使用头太空气色谱对斑马鱼胚胎中的乙醇水平进行定量
2020年2月11日
这项工作描述了一种使用头部空间气相色谱从适当的暴露方法到胚胎加工和乙醇分析来量化斑马鱼胚胎中乙醇水平的协议。
该协议意义重大，因为它有助于了解乙醇在开发斑马鱼胚胎时的药代动力学，这将有助于在斑马鱼研究中标准化乙醇暴露制度。我们技术的主要优点是，它允许研究人员在胚胎发育期间快速、可重复地测量乙醇水平，特别是在没有血液供应的胚胎中。该方法可以方便地应用于其他模型系统以及其他环境因素，并采用适当的技术和设备设置。
我预计首次执行此协议的个人将难以在胚胎加工过程中以必要的速度防止乙醇蒸发。首先将10个胚胎与额外的胚胎液体转移到1.5毫升的微离心管中，其标记的线为250微升。向填充线添加水。
为脱光样品准备额外的微离心管。为了去除胆小菜，在100毫米培养皿中孵育胚胎，每毫升蛋白酶鸡尾酒在胚胎培养剂中孵育10分钟。每隔几分钟轻轻旋转一次盘子，以打破菜。
一旦所有的胚胎都摆脱胆小球，从蛋白酶鸡尾酒中去除它们，用新鲜介质洗两次。然后将胚胎移植到100毫米的新鲜培养皿中。当所有样品都准备好进行体积测量时，使用具有最小尖端的 P200 微移子，小心地从胚胎周围取出所有液体。
以小于 0.1 毫克的精度称水，然后通过减去 250 微升去除的水的重量来确定 10 个胚胎的体积。要确定单个胚胎的体积，请将差值除以 10。从交配罐中收集胚胎，并把它们放在一个标准的100毫米培养皿中，然后在28.5摄氏度下孵育。
受精后6小时，将多达100个胚胎移植到具有胚胎培养和1%乙醇或培养新培养皿中。盖上，但不要密封培养皿，并把它们放在28.5摄氏度的培养箱18小时或直到它们达到24小时后受精。使用两个 P200 微管设置为 50 微升，将蛋白酶鸡尾酒溶液吸进一个，然后放入第二个溶液中。
然后用玻璃移液器将10个胚胎快速放在1.5毫升的微离心管中，并关闭盖子。对所有样品进行测试、控制和乙醇处理胚胎重复此过程。一次使用一个样本，快速打开瓶盖，用 P200 微移子设置为 200 微升来吸气所有残留胚胎介质。
快速但轻轻地添加和去除50微升的水，然后添加50微升蛋白酶鸡尾酒，并关闭管盖。让样品在室温下坐10分钟，然后快速加入450微升的5摩尔氯化钠，并关闭管盖。通过涡旋10分钟使样品均质，将两个微升上流液转移到气相色谱小瓶中。
用聚四氟乙烯盖密封小瓶。完成启动方法后，加载 436 电流 SPME 乙醇两到五分钟 RG 运行。从分析软件中对样本列表中每个样本的方法菜单中的冰毒。
从空气、水和五个摩尔氯化钠蛋白酶鸡尾酒空白开始填写样品列表。然后按0.3125到40毫摩尔的顺序输入乙醇标准。遵循标准与第二轮空白。
输入所有均质胚胎上能样品，从最低到最高预测乙醇浓度进行测试，然后进入第三轮空白。将气相色谱小瓶按样品输入的顺序添加到自动取样器中，让它们加热 10 到 15 分钟。然后使用软件开始示例运行。
完成所有运行后，通过在示例列表中添加最终示例并运行备用文件来激活关闭方法。备份在示例运行期间获取的所有数据。关闭方法完成后，单击打开的色谱图并打开包含结果的文件夹。
样品会自动集成到此程序中。在结果中，确保已集成正确的峰值。确认所有样品后，打印或导出结果。
在图形上绘制乙醇标准的峰值高度，然后计算斜率、y-intercept 和 r 平方值。通过从标准的 y-intercept 中减去样品的峰值高度，并除以标准的斜率，获取每个样品的乙醇值。要计算胚胎中的乙醇浓度，计算每个样品的稀释因子，并乘以该稀释因子的样品乙醇值。
最后，通过将介质乙醇值乘以稀释因子10来计算介质参考样本。为了正确计算胚胎乙醇的浓度，测量了胚胎在胚胎中和从卵子中去除的体积。在这项分析中，胚胎占胆子内总体积的56%。
根据先前发表的作品，73.6%作为所有提出的分析的胚胎含水量。这导致水包括胚胎体积1.1微升的0.82微升。在总的体积中，49%包含在胚胎中，51%包含在外质流体中。
在气相色谱分析中，对两组15个样品及其处理介质进行了每组测量5次。第一组的介质乙醇水平为143.6毫摩尔，第二组为133.6毫摩尔。第一组和第二组胚胎的乙醇浓度平均为63.5毫摩尔和53.1毫摩尔。
计算了每个样品的胚胎乙醇浓度与乙醇介质水平的比率。第一组有44%的介质乙醇水平，而组有40%的媒体乙醇水平。未经处理的控制胚胎以零毫摩尔介质乙醇浓度测量。
尝试此过程时，要记住的最重要的事情是，正确处理胚胎进行GC分析至关重要，因为乙醇是挥发性且会迅速蒸发的。描述执行此步骤的最佳方法，但需要练习以发展适当的肌肉记忆。这一程序将有助于规范斑马鱼的乙醇处理制度，并允许今后的工作解剖乙烷致畸的遗传和细胞机制。
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概述
这项工作描述了一种使用头部空间气相色谱法来量化斑马鱼胚胎中乙醇水平的协议。该方法有助于理解胚胎发育过程中乙醇的药代动力学。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 药理学
背景
- 斑马鱼胚胎是研究发育过程的常用模型。
- 了解乙醇对胚胎的影响对毒理学研究至关重要。
- 当前测量乙醇水平的方法可能效率不高。
- 该协议旨在标准化斑马鱼研究中的乙醇暴露。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来测量斑马鱼胚胎中的乙醇水平。
- 增强对早期发育中乙醇药代动力学的理解。
- 提供一种适用于其他模型系统和环境因素的技术。
使用的方法
- 头部空间气相色谱法用于乙醇量化。
- 将胚胎转移到微离心管中进行处理。
- 使用水来在分析过程中保持胚胎水分。
- 快速处理以最小化乙醇蒸发。
主要结果
- 该协议允许快速和可重复地测量乙醇水平。
- 即使在没有血液供应的胚胎中也是有效的。
- 乙醇暴露方案的标准化是可行的。
- 该方法可以适应各种实验设置。
结论
- 该协议显著改进了斑马鱼研究中的乙醇测量。
- 它为未来关于发育过程中乙醇影响的研究提供了基础。
- 研究人员可以在适当设置的情况下将这种方法应用于其他环境因素。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardizing ethanol exposure quantification addresses variability in zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders, improving reproducibility in mechanistic toxicology studies. Reliable measurement of embryonic ethanol levels enables predictive de-risking of teratogenicity assays and supports cross-laboratory data alignment. This capability strengthens target validation workflows by providing pharmacokinetic context for ethanol-induced developmental phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ethanol dose-response relationships in developing embryos, clarifying mechanistic links between exposure and phenotypic outcomes.
- Operational Value: Provides quantitative ethanol concentration data to de-risk target hypotheses in ethanol teratogenicity models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible ethanol measurements to standardize assay conditions across embryonic developmental stages.
- Operational Value: Supports high-throughput preparation of embryo samples for consistent toxicant exposure profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates alignment of zebrafish ethanol exposure with human-relevant pharmacokinetic metrics for translational biomarker development.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying internal dose in embryos independent of maternal metabolism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by providing internal dose quantification that informs hazard assessment and lead identification in developmental toxicology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ethanol-induced developmental defects through precise exposure quantification.
- Screening: Delivers standardized, quantitative ethanol readouts essential for assay reproducibility and compound screening readiness.
- Analytics: Generates peak height and concentration data enabling statistical comparison of treatment groups and exposure conditions.
- Translational Research: Connects embryonic ethanol levels to human-equivalent exposure metrics, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical capability for quantifying volatile compounds in small-volume biological samples across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in developmental toxicity models by reducing variability in ethanol exposure quantification.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of ethanol treatment protocols across laboratories and experimental batches.
- Strategic Value: Informs better go/no-go decisions in early toxicology screening by providing accurate internal dose metrics.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds or genetic models based on quantified embryonic ethanol burden.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microvolume manipulation, and gas chromatography operation.
- Dependent on access to headspace GC equipment, autosampler, and temperature-controlled incubation systems.
- Necessitates standardized embryo staging and volume measurement protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for different embryo volumes, chorion states, and environmental matrices.
- Practical limitation: Ethanol volatility demands rapid sample processing to prevent evaporation losses during preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Measuring the Embryonic Volume Using Water Displacement
2:14
Treating Embryos with Ethanol
2:50
Processing Embryos for Head Space Gas Chromatography
3:58
Sample Measurements Using Gas Space Chromatography
5:04
Sample Ethanol Peak Integration and Concentration Analysis
6:06
Results: Ethanol Levels in Early Embryonic Zebrafish
7:38
Conclusion
