器剃除头皮毛发，并用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭三次对头皮进行消毒。

开始手术时，沿颅顶正中线做切口，切口起始于两耳之间，向前延伸至眼睛前方，暴露人字缝和冠状缝。将皮肤推向一侧，必要时清除暴露骨面上的骨膜。接着，用手术标记笔标记人字缝，调整纳米注射器的尖端，使其刚好接触人字缝，然后将显微操作仪的坐标归零。

使用纳米注射器针头和显微操作仪测量λ点与前囟缝之间的高度差。调节调色板杆的高度，使λ点与前囟的高度差控制在±100微米以内。利用纳米注射器针头和显微操作仪的坐标系统定位注射位点，并用外科标记笔标记该位置。

然后，使用装有0.5毫米钻头的微型电机钻在注射位点上方进行颅骨开孔。为了确保目标核团内神经元的广泛转染，使用纳米注射器在组织的不同深度进行注射；对于较大的脑区（如下丘），则需在不同的X和Y坐标位置进行两次或多次穿刺注射。注射下丘时，在Z轴方向2,250微米至1,750微米深度范围内，每隔250微米注射20纳升病毒。

向背侧耳蜗核注射时，分别在深度4,750微米和4,550微米处各注入20纳升病毒。每次在某一Z坐标注射后，需等待2至3分钟，再将注射针移至下一个Z坐标，以使病毒有足够时间从注射部位扩散，降低纳米注射针重新定位时病毒被吸回注射通道的可能性。最后一次注射完成后，需再等待3至5分钟，然后将纳米注射针从脑组织中缓慢撤出。

在两次穿刺之间以及更换实验动物时，当纳米注射器从脑中取出后，从尖端推出少量病毒液，以检查尖端是否堵塞。注射完成后，用无菌 PBS 湿润头皮切口边缘，然后轻柔地将皮肤向中线复位。使用 6-0 尼龙缝线进行间断单纯缝合关闭切口。

然后，将 0.5 至 1 毫升的 2% 利多卡因凝胶涂抹于伤口处。取下耳杆和温度探头，关闭异氟烷，将动物从固定板上取下并转移至恢复笼中。最后，密切监测其恢复情况。

当动物完全清醒、能够自由活动且无任何疼痛或痛苦迹象时，将其放回笼中，并将笼子送回动物房。采用标准膜片钳方法进行记录。首先将脑片置于直立式显微镜的固定切片记录室中，并以每分钟2毫升的速度持续灌流人工脑脊液。

接下来，在可视控制下使用合适的膜片钳放大器对神经元进行膜片钳记录。最后，在全细胞记录过程中，通过市售的LED递送470纳米光的短暂脉冲以激活Chronos，或递送580纳米光的短暂脉冲以激活ChrimsonR。结果显示，ChrimsonR注射导致DCN中出现强烈表达，tdTomato荧光在细胞和纤维中均可见。

在对侧下丘（ICC）中，注射三周后可清晰观察到被tdTomato强烈标记的纤维，表明当ChrimsonR-tdTomato构建体被注射至听觉脑干核团时，具有长距离示踪的能力。光学激活ChrimsonR可在下丘VIP神经元中诱发出兴奋性突触后电位（EPSPs），说明当实验参数要求使用红光而非蓝光时，ChrimsonR是进行长距离CRACM实验的有效工具。然而，我们发现ChrimsonR也可被蓝光有效激活，其对蓝光激活的阈值与Chronos相同。

对于本实验方案，最重要的是确保立体定位坐标准确，并确认病毒仅在目标脑区表达。通过将 Chronos ChrimsonR 病毒载体替换为其他病毒（例如，细胞特异性的 Flex 病毒），可以在不改变手术方案的情况下回答多种解剖学或生理学问题。