Name: 使用头太空气色谱对斑马鱼胚胎中的乙醇水平进行定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习使用顶空气相色谱法定量斑马鱼胚胎中的乙醇水平，以研究乙醇药代动力学。该方法可快速、可重复地测量发育中的胚胎乙醇浓度，有助于标准化乙醇暴露方案。

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本研究由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）先前资助项目 R01DE020884（J.K.E. 负责）、美国国立卫生研究院/国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIH/NIAAA）先前资助项目 F32AA021320（C.B.L. 负责），以及美国国立卫生研究院/国家酒精滥用研究所（NIH/NIAAA）当前资助项目 R00AA023560（C.B.L. 负责）支持。我们感谢 Rueben Gonzales 提供并协助进行气相色谱分析。我们感谢 Tiahna Ontiveros 和 Gina Nobles 博士在撰写方面提供的帮助。

本实验所使用的所有斑马鱼胚胎均按照既定的IACUC方案进行培育和饲养27。这些方案已获得德克萨斯大学奥斯汀分校和路易斯维尔大学的批准。
注意：本研究使用了斑马鱼品系 Tg(fli1:EGFP)y128。实验中使用的所有水均为无菌反渗透水。所有统计分析均使用 Graphpad Prism v8.2.1 进行。
1. 胚胎培养基的制备
<ol>
	<li>制备20倍浓缩胚胎培养基：将17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl2、0.41 g K2HPO4、0.142 g Na2HPO4 以及 4.9 g MgSO4·7H2O 溶解于1 L 水中。形成的白色沉淀可忽略，不影响培养基效果。对浓缩液进行过滤除菌，并于4 °C 保存。</li>
	<li>制备工作浓度胚胎培养基：将1.2 g NaHCO3 溶解于1 L 20倍浓缩胚胎培养基中，再加入19 L 水。将工作浓度胚胎培养基维持在28 °C。</li>
</ol>
2. 利用水的排量测量胚胎体积
注意：本方案中使用受精后24小时（hpf）的胚胎（图1）。用于体积测量的胚胎不用于乙醇分析。
<ol>
	<li>将10个胚胎及胚外液置于已标记体积的1.5 mL微量离心管中 250 μL (图2A）。加水至 250 μL 填充管线（参见含染色水的样品） 图2B).</li>
	<li>重复步骤 2.1，为已去除绒毛膜的胚胎设置培养容器。
	<ol>
		<li>为去除卵膜，将带有卵膜的胚胎置于盛有胚胎培养液的100 mm培养皿中，加入终浓度为2 mg/mL的蛋白酶混合液，在室温（RT）下处理10分钟。每隔几分钟轻轻晃动胚胎，以破裂卵膜。</li>
		<li>所有胚胎脱去绒毛膜后，将去膜胚胎从蛋白酶混合液/胚胎培养基中取出，放入盛有新鲜胚胎培养基的新100 mm培养皿中清洗胚胎。重复此清洗步骤1次（共清洗2次）。将胚胎转移至另一个洁净的100 mm培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用尽可能细小的枪头，小心地用 P200 移液器从胚胎周围去除所有液体，避免损伤胚胎图2C）并使用天平称量水的重量 &lt;0.1 mg 精度。为确定 10 个胚胎样本的体积，需减去从样本中移除的水的质量/体积（1 mL 水 = 1 g 水）。 250 μL. 为确定单个胚胎的体积，将两者之间的差值除以 250 μL 以及通过10去除的水的重量</li>
</ol>
<img alt="胚胎体积计算公式：体积 = 250μL - 移除水的重量；公式分析。" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">
<img alt="胚胎体积计算公式，表示为方程：Volume_sample/10。" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2">
3. 用乙醇处理胚胎
<ol>
	<li>从交配缸中收集胚胎，并置于标准的 100 mm 培养皿中。每个培养皿中放置的胚胎数量不超过 100 个，并在 28.5 °C 下孵育。 
	注意：如果需要去除绒毛膜（步骤 2.2），则必须在添加乙醇前完成去除。</li>
	<li>在受精后 6 小时（6 hpf），将最多 100 个胚胎转移至新的标准 100 mm 培养皿中，培养基为胚胎培养液或含 1% 乙醇（v/v）的胚胎培养液。盖上皿盖，但切勿密封培养皿。将胚胎置于设定为 28.5 °C 的低温培养箱中孵育 18 小时，或直至胚胎发育至 24 hpf 的发育阶段。</li>
</ol>
4. 胚胎处理前用于顶空气相色谱分析的准备工作流程
<ol>
	<li>配制5 M NaCl水溶液（每个样品管需要450 μL），用于使所有蛋白质变性并防止乙醇代谢。在胚胎培养基中配制蛋白酶混合液（材料表），浓度为2 mg/mL。</li>
	<li>为每个样品标记一个1.5 mL微量离心管和一个2 mL气相色谱小瓶。另为下述乙醇标准品、空气、水以及5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样品分别标记额外的2 mL气相色谱小瓶。</li>
	<li>准备三支p200移液器，其中两支设定为50 μL，第三支设定为200 μL；一支p1000移液器设定为450 μL，以及一支p2移液器设定为2 μL。对于用于将胚胎从培养皿转移至1.5 mL微量离心管的玻璃移液管，需快速将管尖通过火焰灼烧以使边缘光滑，避免吸取胚胎时对其造成损伤。</li>
</ol>
5. 胚胎顶空气相色谱分析的处理
注意：为了在计算稀释因子时保持一致性，无论胚胎是否仍处于绒毛膜内，均采用相同的处理方式。
<ol>
	<li>使用两支已设定为 50 μL 的 p200 微量移液器，分别吸取 50 μL 蛋白酶混合液至其中一支，另一支吸取 50 μL 水。</li>
	<li>使用玻璃移液管和微量移液器，迅速将 10 个胚胎（来自步骤 3.2）放入 1.5 mL 微离心管中，并盖紧管盖（如 图 2A 所示）。对所有待测样本、对照组以及乙醇处理的胚胎重复此操作。</li>
	<li>使用设定为 200 μL 的 p200 微量移液器，迅速打开管盖并吸除所有残留的胚胎培养液（如 图 2C 所示）。迅速将装有 50 μL 水的移液器插入管中，快速但轻柔地加入水后再吸出，以免损伤胚胎。随后立即从待用的移液器中加入 50 μL 蛋白酶混合液，并盖紧管盖（图 2D）。 
	注意：该操作应逐个样本进行。</li>
	<li>让样本在室温下静置 10 分钟，使蛋白酶混合液降解卵膜。然后迅速加入 450 μL 5 M NaCl，并盖紧管盖（图 2E）。将样本涡旋振荡 10 分钟。为加快进程，可设置混合器同时对多个样本进行涡旋。 
	注意：对于发育超过 24 hpf 的胚胎，向管中加入少量（约 100 μL）硅胶珠混合物（两种尺寸：0.5 mm 和 1 mm 珠）。在较老的胚胎中，无论匀浆时间多长，脊索将保持完整。</li>
	<li>匀浆 10 分钟后，迅速取出 2 μL 匀浆胚胎上清液，加入气相色谱小瓶中。立即用聚四氟乙烯盖密封小瓶。</li>
</ol>
6. 准备培养基和乙醇标准品
<ol>
	<li>制备培养基标准品时，用 5 M NaCl/蛋白酶混合液将培养基稀释 10 倍。取每种样品各 2 μL 加入气相色谱瓶中，并用聚四氟乙烯盖密封。</li>
	<li>制备乙醇标准品时，将 100% 乙醇用 5 M NaCl/蛋白酶混合液进行系列稀释，得到以下浓度：0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 和 40 mM。取每种标准品各 2 μL 加入气相色谱瓶中，并用聚四氟乙烯盖密封。</li>
</ol>
7. 准备顶空气相色谱仪
注意：此装置和方案可能需要根据所使用的气相色谱仪进行调整。顶空气相色谱法用于定量乙醇含量，而非用于分离。
<ol>
	<li>将自动进样器的加热器设置为 58 °C 并打开。让加热器达到 58 °C，并打开通往气相色谱仪的空气和氢气气体线路（用于火焰离子化检测以定量乙醇）。 
	注意：应根据制造商的规格设置适当的 psi，以确保色谱仪正常运行。确保氦气管线已打开并设置为适当的 psi。</li>
	<li>对于隔膜，需确保注入的样品数量不是 &gt;100. 对于进样纤维，需确保注入的样品数量不超过 &gt;500. 
	注意：如果其中任意一项超过注射次数，则在运行测试样本前需要进行更换。</li>
	<li>打开分析软件，确保工作站已正确设置。根据实验室/部门标准存储所有数据。为待测样品创建新的样品列表。</li>
	<li>启动方法并等待火焰离子化检测器稳定后再运行样品。检测器稳定后，运行软件启动方法以清洗进样纤维。</li>
</ol>
8. 使用顶空气相色谱法进行样品检测
<ol>
	<li>启动方法完成后，在样本列表中为每个样本创建 1 个新行。从分析软件的方法菜单中，为样本列表上的每个样本加载 436 Current spme ethanol 2013 3min absorb 2_5min rg run.METH。
	<ol>
		<li>填写样本列表，首先输入空气、水、5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样本，然后按顺序输入标准品，浓度从 0.3125 mM 到 40 mM。标准品之后，再次输入第二轮空气、水和 5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样本。</li>
		<li>输入所有待测的匀浆胚胎上清液样本，按预测乙醇浓度从低到高排列。最后输入第三轮也是最终一轮的空气、水和 5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照样本列表中输入的顺序，将气相色谱小瓶加入自动进样器。让样本预热 10–15 分钟。在软件中启动样本运行。</li>
	<li>所有样本及最终空白样本运行结束后，在样本列表中添加最后一个样本并运行 standby.METH，通过软件激活关机方法。备份样本运行期间获取的所有数据。按以下顺序关闭设备：自动进样器加热器、氢气瓶，只有当色谱仪温度降至 30 °C 后，再关闭空气瓶。氦气瓶保持开启，以保护石蜡柱。</li>
</ol>
9. 样品乙醇峰积分与样品浓度分析
注意：从 9.3 开始的所有数值均在 Excel 文件中计算得出，所有方程已预先填入。
<ol>
	<li>关闭方法完成后，单击 打开 色谱图。打开包含结果的文件夹。该程序会自动对样品进行积分。</li>
	<li>在结果中，确保已对正确的峰进行了积分（乙醇峰位于 2 至 2.5 之间）。确认所有样品后，打印或导出结果。</li>
	<li>绘制乙醇标准品的峰高图。计算斜率、Y轴截距和R2 乙醇标准品的数值（R2 应为 &gt;0.99). 
	注意：这些数值将用于根据样品峰高确定乙醇浓度。</li>
	<li>对于每个样品，从乙醇标准品的Y轴截距中减去该样品的峰高，将所得数值除以乙醇标准品的斜率，从而得到每个GC小瓶中样品的乙醇含量值。</li>
</ol>
<img alt="乙醇浓度计算公式方程、乙醇含量示例计算、分析化学。" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3">
<ol start="5">
	<li>为计算胚胎中的乙醇浓度，首先计算每个样本的稀释倍数。取本方案第2.3步中计算出的体积测量值，除以该体积测量值加上500 μL。此值代表在胚胎处理过程中（步骤5.3和5.4）加入每个样本的5 M NaCl/蛋白酶混合液的体积。</li>
</ol>
<img alt="样品稀释倍数计算公式；胚胎体积计算；教学用方程式示意图。" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4">
<ol start="6">
	<li>根据此样品稀释倍数，乘以每个样品的乙醇测定值，结果将以 mM 浓度表示。对于培养基参考样品，将培养基乙醇值乘以 10 的稀释倍数进行计算。</li>
</ol>
<img alt="胚胎乙醇浓度计算公式（胚胎乙醇浓度 = 样品乙醇值 × 样品稀释倍数）" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 5">
<img alt="中位浓度计算公式：中位浓度 = 乙醇中位值 × 10；公式图表。" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 6">

<ol><li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome%3A+a+prospective+national+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archive+of+Diseases+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li>
<li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li>
<li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+%28PAE%29%3A+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li>
<li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+Alcohol+Consumption%3A+Studies+with+Mutant+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li>
<li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social%2C+cognitive+and+affective+behavioral+domains%3A+Insights+from+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li>
<li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li>
<li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067(2012).</li>
<li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li>
<li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse%3A+a+minireview%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li>
<li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li>
<li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li>
<li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSGenetics%22%5BJournal%5D)">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999(2012).</li>
<li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li>
<li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li>
<li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li>
<li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II%3A+microencephaly+and+neuronal+losses%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li>
<li>Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects%3A+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li>
<li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+%28nNOS%29+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research.+Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li>
<li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li>
<li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li>
<li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li>
<li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol%27s+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+Danio+%28Brachydanio%29+rerio%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li>
<li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemia+Medica%22%5BJournal%5D)">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li>
<li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+%28HS-GC-FID%29%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Testing+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li>
<li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li>
<li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li>
<li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+methanol%2C+acetaldehyde%2C+acetone%2C+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Human+and+Experimental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li>
<li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142(2012).</li>
<li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li>
<li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats%3A+effects+of+dose+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li>
<li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li>
<li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin%2C+Fgf%2C+and+sonic+hedgehog+function%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

作为发育生物学的模式系统，斑马鱼非常适合研究环境因素对发育的影响。它们可产生大量体外受精的胚胎，便于在乙醇研究中精确控制处理时间和剂量。结合活体成像能力以及与人类在遗传和发育上的保守性，斑马鱼成为畸形学研究中一种强大的模式系统。本文介绍了一种利用顶空气相色谱法测定发育中斑马鱼胚胎内乙醇浓度的实验方案。
确定胚胎中的乙醇浓度对于理解乙醇对发育中胚胎的影响至关重要。在啮齿类动物模型中，血液乙醇浓度与组织浓度相关26。然而，在斑马鱼的早期胚胎发育阶段，无法评估其血液中的乙醇水平。顶空气相色谱法已被用于测量多种实验范式中的乙醇浓度，包括斑马鱼模型25,30,31,32,33,<sup class="...

胎儿酒精谱系障碍（Fetal Alcohol Spectrum Disorders, FASD）描述了一组与胚胎期乙醇暴露相关的神经功能障碍及颅面畸形的广泛表型1多种因素，包括乙醇暴露的时间和剂量以及遗传背景，导致了胎儿酒精谱系障碍（FASD）的差异2,3在人类中，这些变量之间的复杂关系使得研究和理解胎儿酒精谱系障碍（FASD）的病因极具挑战性。动物模型在揭示乙醇致畸作用的机制基础方面已证明至关重要。多种动物模型系统已被用于研究FASD的各个方面，所得结果与人类暴露情况下的发现 remarkably consistent。4啮齿类动物模型系统被用于研究胎儿酒精谱系障碍（FASD）的多个方面，其中小鼠最为常用5,6,7. 本研究的大部分工作集中于早期乙醇暴露导致的发育缺陷8尽管后续暴露于乙醇也被证明会导致发育异常9此外，小鼠的遗传特性极大地增强了我们探究胎儿酒精谱系障碍遗传基础的能力10,11这些在小鼠中开展的研究强烈提示，乙醇与 sonic hedgehog 信号通路、视黄酸信号之间存在基因-乙醇相互作用， 超氧化物歧化酶，一氧化氮合酶I，Aldh2 和 Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21这些研究表明，动物模型对于增进我们对胎儿酒精谱系障碍（FASD）及其潜在机制的理解至关重要。
斑马鱼已成为研究乙醇致畸作用多个方面的强大模型系统22,23。由于其具有体外受精、繁殖力高、遗传操作性强以及活体成像能力等优势，斑马鱼非常适合用于研究乙醇致畸作用的时间、剂量和遗传因素。乙醇可被精确地施用于特定发育阶段的胚胎，随后通过成像技术观察乙醇在发育过程中产生的直接影响。这项研究可直接与人类相关联，因为斑马鱼与人类的发育遗传程序高度保守，因此有助于指导胎儿酒精谱系障碍（FASD）的人类研究24。尽管斑马鱼已被用于研究乙醇致畸作用，但在胚胎乙醇浓度报告方面缺乏统一标准，使得与人类的比较变得困难25。在哺乳动物系统中，血液酒精浓度与组织中的乙醇浓度直接相关26。许多斑马鱼研究在胚胎循环系统完全形成之前即进行处理，由于缺乏母体样本可供检测，因此需要一种评估乙醇浓度的方法来量化胚胎内的乙醇水平。本文中，我们描述了一种利用顶空气相色谱法测定发育中斑马鱼胚胎内乙醇浓度的方法。

<table><tbody><tr><td>空气</td><td></td><td></td><td>由合同提供给大学</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>自动进样器 CP-8400</td><td>Varian</td><td></td><td>气相色谱自动进样器</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料盖的2 mL气相色谱小瓶</td><td>Agilent</td><td>8010-0198</td><td>清洗后可重复使用小瓶，但盖子/隔垫不可重复使用</td></tr><tr><td>气相色谱仪 CP-3800</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氦气</td><td></td><td></td><td>由合同提供给大学</td></tr><tr><td>HP Innowax 毛细管柱</td><td>Agilent</td><td>19095N-123I</td><td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &amp;mu;m 膜厚</td></tr><tr><td>氢气</td><td></td><td></td><td>由合同提供给大学</td></tr><tr><td>硫酸镁（七水合物）</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682002</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 微量移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 微量移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 微量移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L 微量移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L 微量移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L 微量移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料盖</td><td>Agilent</td><td>5190-7021</td><td>气相色谱小瓶的替换盖/隔垫</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钾（二碱式）</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>VWR</td><td>97062-916</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 二氧化硅珠</td><td>Biospec Products</td><td>11079105z</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm 二氧化硅珠</td><td>Biospec Products</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠（二碱式）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>固相微萃取纤维组件 Carboxen/Polydimethylsiloxane</td><td>Millipore Sigma</td><td>57343-U</td><td>替换用纤维</td></tr><tr><td>Star 色谱工作站</td><td>Varian</td><td></td><td>色谱软件</td></tr><tr><td>Thermogreen 低流失（LB-2）隔垫</td><td>Millipore Sigma</td><td>23154</td><td>替换进样口隔垫</td></tr></tbody></table>

利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中的乙醇含量

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

胎儿酒精谱系障碍（FASD）描述了一类由乙醇引起的、表现高度可变的发育缺陷连续谱，包括面部畸形和神经功能损伤。由于其病理机制复杂，FASD每年影响约美国出生儿童中的1/100。鉴于FASD的高度异质性，动物模型在当前对乙醇诱导发育缺陷的机制理解中发挥了关键作用。越来越多的实验室开始采用斑马鱼来研究乙醇引起的发育异常。斑马鱼可产生大量体外受精、遗传背景可控且透明的胚胎，这使得研究人员能够在多种遗传背景下精确控制乙醇暴露的时间和剂量，并通过活体成像技术量化胚胎期乙醇暴露的影响。加之斑马鱼在遗传和发育过程上与人类具有高度保守性，使其成为研究乙醇致畸机制的有力模型。然而，不同斑马鱼研究中乙醇暴露方案存在差异，导致跨研究间的数据解释受到干扰。本文提供了一种利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇浓度的实验方案。

由于早期胚胎斑马鱼缺乏完全形成的循环系统，因此无法测定其血液乙醇水平。为了确定斑马鱼胚胎中的乙醇浓度，需直接从匀浆化的胚胎组织中测量乙醇含量。为了准确测定胚胎内的乙醇浓度，必须考虑胚胎体积。胚胎（连同卵黄）位于绒毛膜（卵壳）内，并被胚外液所包围（图1）。对胚胎体积的测量必须在暴露处理时进行，因为随着发育时间的推移和胚胎体积的增大，其体积会发生变化。此外，还需考虑胚胎的处理方式以及胚胎体积，因为这两个因素均会引入稀释效应，进而用于计算胚胎内的乙醇水平。
由于胚胎并非完美的球体，尤其是在10 hpf之后，因此采用排水法测定胚胎体积。本研究使用了24 hpf的胚胎，分别测量了带有卵膜的胚胎以及从卵膜中取出的胚胎的体积。带有胚外液的胚胎体积为1.97（± 0.4 SD）μL，而仅胚胎本身的体积为1.1（± 0.22 SD）μL（表1）。这两者之间的差值即为包围在卵膜内胚胎周围的胚外液的体积（图1）。这一差值对于确定样品中仅胚胎部分的乙醇浓...

本研究介绍了一种利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇含量的实验方案，内容涵盖从适当的暴露方法到胚胎处理及乙醇分析的全过程。

胎儿酒精谱系障碍（Fetal Alcohol Spectrum Disorders, FASD）描述了一类由乙醇引起的、表现高度可变的发育缺陷连续谱，包括面部畸形……

本方案具有重要意义，因为它有助于理解乙醇在发育中斑马鱼胚胎内的药代动力学，进而有助于标准化斑马鱼研究中的乙醇暴露方案。本技术的主要优势在于，它使研究人员能够快速且可重复地测定胚胎发育过程中乙醇的浓度水平，特别是在缺乏血液供应的胚胎中。只要具备适当的技术和设备设置，该方法也可轻松应用于其他模式系统以及其他环境因素的研究。初次进行该方案的研究人员可能会在操作速度上遇到困难，难以在胚胎处理过程中防止乙醇蒸发。首先，将10个带有额外胚外液的胚胎转移至已标记有250微升刻度线的1.5毫升微量离心管中。加水至刻度线处。为去壳样本准备额外的微量离心管。去除卵壳时，将胚胎置于含有胚胎培养基的100毫米培养皿中，加入终浓度为2毫克/毫升的蛋白酶混合液，孵育10分钟。每隔几分钟轻轻摇晃培养皿，以破坏卵壳。当所有胚胎完全脱去绒毛膜后，将其从蛋白酶混合液中取出，并用新鲜培养基清洗两次。然后将胚胎转移至一个新的100毫米培养皿中。当所有样品均准备好进行体积测量时，使用P200微量移液器并配以尽可能细小的吸头，小心吸除胚胎周围的全部液体。使用精度小于0.1毫克的天平称量水的重量，然后通过从250微升中减去移除水的重量来确定10个胚胎的体积。要计算单个胚胎的体积，将该差值除以10。从交配缸中收集胚胎，并将其放入标准的100毫米培养皿中，然后将培养皿置于28.5摄氏度下孵育。受精后6小时，将最多100个胚胎转移至含有胚胎培养液和1%乙醇或仅含培养液的新培养皿中。盖上皿盖但不要密封，并将培养皿置于28.5°C培养箱中孵育18小时，或直至胚胎达到受精后24小时。使用两支P200微量移液器，均设定为50微升，其中一支吸入蛋白酶混合溶液，另一支吸入水。然后用玻璃移液管迅速将10个胚胎放入一个1.5毫升的微量离心管中，并盖紧管盖。对所有待测样品、对照组以及乙醇处理的胚胎重复此步骤。每次处理一个样品，迅速打开管盖，用设定为200微升的P200微量移液器吸除所有残留的胚胎培养液。快速但轻柔地加入并吸出50微升水，然后加入50微升蛋白酶混合液并盖紧管盖。室温下静置样品10分钟，随后迅速加入450微升5摩尔氯化钠溶液并盖紧管盖。通过涡旋振荡10分钟使样品充分匀浆，然后转移2微升上清液至气相色谱小瓶中。用聚四氟乙烯盖密封小瓶。启动方法完成后，在分析软件的方法菜单中，为样品列表中的每个样品加载436当前SPME乙醇两到五分钟RG运行方法。首先填写样品列表，包括空气、水以及五摩尔氯化钠蛋白酶混合液的空白样。然后按从0.3125到40毫摩尔的顺序输入乙醇标准品。标准品之后接着输入第二轮空白样。将所有待测的匀浆胚胎上清液样品按照预期乙醇浓度从低到高依次输入，并以第三轮空白样品结束。将气相色谱小瓶按照样品输入的顺序加入自动进样器，使其预热10至15分钟，然后使用软件开始样品运行。所有运行完成后，通过在样品列表中添加最后一个样品并运行 standby.meth 方法来启动关闭程序。备份样品运行期间获取的所有数据。关闭程序完成后，单击打开色谱图，并打开包含结果的文件夹。该程序会自动对样品进行积分。在结果中，需确认已对正确的峰进行了积分。待所有样品均确认无误后，打印或导出结果。将乙醇标准品的峰高绘制在图表上，然后计算斜率、y轴截距和r²值。通过从标准品的y轴截距中减去样品的峰高，并将该值除以标准品的斜率，得到每个样品的乙醇值。为计算胚胎中的乙醇浓度，需计算每个样品的稀释倍数，并将样品乙醇值乘以该稀释倍数。最后，通过将培养基中的乙醇值乘以10的稀释因子来计算培养基参考样品。为了准确计算胚胎内的乙醇浓度，测量了胚胎在卵膜内以及从卵膜中取出后的体积。在此分析中，胚胎占卵膜内总体积的56%。根据先前发表的研究，所有展示的分析均采用73.6%作为胚胎含水量。这表明在1.1微升的胚胎体积中，水的体积为0.82微升。在总水量中，49%存在于胚胎体内，51%存在于胚外液体中。进行气相色谱分析时，共分析了两组各15个样品以及处理这些样品所用的培养基，每组测量五次。第一组和第二组的培养基乙醇浓度分别为143.6毫摩尔和133.6毫摩尔。两组胚胎中的乙醇浓度平均值分别为63.5毫摩尔和53.1毫摩尔。计算了每个样本的胚胎内乙醇浓度与培养基中乙醇水平的比值。第一组的胚胎乙醇浓度为培养基乙醇水平的44%，第二组为40%。未处理对照组胚胎的培养基乙醇浓度为零毫摩尔。进行此操作时最需要注意的是，胚胎的GC分析前处理至关重要，因为乙醇具有挥发性，会迅速蒸发。文中描述了执行此步骤的最佳方法，但需要通过练习来建立正确的肌肉记忆。该操作将有助于标准化斑马鱼中乙醇处理方案，并为后续研究解析乙醛致畸作用的遗传与细胞机制提供支持。

quantification-ethanol-levels-zebrafish-embryos-using-head-space-gas

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用头太空气色谱对斑马鱼胚胎中的乙醇水平进行定量

为了理解乙醇诱导的发育损伤的分子机制，我们建立了一种乙醇暴露的斑马鱼模型，并正在探索乙醇暴露后发生的物理、细胞和遗传改变1。随后，我们试图在此动物模型中寻找潜在的干预措施并快速对其进行测试。...

评估酒精暴露胎儿斑马鱼模型中的致畸变化

斑马鱼是一种强大的脊椎动物模型，在代谢研究中尚未得到充分利用。本文介绍了一种快速测量 体内...

斑马鱼胚胎代谢谱分析

本视频展示了使用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇浓度的方法。该方法为挥发性有机化合物的定性和定量分析提供了有效的工具。...

顶空气相色谱法：一种检测斑马鱼胚胎中乙醇浓度的技术

介绍了一种减少鱼类药物暴露过程中变异性的新方法。在明暗穿梭避暗实验中，暴露于不同乙醇暴露模式的鱼类在戒断期间表现出焦虑水平的改变。...

一种向多条斑马鱼（Danio rerio）给药的新方法及其戒断反应的量化

持续的纤维化伴随过量细胞外基质蛋白沉积可导致肝硬化。酒精滥用是严重肝病的主要病因之一。我们建立了一种乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型，用于研究酒精诱导损伤后促进肝细胞再生的机制与策略。...

建立乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型以研究前体细胞介导的肝细胞再生

本方案描述了对经2%乙醇处理24小时的斑马鱼幼鱼肝脏进行的组织学分析。这种急性乙醇处理会导致肝细胞脂肪变性和肝血管系统的肿胀。...

斑马鱼急性酒精性肝损伤的组织学分析

基因编辑技术使研究人员能够相对容易地构建斑马鱼突变体，以研究基因功能。本文提供了一种在斑马鱼中并行进行胚胎基因分型和原位杂交信号定量分析的方法指南。这种无偏倚的方法可提高基于原位杂交的表型分析的准确性。...

斑马鱼原位杂交染色的基因分型与定量分析

本文介绍了一种在完整斑马鱼胚胎中对正常和异常胞嘧啶甲基化进行快速、高效时空监测的实验方案。...

完整斑马鱼胚胎中正常与异常胞嘧啶甲基化的快速高效时空监测

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在斑马鱼中建立胎儿酒精谱系障碍模型以表征不良胚胎环境对成年社会行为的影响

本文介绍一种用于对齐和冷冻切片多个斑马鱼（Danio...

用于空间转录组学分析的斑马鱼幼虫切片的空间紧凑排列

我们开发了一种改进的QuEChERS-HPLC方法，用于检测斑马鱼胚胎内16种多环芳烃的含量水平。...

一种改良的QuEChERS-HPLC方法用于检测暴露于细颗粒物的斑马鱼胚胎中多环芳烃

学习使用顶空气相色谱法定量斑马鱼胚胎中的乙醇水平，以研究乙醇药代动力学。该方法可快速、可重复地测量发育中的胚胎乙醇浓度，有助于标准化乙醇暴露方案。

利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中的乙醇含量

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