Name: 具有蓝色和红移通道性通道性神经元的长距离通道多普辛辅助电路映射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 了解通道视紫红质辅助电路映射技术，用于精确绘制听觉脑干长程神经投射。本方法利用ChrimsonR光遗传学工具，通过立体定位手术和膜片钳记录，帮助研究人员解析神经元连接动态与功能。

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本工作得到了德国研究基金会研究奖学金（GO 3060/1-1，项目编号 401540516，授予 DG）和美国国立卫生研究院资助 R56 DC016880（MTR）的支持。

获得当地机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并遵守美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物照护与使用的指南。本方案中的所有操作程序均已通过密歇根大学IACUC的批准，并符合NIH关于实验动物照护与使用的指南要求。
1. 手术准备
<ol>
	<li>在无菌条件下进行手术。手术前对所有手术器械和材料进行高压灭菌/消毒。手术时穿戴手术服和口罩。</li>
	<li>对手术区域进行消毒（用70%乙醇喷洒并擦拭），并铺上无菌毛巾单以覆盖手术区域。</li>
	<li>准备恢复笼。移除笼内垫料以降低窒息风险。在笼子下方放置加热垫，并提供食物和水源。</li>
	<li>使用拉针仪将玻璃毛细管拉制成纳米注射器用针头。拉制过程中加热丝的高温可对玻璃毛细管进行灭菌。剪断或折断针尖，获得直径约为5 µm的开口。</li>
	<li>将毛细管针尖修磨成约30°的斜面，以提高组织穿透能力并减少堵塞。用矿物油从后端填充毛细管，并插入纳升注射仪中。</li>
	<li>取适量所需编码通道视紫红质的重组腺相关病毒（rAAV），用无菌PBS稀释至目标滴度。 
	注：我们发现血清型1的rAAV在听觉脑干核团转染中效果良好。具体而言，rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH（蓝光激活通道视紫红质）和rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH（红移通道视紫红质）可从公开可及的载体库和载体中心获得，这些载体在CRACM实验中 consistently 能实现通道视紫红质的高表达水平和良好的长距离轴突运输。</li>
	<li>按照注射仪说明书操作，用1–3 µL无菌PBS中的rAAV对毛细管前端进行填充。</li>
</ol>
2. 手术
<ol>
	<li>将动物放入诱导室，通过校准的异氟烷蒸发器以3%异氟烷在氧气中诱导麻醉。观察小鼠直至其呼吸变得深而缓慢，且脚趾夹捏反射消失，约需3-5分钟。</li>
	<li>将动物转移至立体定位仪。通过将动物的嘴部置于带有气体麻醉面罩的腭杆上，并将非穿刺式耳棒插入双侧耳道，固定动物头部。</li>
	<li>插入直肠温度探针，并开启恒温控制器。</li>
	<li>涂抹眼用软膏以防止眼睛干燥。</li>
	<li>给予预先镇痛处理（例如，皮下注射5 mg/kg卡洛芬）。</li>
	<li>根据麻醉深度将异氟烷浓度调整至1-2.5%。在手术过程中至少每15分钟监测一次体温、呼吸及黏膜颜色。</li>
	<li>使用电动剪刀剃除头皮毛发。以聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭三次，进行头皮无菌准备。</li>
	<li>沿中线做头皮切口，起始于两耳之间并向眼前方延伸，暴露人字缝和前囟缝。必要时将皮肤向两侧推开，并去除暴露骨面上的骨膜。</li>
	<li>用无菌外科标记笔标记人字缝，将纳米注射器尖端置于刚好接触人字缝的位置，并将显微操作仪坐标归零。使用纳米注射器尖端和显微操作仪测量人字缝与前囟缝之间的高度差。调节腭杆高度，使人字缝与前囟缝的高度差控制在±100 µm以内。</li>
	<li>利用纳米注射器尖端和显微操作仪坐标系统定位注射位点，并用无菌外科标记笔标记该位置。对P21-P30小鼠的IC或DCN进行注射时，使用相对于人字缝的坐标，如表1所示。请注意，我们的坐标中Z轴深度是从人字缝处颅骨表面开始测量的。</li>
	<li>使用配备无菌0.5 mm钻头的微型电机钻在注射位点上方进行颅骨开窗。</li>
	<li>为确保目标核团内神经元的广泛转染，应在组织不同深度进行注射（表1，Z坐标）；对于IC等较大脑区，应在不同X和Y坐标处进行两次或多次穿刺注射（表1，右侧IC穿刺1和右侧IC穿刺2）。</li>
	<li>执行注射。对于IC注射，在Z轴方向（注射深度）2,250 µm至1,750 µm之间，每隔250 µm注入20 nL病毒。对于DCN注射，分别在4,750 µm和4,550 µm深度各注入20 nL病毒。</li>
	<li>每次在某一Z坐标完成注射后，等待2-3分钟再将注射器移至下一个Z坐标。这将为病毒从注射位点扩散提供时间，降低纳米注射器重新定位时病毒被吸回注射通道的可能性。</li>
	<li>完成一次穿刺中的最后一次注射后，等待3-5分钟再将纳米注射器从脑组织中撤出。</li>
	<li>在穿刺间或动物间取出纳米注射器时，从尖端排出少量病毒以检查尖端是否堵塞。</li>
	<li>注射完成后，用无菌PBS润湿头皮切口边缘，然后轻柔地将皮肤复位至中线。使用6-0（0.7公制）尼龙缝线行间断缝合关闭切口。</li>
	<li>在伤口处涂抹0.5-1 mL的2%利多卡因凝胶。</li>
	<li>移除耳棒和温度探针，关闭异氟烷，将小鼠从腭杆上取下并转移至恢复笼中。</li>
	<li>密切监测恢复情况。当动物完全清醒、能够自主活动且无疼痛或不适表现时，将其转移回饲养笼，并将笼子送回动物房。</li>
	<li>若当天需对多只动物进行手术，应在下一次手术前使用热珠灭菌器对手术器械和钻头进行消毒。</li>
</ol>
3. 外科手术随访
<ol>
	<li>在接下来的10天内，每天检查动物的伤口愈合情况、感染迹象或疼痛与痛苦的表现，并严格遵守所在机构的动物护理指南。</li>
	<li>在将动物用于实验前，需等待3至4周，以确保视蛋白通道蛋白得到最佳表达。</li>
</ol>
4. 脑切片制备及注射靶点确认
<ol>
	<li>进行CRACM实验时，使用从转染动物急性制备的脑切片，在标准的体外电生理实验中进行，此处仅简要描述（详见Goyer等，2019年的更详细说明27）。</li>
	<li>配制人工脑脊液（ACSF），其成分为（单位：mM）：125 NaCl、12.5 D-葡萄糖、25 NaHCO3、3 KCl、1.25 NaH2PO4、1.5 CaCl2、1 MgSO4。用95% O2混合5% CO2气体饱和ACSF，调节pH至7.4。</li>
	<li>所有后续步骤，包括体外电生理记录，均应在近黑暗环境或红光下进行，以避免视蛋白通道（channelrhodopsins）被激活。</li>
	<li>用异氟烷深度麻醉小鼠后迅速断头，将脑组织在约34 °C的ACSF中快速取出并进行解剖。</li>
	<li>在约34 °C的ACSF中使用振动切片机切割包含下丘（IC）的冠状切片（厚度200–250 µm），并将切片置于充满经95% O2混合5% CO2气体饱和的ACSF的孵育室中，在34 °C下孵育30分钟。孵育完成后，将切片存放于室温下，待记录时使用。</li>
	<li>如果注射靶区并非下丘（IC），则需额外切割注射脑区的冠状切片，并在荧光显微镜下检查靶核团的转染情况。若靶核团无转染，或在其他脑区出现额外转染，则不应继续实验。</li>
</ol>
5. 体外记录与CRACM实验
注意：为了对 Chronos 和 ChrimsonR 进行光刺激，我们使用与显微镜落射荧光端口耦合的发光二极管（LED）。然而，也可以使用激光器替代 LED。如果使用激光器，须事先获得机构安全主管部门的批准，并遵循相应的激光安全使用指南。
<ol>
	<li>使用硼硅酸盐玻璃拉制电极，使其电阻达到 3.5–4.5 MΩ。电极内液应包含（单位为 mM）：115 K-葡萄糖酸盐、7.73 KCl、0.5 EGTA、10 HEPES、10 Na2磷酸肌酸、4 MgATP、0.3 NaGTP，并添加 0.1% 生物胞素（w/v），用 KOH 调节 pH 至 7.3，用蔗糖调节渗透压至 290 mOsm/kg。</li>
	<li>采用标准膜片钳技术进行记录。将脑片置于直立显微镜的固定式记录室中，并以约 2 mL/min 的速度持续灌注 ACSF。在接近生理温度（约 34–36 °C）下进行记录。</li>
	<li>在可视化条件下使用合适的膜片钳放大器对神经元进行封接。校正串联电阻、移液管电容和液接电位。</li>
	<li>在全细胞记录期间，通过商用 LED 传递短脉冲（1–5 ms）的 470 nm 光激活 Chronos，或传递短脉冲的 580 nm 光激活 ChrimsonR。确定视蛋白激活的阈值，并采用最小刺激方案诱发突触后电位。通常情况下，使用能够诱发突触后电位（PSP）的最短刺激持续时间，并将光功率设定为诱发 PSP 所需阈值功率的 120%。</li>
	<li>为确认所记录的膜电位变化确实是神经元的突触输入，可在实验过程中灌注兴奋性/抑制性突触后受体的标准拮抗剂。为研究不同受体对 PSP 的贡献（例如 NMDA 受体与 AMPA 受体），可灌注相应的受体拮抗剂。对于每种受体拮抗剂，药物效应应在洗脱后可逆。</li>
	<li>利用 PSP 的潜伏期、抖动（jitter）和可靠性来确认光激活的突触输入来源于记录神经元上突触的直接光学激活，而非来源于表达通道视紫红质的中间神经元突触的间接激活。通常情况下，低潜伏期（&#60;2 ms）、低抖动（潜伏期标准差 &#60;1 ms）和高可靠性（&#62;50%）表明通道视紫红质表达的突触前神经元与记录神经元之间存在直接突触连接。</li>
</ol>

<ol><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FLEX+Switch+Targets+Channelrhodopsin-2+to+Multiple+Cell+Types+for+Imaging+and+Long-Range+Circuit+Mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetics.</a> Nature Methods. 8, 26-29 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11, 338-346 (2014).</li>
<li>Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Progress+and+Prospects%3A+Recombinant+adeno-associated+virus+%28rAAV%29+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.</a> Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).</li>
<li>Aponte-Ubillus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+design+for+recombinant+adeno-associated+virus+%28rAAV%29+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).</li>
<li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13, 325-328 (2016).</li>
<li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReaChR%3A+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).</li>
<li>Mager, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+neural+spiking+and+auditory+signaling+by+ultrafast+red-shifted+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Hooks, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Channel+Photostimulation+for+Independent+Excitation+of+Two+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations.</a> Current Protocols in Neuroscience. 85, e52(2018).</li>
<li>Schild, L. C., Glauser, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Color+Neural+Activation+and+Behavior+Control+with+Chrimson+and+CoChR+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 1029-1034 (2015).</li>
<li>Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Tools+for+Subcellular+Applications+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience.</a> Neuron. 96, 572-603 (2017).</li>
<li>Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrally+distinct+channelrhodopsins+for+two-colour+optogenetic+peripheral+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 485(2018).</li>
<li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li>
<li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+cochlear+nucleus+projections+to+the+inferior+colliculus+in+the+cat%3A+A+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study.</a> Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).</li>
<li>Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+to+the+inferior+colliculus+from+the+anteroventral+cochlear+nucleus+in+the+cat%3A+Possible+substrates+for+binaural+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction.</a> Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).</li>
<li>Glendenning, K. K., Masterton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+chiasm%3A+efferent+projections+of+the+lateral+superior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive.</a> Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).</li>
<li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending+projections+to+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ascending projections to the inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).</li>
<li>Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+cortical+projections+to+the+cat+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).</li>
<li>Saldaña, E., Merchań, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+commissural+connections+of+the+rat+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus.</a> Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).</li>
<li>Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentrations+of+divalent+cations+isolate+monosynaptic+inputs+from+local+circuits+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).</li>
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<li>Winer, J. A., Schreiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWiner%2C+JA+%22The+inferior+colliculus%3A+with+168+illustrations%22">The inferior colliculus: with 168 illustrations</a>. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).</li>
<li>Goyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+class+of+inferior+colliculus+principal+neurons+labeled+in+vasoactive+intestinal+peptide-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice.</a> eLife. 8, e43770(2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们发现，CRACM 是一种强大的技术，可用于鉴定和表征小鼠下丘神经元的长程突触输入。按照本文详述的方案，我们成功实现了耳蜗核（DCN）和下丘（IC）神经元的高效转染，并可靠地将 Chronos 和 ChrimsonR 转运至下丘突触末梢。此外，我们证明该技术能够对突触后事件进行测量与分析，包括突触后电位（PSP）的幅度、半宽、衰减时间以及受体药理学特性。我们的经验表明，该方法可轻松拓展应用于听觉脑干及其他脑区的功能性环路图谱研究。
总体而言，光遗传学环路示踪在特异性方面相较于轴突的电刺激具有明显优势。通过病毒转染，可将通道视紫红质的表达在空间和分子层面上特异性地限制于目标突触前神经元群体。相比之下，当来自不同突触前核团的轴突相互混杂时（大多数脑区均存在此情况），电刺激无法区分这些轴突。此外，电刺激可能同时引发顺向传导和逆向传导的动作电位，若远端刺激位点包含起源于记录位点附近神经元的轴突，则会进一步增加实验解释的复杂性。
为了确保视蛋白通道在神经元中的稳定表达和良好的轴突运输，选择合适的病毒载体和血清型至关重要。我们发现，在下...

突触连接对神经环路功能至关重要，但神经环路中突触的精确拓扑结构和生理特性往往难以通过实验手段进行探测。这是因为电刺激——细胞电生理学的传统工具——会无选择性地激活刺激位点附近的轴突，而在大多数脑区，来自不同来源（局部、上行和/或下行）的轴突相互交织。然而，通过使用通道视紫红质辅助环路作图技术（channelrhodopsin assisted circuit mapping, CRACM）1,2，这一局限性如今可以被克服3。通道视紫红质（ChR2）是一种光激活的阳离子选择性离子通道，最初发现于绿色藻类Chlamydomonas reinhardtii。ChR2可被波长约为450–490 nm的蓝光激活，通过阳离子内流使细胞去极化。Nagel及其同事首次在Xenopus卵母细胞中描述并表达了ChR24。此后不久，Boyden及其同事5在哺乳动物神经元中表达了ChR2，并证明可通过光脉冲在毫秒时间尺度上可靠地控制神经元放电，在蓝光激活ChR2后约10 ms诱导产生动作电位。近年来已发现具有更快动力学特性的光遗传学通道（例如Chronos6）。
CRACM实验的基本方法是将携带编码光敏通道蛋白基因的重组腺相关病毒（rAAV）转染至一群假定的突触前神经元中。通过rAAV转染神经元后，可表达其所编码的光敏通道蛋白。通常，该光敏通道蛋白会与荧光蛋白（如GFP（绿色荧光蛋白）或tdTomato（一种红色荧光蛋白））融合标记，以便通过荧光成像轻松确认目标区域神经元的转染情况。由于rAAV无致病性，具有较低的炎症反应潜力，并能实现持久的基因表达7,8，因此已成为将光敏通道蛋白递送至神经元的标准技术。在假定的突触前神经元群体转染后，若通过光脉冲激活光敏通道蛋白可在目标神经元中诱发出突触后电位或电流，则表明该转染核团与记录细胞之间存在轴突连接。由于在脑片实验中，即使被切断的轴突也可通过光敏通道蛋白的激活驱动神经递质释放，因此CRACM可用于识别位于急性脑片之外但其轴突投射至突触后脑区的核团。该技术的优势在于，能够直接研究已识别的长距离突触输入的连接性及其生理特性。
除了可被蓝光激发的通道视紫红质外，研究人员最近还鉴定出若干种红移通道视紫红质9,10，其中包括Chrimson及其更快的类似物ChrimsonR，二者均可被约660 nm的红光激发6。红移视紫红质备受关注，是因为红光比蓝光具有更强的组织穿透能力，且红光的细胞毒性可能低于蓝光10,11,12。红移通道视紫红质还为双色CRACM实验提供了可能，从而可在单次实验中检测来自不同核团的轴突在同一神经元上的汇聚情况6,13,14。然而，目前的红移视紫红质在蓝光照射下常出现非特异性交叉激活现象15,16,17，这使得双色实验难以实施。此外，一些研究报道指出ChrimsonR在轴突中的转运能力有限，这可能使其在CRACM实验中的应用面临挑战16,17。
几乎所有来自低位脑干听觉核团的上行投射都会汇聚于下丘（IC），即中枢听觉通路的中脑枢纽。这些投射包括来自耳蜗核（CN）18,19、大部分上橄榄复合体（SOC）20，以及外侧丘系的背侧（DNLL）和腹侧（VNLL）核团21的纤维。此外，来自听觉皮层的大范围下行投射也终止于下丘18,19,20,21,22，而下丘神经元本身也在局部以及对侧下丘叶内广泛形成突触连接23。由于来自多种来源的轴突相互混杂，利用电刺激手段研究下丘神经环路一直存在困难24。因此，尽管下丘神经元在声音定位以及言语和其他通讯声音识别中执行着重要的计算功能25,26，但其神经环路的组织结构在很大程度上仍不清楚。我们近期将VIP神经元鉴定为下丘中首个可被分子标记识别的神经元类型27。VIP神经元是一类谷氨酸能星形神经元，可投射至多个远距离靶区，包括听觉丘脑和上丘。目前我们能够确定这些VIP神经元所接收的局部及远距离输入的来源及其功能，并进一步阐明这些环路连接如何参与声音信息的处理。
本文所述方案专为研究小鼠下丘（IC）中VIP神经元的突触输入而设计，特别是来自对侧下丘和背耳蜗核（DCN）的输入（图1）。该方案可轻松适用于不同的输入来源、不同类型的神经元或完全不同的脑区。我们还证明，ChrimsonR是一种有效的红移型通道视紫红质，适用于听觉脑干中长距离环路的绘制。然而，我们发现即使在低强度下，蓝光也能强烈激活ChrimsonR，因此，在双色CRACM实验中将ChrimsonR与Chronos联合使用时，必须设置严谨的对照，以防止ChrimsonR的交叉激活。

<table><tbody><tr><td>AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH</td><td>Addgene</td><td>59171-AAV1</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td><td>Addgene</td><td>59170-AAV1</td><td></td></tr><tr><td>Ai14 报告基因小鼠 (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>货号 #007914</td><td></td></tr><tr><td>琥珀色 (590 nm) LUXEON Rebel LED</td><td>Luxeon Star LEDs</td><td>SP-01-A8</td><td></td></tr><tr><td>蓝色 (470 nm) LUXEON Rebel LED</td><td>Luxeon Star LEDs</td><td>SP-01-B4</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬 (Carprofen)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>59149</td><td></td></tr><tr><td>Drummond 玻璃毛细管</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject 3</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-300-207</td><td></td></tr><tr><td>电极斜面修整仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>FG-BV10-D</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 6-0 (0.8 公制) 尼龙缝合线</td><td>Ethicon</td><td>本地药房</td><td></td></tr><tr><td>固定式显微镜</td><td>任意品牌</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>气体麻醉头固定装置</td><td>David Kopf Instruments</td><td>933-B</td><td></td></tr><tr><td>常规手术器械</td><td>Fine Science Tools</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Golden A5 宠物电推剪</td><td>Oster</td><td>078005-010-003</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>定制组装</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>带真空系统的罩式诱导麻醉室</td><td>Patterson Scientific</td><td>78917760</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器 Steri 250</td><td>Inotech</td><td>IS-250</td><td></td></tr><tr><td>10% 碘溶液</td><td>MedChoice</td><td>本地药房</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷挥发罐</td><td>Patterson Scientific</td><td>07-8703592</td><td></td></tr><tr><td>2% 利多卡因外用凝胶</td><td>Akorn</td><td>本地药房</td><td></td></tr><tr><td>微型电机钻 1050</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>7094351</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 微型电机钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>电动显微操作仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285/R</td><td></td></tr><tr><td>眼科人工泪液软膏</td><td>Akorn</td><td>本地药房</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器（含数据采集软件）</td><td>任意品牌</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>便携式麻醉机</td><td>Patterson Scientific</td><td>07-8914724</td><td></td></tr><tr><td>小型动物立体定位仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>930-B</td><td></td></tr><tr><td>常规化学品</td><td>本地供应商</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>常规成像溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌手术巾单</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>外科标记笔</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>定制组装</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>任意品牌</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>VIP-IRES-Cre 小鼠 (Viptm1(cre)Zjh/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>货号 #010908</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>任意品牌</td><td>不适用</td><td></td></tr></tbody></table>

利用蓝光与红移通道视紫红质进行长距离辅助回路定位以绘制下丘神经元环路图谱

Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins

在研究神经环路时，离体膜片钳技术的一个常见局限性在于，来自多个来源的轴突通常相互混杂，使得通过电刺激难以分离出单个来源的输入信号。然而，通过使用通道视紫红质辅助环路示踪技术（CRACM），这一局限性现已可被克服。本文介绍一种利用CRACM技术绘制来自低阶听觉脑干核团的上行输入以及投射至下丘（IC）特定神经元类型的对侧连合输入的方法，其中下丘是听觉系统中的中脑核团。在IC中，局部、对侧、上行及下行轴突高度交织，因此无法通过电刺激加以区分。通过向突触前核团注射病毒载体以驱动通道视紫红质的表达，随后进行膜片钳记录以鉴定表达通道视紫红质的突触输入的存在及其生理特性，即可实现从特定来源到特定IC神经元群体投射的细胞类型特异性示踪。我们证明，该方法可同时适用于Chronos（一种蓝光激活的通道视紫红质）和ChrimsonR（一种红移型通道视紫红质）。与以往前脑研究的报道不同，我们发现ChrimsonR能够有效转运至耳蜗背核主神经元的轴突中，表明ChrimsonR可能成为脑干CRACM实验中的有效工具。本文提供的实验方案详细描述了颅内病毒注射手术的操作流程，包括针对小鼠耳蜗背核和下丘进行注射时的立体定位坐标，以及如何将全细胞膜片钳记录与通道视紫红质激活相结合，以研究投射至IC神经元的长程连接。尽管本方案专为表征下丘的听觉输入而设计，但也可轻松调整用于研究听觉脑干及其他脑区的其他长程投射。

我们将 VIP-IRES-Cre 小鼠（Viptm1(cre)Zjh/J）与 Ai14 Cre 报告基因小鼠（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J）杂交，以获得 F1 代子代，其中 VIP 神经元表达荧光蛋白 tdTomato。实验使用了任一性别的 F1 代子代，年龄为出生后第 21 天（P21）至第 70 天（P70）。本研究共使用了 22 只动物。
使用 表1 中所示的坐标，将 AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH 注射至 VIP-IRES-Cre x Ai14 小鼠右侧下丘（IC）的立体定位注射，导致右侧下丘出现强烈的 Chronos-EGFP 表达（图2A）。通过肉眼观察...

通道视紫红质辅助的环路示踪技术（CRACM）是一种用于精确绘制解剖学和/或遗传学上可识别的神经元群体之间长程神经投射功能连接图谱的技术。本文中，我们描述了如何利用CRACM技术绘制听觉脑干连接图谱，包括使用一种红移视蛋白ChrimsonR的方法。

在研究神经回路时，体外膜片钳技术的一个常见局限性是，来自多个来源的轴突常常相互混杂，……

通道视紫红质辅助的环路定位是一种用于长程神经投射功能定位的精确技术。在此，我们展示了如何利用该方法研究听觉脑干中的神经环路。在脑片中，来自多个来源的轴突通常相互混杂，使得通过电刺激难以分离出单个输入。通过使用CRACM，可以克服这一局限性。确定lambda并准确定义立体定位坐标系具有挑战性，同时还需要尽可能缩短操作时间。仔细规划所有步骤将提高实验成功率。首先用70%乙醇喷洒手术区域以进行消毒，并放置无菌毛巾单覆盖手术区域。清除笼具中的垫料，以降低恢复期间发生窒息的风险。接着，在笼具下方放置加热垫，并提供食物和水源。接下来，将动物转移至立体定位仪中并持续麻醉。插入直肠温度探针，并打开恒温控制器。然后，涂抹眼用软膏以防止眼睛干涩。给予预先镇痛药物。最后，使用电动剪发器剃除头皮毛发，并用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭三次对头皮进行消毒。开始手术时，沿颅顶正中线做切口，切口起始于两耳之间，向前延伸至眼睛前方，暴露人字缝和冠状缝。将皮肤推向一侧，必要时清除暴露骨面上的骨膜。接着，用手术标记笔标记人字缝，调整纳米注射器的尖端，使其刚好接触人字缝，然后将显微操作仪的坐标归零。使用纳米注射器针头和显微操作仪测量λ点与前囟缝之间的高度差。调节调色板杆的高度，使λ点与前囟的高度差控制在±100微米以内。利用纳米注射器针头和显微操作仪的坐标系统定位注射位点，并用外科标记笔标记该位置。然后，使用装有0.5毫米钻头的微型电机钻在注射位点上方进行颅骨开孔。为了确保目标核团内神经元的广泛转染，使用纳米注射器在组织的不同深度进行注射；对于较大的脑区（如下丘），则需在不同的X和Y坐标位置进行两次或多次穿刺注射。注射下丘时，在Z轴方向2,250微米至1,750微米深度范围内，每隔250微米注射20纳升病毒。向背侧耳蜗核注射时，分别在深度4,750微米和4,550微米处各注入20纳升病毒。每次在某一Z坐标注射后，需等待2至3分钟，再将注射针移至下一个Z坐标，以使病毒有足够时间从注射部位扩散，降低纳米注射针重新定位时病毒被吸回注射通道的可能性。最后一次注射完成后，需再等待3至5分钟，然后将纳米注射针从脑组织中缓慢撤出。在两次穿刺之间以及更换实验动物时，当纳米注射器从脑中取出后，从尖端推出少量病毒液，以检查尖端是否堵塞。注射完成后，用无菌 PBS 湿润头皮切口边缘，然后轻柔地将皮肤向中线复位。使用 6-0 尼龙缝线进行间断单纯缝合关闭切口。然后，将 0.5 至 1 毫升的 2% 利多卡因凝胶涂抹于伤口处。取下耳杆和温度探头，关闭异氟烷，将动物从固定板上取下并转移至恢复笼中。最后，密切监测其恢复情况。当动物完全清醒、能够自由活动且无任何疼痛或痛苦迹象时，将其放回笼中，并将笼子送回动物房。采用标准膜片钳方法进行记录。首先将脑片置于直立式显微镜的固定切片记录室中，并以每分钟2毫升的速度持续灌流人工脑脊液。接下来，在可视控制下使用合适的膜片钳放大器对神经元进行膜片钳记录。最后，在全细胞记录过程中，通过市售的LED递送470纳米光的短暂脉冲以激活Chronos，或递送580纳米光的短暂脉冲以激活ChrimsonR。结果显示，ChrimsonR注射导致DCN中出现强烈表达，tdTomato荧光在细胞和纤维中均可见。在对侧下丘（ICC）中，注射三周后可清晰观察到被tdTomato强烈标记的纤维，表明当ChrimsonR-tdTomato构建体被注射至听觉脑干核团时，具有长距离示踪的能力。光学激活ChrimsonR可在下丘VIP神经元中诱发出兴奋性突触后电位（EPSPs），说明当实验参数要求使用红光而非蓝光时，ChrimsonR是进行长距离CRACM实验的有效工具。然而，我们发现ChrimsonR也可被蓝光有效激活，其对蓝光激活的阈值与Chronos相同。对于本实验方案，最重要的是确保立体定位坐标准确，并确认病毒仅在目标脑区表达。通过将 Chronos ChrimsonR 病毒载体替换为其他病毒（例如，细胞特异性的 Flex 病毒），可以在不改变手术方案的情况下回答多种解剖学或生理学问题。

long-range-channelrhodopsin-assisted-circuit-mapping-inferior

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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