临床试验现场单次采血制备外周血单个核细胞团块及血浆用于生物标志物分析

PBMC 和血浆样本易于获取，并且在早期临床开发中具有很高的信息价值。本稳健的方案可最大限度地减少在临床现场引入的分析前变异。该方案快速简便，仅需基本的实验室设备和较少的操作人员技术即可完成血液向 PBMC 和血浆的处理。

该方法适用于医院繁忙的实验日程。通过本方案获得的血液成分可用于后续分析，以阐明药物的药代动力学与药效动力学关系、药物给药方案以及靶点结合的证据，同时有助于揭示药物的作用机制，支持实时分析与回顾性分析。我们已将该方案应用于肿瘤学研究，特别是用于分析DNA损伤应答机制。

然而，通过本方案收集的材料可能与多种疾病领域和多种治疗方式相关。每份样本收到八毫升供体血液后，记录采血时间，并在将抗凝处理的血液样本转移至标有辐射处理的各试管之前，轻轻倒置试管8到10次。对于临床样本，倒置后应立即离心试管。

将0.2戈瑞的试管放入预热的X射线辐照柜中，关闭柜门，对试管施加0.2戈瑞的辐射剂量。将低剂量辐照的试管替换为7戈瑞的试管，并调整剂量，对高剂量辐照样本施加7戈瑞的辐射剂量。两个样本完成辐照后，将全部三支试管在37摄氏度下孵育1小时。

将样本转移至细胞制备管中，然后通过高速离心分离细胞，确保将离心机单位设置为 ×g 或等效的相对离心力（RCF）。离心结束后，将离心管置于深色背景前观察，以识别血浆层、红细胞层和白膜层。使用血清学移液管，将约一半的血浆转移至已标记的15毫升锥形离心管中，注意不要扰动白膜层，并将血浆管置于湿冰上保存。

然后，使用巴氏吸管将含有 PBMC 的絮状层完全转移至新的 15 毫升离心管中，并加入室温 PBS 至每份样品终体积为 15 毫升。轻轻颠倒混匀 5 次，通过离心以较低速度收集细胞，注意确认离心机的单位设置。离心后，吸除上清液，仅保留最后 500 微升，避免扰动细胞沉淀。

向每管中加入新鲜 PBS，使最终体积达到 10 毫升，并通过轻轻倒置试管重悬细胞。取 40 微升细胞悬液用于计数。计数后，再次离心收集细胞，并尽可能吸除上清液，注意不要扰动沉淀。

为后续处理而保存PBMC时，需将沉淀物用新鲜PBS重悬，每份样本加入50 µL，轻轻吹打混匀，然后将全部细胞悬液转移至预先标记好的1.5 mL冻存管中，置于湿冰上。随后采用首选方法迅速冷冻细胞，并将冻存管放入-80 °C的冻存盒中。记录细胞冷冻的时间。

或者，将沉淀物重悬于每份样品一毫升的冷冻混合液中，并将细胞悬液转移至预先标记的冻存管中。随后将冻存管放入预冷的冻存盒中，于负80摄氏度保存。为冷冻血浆，将血浆以每份不超过一毫升的等分试样分别加入最多五个2毫升微量离心管中，注意避免扰动残留的沉淀物，并记录每管中血浆的总体积。

然后，立即将血浆分装样品在-80摄氏度冰箱中以直立方向速冻。用于样品的Western blot分析时，根据细胞沉淀体积，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的适量裂解缓冲液，通过轻柔吹打重悬各管中的沉淀，并将细胞样品在冰上孵育10分钟。孵育结束后，将样品转移至1.5毫升离心管中，在4摄氏度条件下进行超声处理，程序为3个循环，每个循环开启30秒、关闭30秒。

通过离心收集样品，并将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。然后，将每份样品各40微克与上样缓冲液混合，煮沸样品5分钟。每条泳道上样20微克，每个样品重复上样，在4–12% Bis-Tris蛋白凝胶中进行SDS-PAGE电泳。

从八毫升血液中获得的细胞数量因患者和疾病情况而异。通常，细胞沉淀体积较小，呈透明白色。有时沉淀物可能含有少量红细胞污染，这会对制备质量产生不利影响。

采用本方案从慢性淋巴细胞白血病患者样本中获得的典型产量为每8毫升单个核细胞制备物中含有1.62 × 10⁴至1.99 × 10⁹个细胞，最终蛋白浓度范围为1.62至19.77毫克/毫升。在对三名患者样本的代表性分析中，观察到随着电离辐射剂量的增加，翻译后修饰水平上升。有趣的是，在0.2戈瑞的低剂量辐射下，共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated）和RAD50的磷酸化水平已显著升高，这表明这些翻译后修饰在肿瘤及外周血样本中具有良好的动态范围，有望作为涉及DNA双链断裂的治疗方案的药效动力学生物标志物进行有效检测。

为获得最佳的样本制备效果，应在室温下于采集后一小时内处理血液，正确离心样本，并将试管置于深色背景前观察，以便能够分辨出白膜层。