Name: 生物材料膜上人与羊角膜内皮细胞层的生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 学习角膜内皮细胞培养方法，防止上皮间质转化，利用人源或羊源角膜组织建立原代细胞层。该技术为角膜再生医学和移植提供可持续的细胞来源。

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感谢 Noémie Gallorini 在准备图7过程中提供的帮助。本研究由澳大利亚国家卫生与医学研究理事会向 DH 资助的项目基金（项目编号 1099922）以及昆士兰眼科研究所基金会提供的补充资金支持。

在获得捐赠者用于研究的知情同意后，人角膜样本由昆士兰眼库提供，并经昆士兰卫生服务南部大都会医院人类研究伦理委员会伦理批准（HREC/07/QPAH/048）后使用。绵羊角膜样本来自根据组织共享协议在昆士兰大学赫斯顿医学研究设施处实施安乐死的动物。
1. 解剖工具的准备
<ol>
	<li>通过将两把4号钟表匠镊子浸泡在70%乙醇溶液中5分钟或进行高压灭菌，对其进行灭菌处理。</li>
</ol>
2. 培养基与组织培养板的准备
<ol>
	<li>配制100 mL培养基，包含Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1、5%胎牛血清以及100 U/mL青霉素-链霉素。该培养基适用于绵羊角膜内皮细胞培养；然而，对于人角膜内皮细胞培养，需额外添加50 µg/mL牛垂体提取物、0.08%硫酸软骨素、200 µg/mL氯化钙和0.3 mM L-抗坏血酸-2-磷酸。培养基可在4 °C避光条件下保存两周。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用贴壁因子对6孔组织培养板的各孔进行包被，然后向每个包被后的孔中加入1 mL培养基。每只角膜对应准备一个孔。</li>
</ol>
3. 组织块解剖与细胞培养步骤
<ol>
	<li>将角膜内皮面朝上置于解剖显微镜载物台上的无菌培养皿中。调节照明，使角膜表面充分照亮，并具有足够的对比度以凸显内皮层。调节放大倍数，使角膜边缘及部分中央区域的内皮可见。</li>
	<li>使用灭菌的钟表镊轻轻提起并撕下后弹力层（Descemet's membrane），使其与下方的基质分离（图1）。该膜会以条带状从基质上脱离，并立即卷曲。将此条带放入已包被贴壁因子并含有1 mL培养基的6孔板中的一个孔内。组织培养板的盖子应始终盖上，仅在接种外植体时打开，以降低污染风险。</li>
	<li>首先从内皮的最外周区域取下后弹力层条带，之后再取中央区域的条带。将同一角膜获取的所有条带放入6孔板的同一个孔中。</li>
	<li>将外植体置于设定为5% CO2、37 °C的湿化细胞培养箱中孵育。培养期间静置培养物2天，以使外植体沉降并贴附于培养板表面。通常，最多有三分之一的外植体无法贴壁。</li>
	<li>4天后移除培养基及未贴壁的外植体，并小心加入2 mL新鲜培养基，注意不要扰动已贴壁的外植体。培养基应每周更换两次。</li>
</ol>
4. 通过连续植块培养法持续生产角膜内皮细胞
注意：10 天后可将外植块转移至新的组织培养板，以建立额外的角膜内皮细胞培养物。
<ol>
	<li>将外植体培养物置于解剖显微镜的载物台上，调节光源和放大倍数，使外植体清晰可见。</li>
	<li>使用灭菌的钟表匠镊子，轻轻从培养板中夹取每个外植体，并转移至已包被贴附因子并含有1 mL培养基的6孔组织培养板的新孔中。</li>
	<li>让外植体在新培养板表面贴附沉降4天，然后将培养基更换为2 mL新鲜培养基。此后每周更换培养基两次。</li>
</ol>
5. 在玻璃盖玻片上培养角膜内皮细胞用于免疫荧光分析
注意：用于免疫荧光分析的细胞培养物应接种于玻璃盖玻片上，染色后可将盖玻片封片于载玻片上进行观察。
<ol>
	<li>将一包直径为13 mm的圆形玻璃盖玻片在高压灭菌器中灭菌，或用70%乙醇浸泡15分钟，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗三次。</li>
	<li>将单个盖玻片放入24孔组织培养板的各孔中，用贴壁因子包被，然后每孔加入0.5 mL培养基。</li>
	<li>使用灭菌的钟表匠镊子将外植体从其组织培养板中取出，转移至含有盖玻片的孔中。让外植体在盖玻片上贴附4天后再更换培养基。</li>
	<li>经过所需的孵育时间后，在培养孔内对盖玻片上的细胞进行固定和染色。将染色后的盖玻片安装到玻璃显微镜载片上，用于荧光显微镜下的分析。</li>
</ol>
6. 使用Dispase II对角膜内皮细胞进行传代培养
注意：在对6孔板中的组织块培养物进行传代前，可使用本方案选择性地去除较大的成纤维样细胞。若需对所有细胞进行传代，则无需执行步骤6.2至6.4。本方案的目的是在尽可能保持细胞间接触的同时，将细胞转移至新的培养板中。操作过程中应轻柔处理细胞。完全汇合的孔应按1:2的比例传代，而未完全汇合的孔则应按1:1或更低的比例传代。
<ol>
	<li>移除培养基，并用DPBS短暂冲洗。</li>
	<li>加入1 mL Versene，室温孵育30秒。</li>
	<li>移除Versene，加入1 mL TrypLE，在组织培养箱中37 °C孵育3分钟。</li>
	<li>使用相差显微镜观察培养物。轻轻敲击培养容器，使细胞从培养板上脱落。一旦成纤维样大细胞从板上脱落，立即用1 mL移液器吸除这些细胞和TrypLE。用2 mL DPBS冲洗剩余细胞两次，以去除残留的TrypLE。</li>
	<li>向培养物中加入1 mL 1 mg/mL Dispase II，在组织培养箱中孵育1至2小时，或直至所有细胞从培养板上脱落。细胞应逐渐以团块形式从培养板上漂浮脱落。</li>
	<li>用1 mL移液器收集细胞，转移至50 mL离心管中的20 mL DPBS中。室温下以300 × g 离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用1 mL移液器将细胞沉淀在1 mL培养基中轻轻吹打重悬。将细胞悬液转移至6孔板的一个或两个孔中，传代比例分别为1:1或1:2。</li>
	<li>每孔补加培养基至2 mL，将培养物放入组织培养箱中。每周更换两次新鲜培养基，每次2 mL。</li>
</ol>
7. 生物材料膜上角膜内皮细胞层的培养
注意：以下步骤描述了将膜状生物材料安装至定制的安装装置（称为微型Boyden小室）中以进行细胞培养的过程。有关该装置的更多信息及购买详情，请参阅我们近期的出版物6。
<ol>
	<li>将红色O形圈放入微型Boyden小室上腔的中心位置，组装其上腔部分。</li>
	<li>使用直径为18 mm的环钻在聚四氟乙烯（PTFE）切割板上的生物材料片上切取一个圆片，并将其放置于微型Boyden小室上腔的红色O形圈上。</li>
	<li>将下腔拧紧至上腔上，使生物材料圆片被牢固夹持在中间。</li>
	<li>将组装好的微型Boyden小室浸泡于70%乙醇中1小时，以进行灭菌处理。</li>
	<li>将灭菌后的微型Boyden小室完全浸入无菌HBSS中10分钟，以去除乙醇残留；重复此洗涤步骤两次。最后用无添加物的培养基洗涤10分钟。</li>
	<li>将灭菌后的微型Boyden小室转移至6孔板的孔中，置于培养基内，确保上腔位于上方。调节培养基液面高度，使其接触生物材料膜的下表面，但不流入上腔内。</li>
	<li>按照第6节所述方法制备角膜内皮细胞悬液。细胞悬液应达到足够密度，以确保在微型Boyden小室的膜上接种密度至少为100,000个细胞/cm2。微型Boyden小室内的培养表面积为0.5 cm2，可容纳100 µL体积，因此应制备含有500,000个细胞/mL的细胞悬液。</li>
	<li>用移液器将100 µL细胞悬液（含50,000个细胞）加入微型Boyden小室的膜上。在组织培养孵箱中孵育4小时后，补充培养基至完全浸没小室。按实验所需时间继续培养，每周更换培养基两次。 
	注意：一旦角膜内皮细胞贴附于生物材料膜的上表面，即可将微型Boyden小室在培养孔内翻转，使下腔位于上方。随后可向腔内加入更多细胞，以在膜的另一侧启动新的细胞培养。例如，可将角膜基质细胞直接接种至膜的另一侧，从而模拟后部角膜中不同类型角膜细胞的相对位置。</li>
</ol>

<ol><li>Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).</li>
<li>Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Corneal transplantation.</a> The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).</li>
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<li>Walshe, J., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+explant+culture+provides+novel+insights+into+the+potential+location+and+phenotype+of+corneal+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells.</a> Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).</li>
<li>Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+corneal+endothelial+cells+from+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation of corneal endothelial cells from sheep.</a> Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).</li>
<li>Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+An+Update+on+the+Culture+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).</li>
<li>Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+human+corneal+endothelial+cells+isolated+from+paired+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas.</a> PLoS One. 6 (12), 28310(2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

建立和扩增人角膜内皮细胞时面临的一个重要技术挑战是防止细胞在培养过程中发生上皮-间质转化（EMT）。角膜内皮细胞在失去细胞间接触时可能触发EMT，然而目前大多数针对这些细胞的培养方案在分离和传代过程中均涉及使用酶将细胞解离为单细胞10。本文提出一种替代性的角膜内皮细胞培养方案，可在细胞分离和传代阶段最大限度地降低细胞间接触丢失的风险。
我们建立角膜内皮细胞培养的方法，是将供体角膜的内皮/后弹力膜组织块置于组织培养板中，在适宜条件下使细胞从膜上集体迁移并附着到培养板上。为确保成功，组织块必须与组织培养板形成紧密贴附，因此在培养建立后的数天内应避免扰动培养板。另一个影响人角膜内皮细胞培养成功建立的关键因素是供体年龄。通常，来自年龄小于30岁的供体的培养成功率更高。
采用组织块培养法建立角膜内皮细胞培养物的一个缺点是，从建立培养到获得大量细胞之间所需时间相对较长。所谓“剥离-消化”法，是指将内皮从供体角膜上剥离下来，并用酶进行消化以释放细胞用于培养1...

角膜是位于眼球前部的一种透明组织。它主要由三层结构组成：外层的上皮层、中间的基质层以及内层称为角膜内皮的细胞层。角膜内皮是一层单层细胞，附着于基底膜（即后弹力层）之上，通过调节从下方房水中进入基质层的液体量来维持角膜的透明性。基质层内液体过多会导致角膜水肿、混浊以及视力丧失。因此，内皮层对于维持正常视力至关重要。
角膜内皮可能由于多种原因发生功能障碍，包括衰老、疾病和损伤，目前唯一的治疗方法是移植手术。在该手术中，患者角膜的内皮和后弹力层被移除，并替换为来自供体角膜的内皮和后弹力层移植物。许多内皮移植物还包含一层薄的基质组织，以利于操作以及与受体角膜的附着1。
全球范围内，角膜移植手术对供体角膜组织的需求量超过了眼库所能提供的数量2。因此，人们致力于开发组织工程角膜内皮移植物，以缓解这一短缺状况3。这一策略的理论基础在于：目前，单个供体角膜的内皮仅能用于一位患者；然而，若能先在组织培养中将角膜内皮细胞扩增，并使其生长于生物材料支架上，则可使一份供体组织用于多位患者的治疗。
在组织工程角膜内皮移植成为外科医生可行的选择之前，需要解决的主要挑战包括：（1）建立高质量角膜内皮细胞的扩增技术，以及在体外生成成熟且具有功能的角膜内皮细胞层的技术；（2）建立在生物材料支架上培养细胞的技术，以制造出与目前使用的供体角膜来源移植物相当甚至更优的组织工程移植物。
角膜内皮细胞在体内增殖潜能极低，但可在体外被刺激发生分裂4。然而，这些细胞在体外具有强烈的上皮-间质转化（EMT）倾向，这会降低其形成成熟且功能性内皮层的能力。已知诱导角膜内皮细胞发生EMT的因素包括暴露于某些生长因子以及细胞间接触的丧失5。因此，在传代过程中经酶消化解离的角膜内皮细胞培养物几乎不可避免地会发生与EMT相关的改变。本文介绍一种适用于人或绵羊角膜内皮细胞的细胞培养方法，旨在尽量减少在细胞分离、扩增和传代过程中对细胞间接触的破坏，从而降低EMT的发生风险。此外，我们还展示了如何通过在定制的支架装置中将培养的细胞层生长于生物材料膜的两侧，来制备类似于供体角膜来源的内皮层/后弹力层/基质组织移植物的组织工程移植物。

<table><tbody><tr><td>黏附因子</td><td>Gibco</td><td>S006100</td><td>含有明胶的1倍无菌溶液，用于包被组织培养表面。4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>牛垂体提取物</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>单支小瓶含25 mg。分装后冷冻保存。</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Merck</td><td>C5670</td><td>溶于HBSS中配制成1 mM的储存液。过滤除菌。</td></tr><tr><td>离心管，50 ml</td><td>Labtek</td><td>650.550.050</td><td></td></tr><tr><td>硫酸软骨素</td><td>LKT Laboratories</td><td>C2960</td><td>为牛源性硫酸软骨素。溶于HBSS中配制成0.08 g/mL的储存液。过滤除菌后分装冷冻。</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>溶于DPBS中配制成2 mg/mL的储存液。过滤除菌后分装冷冻。</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Labtek</td><td>EA043</td><td>100%未变性乙醇应使用去离子水稀释至70%，用于器械和表面的消毒。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td><td>SH30084.03</td><td>此为HyClone品牌的胎牛血清。</td></tr><tr><td>盖玻片 No. 1，&amp;Oslash; 13 mm</td><td>Proscitech</td><td>G401-13</td><td>将灭菌后的盖玻片放入24孔板中用于组织培养。</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Hank's平衡盐溶液，1倍浓度，含氯化钙和氯化镁。</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸</td><td>Merck</td><td>A8960</td><td>溶于HBSS中配制成150 mM的储存液。过滤除菌。</td></tr><tr><td>微型Boyden小室</td><td>CNC Components Pty. Ltd.</td><td>上环：QUT-0002-0006，底环：QUT-0002-0007</td><td>两个部件均由聚四氟乙烯（PTFE）制成。</td></tr><tr><td>微型Boyden小室用O型圈</td><td>Ludowici Sealing Solutions</td><td>RSB012</td><td>由硅橡胶制成。</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>51985-034</td><td>含谷氨酰胺的低血清培养基。</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Dulbecco's磷酸盐缓冲液，1倍浓度，不含氯化钙和氯化镁。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100倍抗生素溶液，含10,000 单位/mL青霉素和10,000 &amp;micro;g/mL链霉素。</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.14473.001</td><td>无菌培养皿，92 × 16 mm，用于组织解剖。</td></tr><tr><td>组织培养板，24孔</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3524</td><td>含24个孔的培养板，每个孔的表面积为2 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>组织培养板，6孔</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3516</td><td>含6个孔的培养板，每个孔的表面积为9 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>1倍酶溶液，用于细胞解离。</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td>1倍EDTA溶液，用于细胞解离。</td></tr><tr><td>钟表匠镊子</td><td>Labtek</td><td>BWMF4</td><td>4号钟表匠镊子适用于从角膜上剥离内皮层/后弹力层组织条带。</td></tr></tbody></table>

在生物材料膜上培养人和羊角膜内皮细胞层

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

角膜内皮细胞培养物在失去细胞间接触后容易发生上皮-间质转化（EMT）。EMT对细胞有害，因其会降低细胞形成成熟且功能性单层的能力。本文介绍一种建立和传代人及绵羊角膜内皮细胞培养物的方法，该方法可最大程度减少细胞间接触的丢失。从供体角膜获取角膜内皮/后弹力膜的组织块，置于组织培养条件下，使细胞能够集体迁移至培养表面。一旦培养物建立，即将组织块转移至新的培养板以启动新培养。使用Dispase II温和地将细胞团块从组织培养板上分离，用于传代。采用本方案建立的角膜内皮细胞培养物适用于转移至生物材料膜上，以制备用于动物实验移植的组织工程化细胞层。文中描述了一种用于在组织培养过程中支撑生物材料膜的定制装置，并展示了一个组织工程移植物的实例：在I型胶原膜的两侧分别构建一层角膜内皮细胞和一层角膜基质细胞。

从人或绵羊角膜中分离和扩增角膜内皮细胞的方法总结于图1和图2中。来源于1至2岁绵羊或年龄小于30岁的人供体角膜的大多数外植体，通常在一周内会附着于包被有附着因子（Attachment Factor）的组织培养板上；然而，也有约三分之一的外植体在此期间未能附着，这种情况并不罕见。这些“漂浮”的外植体可从培养物中移除。来源于年龄大于30岁人供体的外植体附着于培养板的可能性较低，且产生细胞培养物的可能性也较小。由绵羊和人外植体生成的角膜内皮细胞培养的代表性图像见图3和图4。从外植体迁移出的细胞在向培养板表面迁移过程中通常保持彼此间的接触。这种迁移方式被称为集体细胞迁移，是上皮细胞的一个特征7。培养约2周后，在来自绵羊和人角膜的许多外植体附近，均会形成小而紧密排列的细胞区域8。这些细胞区域不表现出上皮-间质转化（E...

本方案描述了从人或绵羊组织的外植体中建立和培养角膜内皮细胞培养物所需的关键步骤。同时介绍了一种在膜状生物材料上对角膜内皮细胞进行传代培养的方法。

角膜内皮细胞培养物在失去细胞间接触后容易发生上皮-间质转化（EMT）。EMT 是……

本细胞培养方案旨在防止角膜内皮细胞在分离、扩增和传代培养过程中发生上皮-间质转化。细胞培养物由角膜组织外植体建立，外植体可重复利用，从而确保从一位供体持续获得原代细胞。首先，按照制造商的说明，用贴壁因子包被六孔组织培养板的各孔。然后向每个编码的孔中加入一毫升培养基。将角膜内皮面朝上放置在解剖显微镜载物台上的无菌培养皿中。调节照明，使角膜表面充分照亮，并具有足够的对比度以突出显示内皮层，调节变焦倍数，使角膜边缘及部分中央内皮区域可见。使用灭菌的钟表匠镊子轻轻提起并撕下后弹力膜，使其与下方的基质分离。将膜条放入已准备好的培养板孔中，并确保立即盖上培养板盖子，以降低污染风险。首先从内皮边缘最外围区域取下后弹力膜条，随后再取中央区域的膜条，并将同一角膜的所有膜条放入同一个孔中。完成后，将外植体放入设定为37摄氏度和5%二氧化碳的加湿细胞培养箱中孵育。通过将一个红色O型圈放入中心来组装微型Boyden小室的上室。使用直径为18毫米的环钻在聚四氟乙烯（PTFE）切割板上的生物材料片上打孔取出圆片。然后，将圆盘置于微型 Boyden 小室上室的红色 O 形圈上。将下室拧到上室上，将生物材料圆盘固定在两者之间。将组装好的微型 Boyden 小室浸泡在 70% 乙醇中一小时以进行灭菌。浸泡后，将小室完全浸入无菌的HBSS中10分钟，以去除乙醇。然后将小室在培养基中洗涤10分钟。接着转移至六孔板中某孔的培养基内，确保上层小室朝上放置。调节培养基的液面高度，使其接触生物材料膜的下表面，但不流入上室。用移液器将 100 微升细胞悬液加入微孔 Boyden 小室中的膜上，在组织培养孵箱中孵育 4 小时，然后再加入培养基完全浸没小室。大多数来源于 1 至 2 岁绵羊或年龄小于 30 岁人类供体角膜的组织块，可在一周内附着于带有附着因子编码的组织培养板上。六周后，在组织块旁边出现了许多小而致密的细胞。角膜内皮细胞培养物中，小而致密的细胞对三联消化具有较强抗性，而较大的成纤维样细胞则对三联消化更为敏感。利用这一差异，可在将小细胞转移至新培养板之前，选择性地去除培养物中的大细胞。对角膜内皮细胞培养物进行了免疫荧光分析，以定位紧密连接蛋白 ZO-1 和黏附连接蛋白 N-钙黏蛋白。绵羊和人类细胞使用相同的抗体，两种蛋白均在两种物种细胞的质膜中被检测到。自制的微型 Boyden 小室可同时将膜的两侧用作细胞培养表面。组织工程细胞构建物的横截面视图显示，一侧表面为单层角膜内皮细胞，另一侧则为多层角膜基质细胞培养层。在执行该方案时，需注意在用镊子将后弹力层从角膜上剥离时，避免刮伤内皮层。完成该操作后，可通过测量膜上角膜内皮细胞层的电阻来评估其完整性。

growth-human-sheep-corneal-endothelial-cell-layers-on-biomaterial

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

生物材料膜上人与羊角膜内皮细胞层的生长

细胞间的Ca2+波由间隙连接通道和半通道驱动。本文介绍一种用于测量单层细胞在局部单细胞机械刺激下产生细胞间Ca2+波的方法，并阐述其在研究间隙连接通道和半通道特性及其调控机制中的应用。...

机械刺激诱导的单层细胞中钙波传播：以牛角膜内皮细胞为例

我们报道了一种在电纺丝膜内制造微孔结构以研究细胞行为的技术。具体而言，我们描述了一种结合微立体光刻与电纺丝的方法，用于制备具有微结构特征的PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）角膜生物材料装置。...

结合微立体光刻与静电纺丝技术制备用于角膜再生的带壁龛结构膜

本文展示了在人糖尿病供体角膜器官培养模型中，利用腺病毒基因治疗使角膜上皮干细胞标志物表达显著降低及伤口愈合延迟等异常情况趋于正常化的实例。同时，还描述了在富含干细胞的角膜缘上皮细胞培养体系中对该治疗过程的优化方法。...

用于糖尿病性角膜病变的腺病毒基因治疗：对人器官培养角膜和角膜缘上皮细胞伤口愈合及干细胞标志物表达的影响

使用牛角膜内皮细胞的原代培养研究角膜内皮-间充质转化的机制。此外，采用大鼠角膜内皮冷冻损伤模型以证实角膜内皮-间充质转化的发生 体内.

体外 和 在体 内 研究角膜内皮-间质转化的模型

本方案描述了一种新型的三维 体外...

角膜组织工程：一种 体外 人角膜基质-神经相互作用模型

我们描述了一种构建视网膜组织的方法，该组织由人多能干细胞分化而来的视网膜色素上皮细胞组成，并将其培养于人羊膜上，进而制备用于动物模型移植的移植物。...

由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

本文描述了一种用于角膜伤口愈合研究的离体角膜器官培养模型的实验方案。该模型系统可用于评估药物在有序的三维多细胞环境中促进再生性愈合或产生药物毒性的效应。...

离体角膜器官培养模型在伤口愈合研究中的应用

本文介绍了一种猪角膜瓣的制备与培养的逐步操作方案。由于该类器官型培养的器官培养模型在15天内的细胞死亡率与人供体角膜相当，因此成为首个无需添加有毒右旋糖酐即可实现非人角膜长期培养的模型。...

一种利用分割角膜瓣构建的猪角膜内皮器官培养模型

本文介绍了一种使用掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光从后弹力层（DM）上分离角膜内皮细胞（CEC）的实验方案，作为大泡性角膜病变（BK）的离体疾病模型。...

一种非侵入性激光辅助角膜内皮细胞丢失实验模型的建立

单纯后弹力层剥离术（Descemet's Stripping Only，DSO）是一种实验性手术方法，适用于因福克斯内皮角膜营养不良（Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy）导致中央角膜出现滴状赘疣的患者，通过剥离后弹力层，促使周边细胞再生内皮层。本文提出一种新的方法，模拟在体外（ex...

一种仅进行后弹力层剥离的人类角膜器官培养模型及其由工程化成纤维细胞生长因子1促进的加速愈合

本文介绍一种通过胶原酶A和胰蛋白酶序贯消化从小鼠完整角膜获取高质量单细胞悬液的实验方案。该方法获得的单细胞具有较高的RNA完整性和活性，适用于单细胞RNA测序和流式细胞术等下游应用。y.

从小鼠角膜获取单细胞悬液的实验方案

学习角膜内皮细胞培养方法，防止上皮间质转化，利用人源或羊源角膜组织建立原代细胞层。该技术为角膜再生医学和移植提供可持续的细胞来源。

在生物材料膜上培养人和羊角膜内皮细胞层

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