活体功能性小鼠耳蜗毛细胞中葡聚糖的标记与摄取

本实验方案的总体目标是研究在具有功能性机械转导通道的活体毛细胞中，用德克萨斯红荧光标记的普通葡聚糖的摄取情况。该技术的主要优势在于，三千道尔顿的德克萨斯红葡聚糖可用于评估活体毛细胞中机械转导通道的功能。为获取耳蜗，将出生后第六天小鼠的颅骨置于含有Leibovitz's L-15培养基的60毫米培养皿中，使用手术剪从颅骨前端至后端做一浅表切口，并横跨外耳道进行切割。

将皮肤向鼻部折叠以暴露颅骨，从头骨后部向前部做一切口，并横跨眼线。将颅骨分离成两半，用小刮勺取出脑组织。当观察到颞骨时，使用小剪刀在这些骨周围剪切，以切除组织。

将颞骨浸入含有新鲜L-15培养基的35毫米培养皿中，并将培养皿置于配备广视野目镜和外部交流卤素光源的体视显微镜下。使用镊子去除周围的耳蜗组织、半规管和前庭器官。待耳蜗解剖完成后，将其转移至另一含有新鲜L-15培养基的培养皿中，再用外科镊子在圆窗处制造一个穿刺伤口，并在耳蜗顶端区域进行另一个穿刺。

当所有耳蜗采集完毕后，将组织放入含有 200 微升新鲜 L-15 培养基的九孔玻璃凹孔板的一个孔中。对分离的组织进行右旋糖酐标记时，将每孔样品中的培养基更换为 200 微升新鲜 L-15 培养基，其中添加终浓度为每毫升 2 毫克的荧光标记右旋糖酐。将样品置于避光条件下，在 25 摄氏度、每分钟 25 转、倾斜角度为 25 度的三维摇床中孵育 2 小时。

孵育结束后，先用培养基洗涤组织一次，再用HBSS洗涤一次，每次洗涤持续两分钟。第二次洗涤后，在室温下用4%多聚甲醛固定样本30分钟，随后用HBSS快速轻柔地洗涤两次。第二次洗涤后，使用尖头镊子去除耳蜗骨、螺旋韧带和盖膜，并将分离出的柯蒂氏器在HBSS中洗涤。

在去除透明的盖膜时需格外小心，因为此步骤中毛细胞上的组织容易受损。为标记F-肌动蛋白，将样品置于含0.5% Triton X-100的PBS中，并加入100至200倍稀释的荧光标记鬼笔环肽，在室温避光条件下透化处理30分钟。孵育结束后，用新鲜的HBSS洗涤组织两到三次，每次洗涤如图所示操作，最后再用PBS洗涤一次。

使用适当的封片介质将耳蜗柯蒂氏器组织切片放置在载玻片上，确保毛细胞静纤毛朝上，然后在共聚焦荧光显微镜下使用63倍油镜观察样品。经过两小时与Texas Red荧光标记的3千道尔顿葡聚糖共同孵育后，野生型出生后第6天小鼠的柯蒂氏器外植体显示出内毛细胞和外毛细胞均具有强烈且特异性的标记。对毛细胞静纤毛及胞体的成像结果显示，只有那些在胞体内摄入了3千道尔顿Texas Red葡聚糖的细胞，其静纤毛才表现出荧光标记。

重要的是，在静纤毛上可观察到均匀的荧光信号，且在较短排静纤毛的顶端富集，该位置正是机械转导通道所在之处。在毛细胞的胞体以及邻近支持细胞中也观察到类似囊泡的结构，提示德克萨斯红葡聚糖亦可通过内吞作用被摄取。较大的10千道尔顿葡聚糖在毛细胞和支持细胞的胞体中同样产生类似囊泡的分布模式。

值得注意的是，钙螯合剂或机械转导通道阻断剂的存在会阻止毛细胞中静纤毛的标记以及3千道尔顿德克萨斯红葡聚糖的摄取。然而，在机械转导通道被阻断的情况下，仍可观察到囊泡样摄取模式，表明该摄取模式与功能性机械电换能（MET）通道无关。在将组织用于成像前，必须仔细解剖耳蜗柯蒂氏器组织，并确认毛细胞的正确朝向。

在对活体且具有功能的毛细胞进行葡聚糖标记后，可对固定组织进行免疫染色，以鉴定特定细胞类型或目的蛋白。